Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale

Résumé

Une approche vaisseau-fenêtre ouverte utilisant des traceurs fluorescents fournit une résolution suffisante pour la mesure du débit sanguin cochléaire (CoBF). La méthode facilite l’étude des changements structurels et fonctionnels du CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques.

Résumé

La transduction du son est métaboliquement exigeante, et la fonction normale de la microvascularisation dans la paroi latérale est essentielle pour maintenir le potentiel endocochléaire, le transport des ions et l’équilibre des fluides. Différentes formes de troubles auditifs impliqueraient une microcirculation anormale dans la cochlée. L’étude de la façon dont la pathologie du flux sanguin cochléaire (CoBF) affecte la fonction auditive est difficile en raison du manque de méthodes d’interrogatoire réalisables et de la difficulté d’accès à l’oreille interne. Une fenêtre vasculaire ouverte dans la paroi cochléaire latérale, combinée à la microscopie intravitale à fluorescence, a été utilisée pour étudier les changements de CoBF in vivo, mais surtout chez le cobaye et récemment chez la souris. Cet article et la vidéo associée décrivent la méthode de fenêtre de vaisseau ouvert pour visualiser le flux sanguin dans la cochlée de souris. Les détails comprennent 1) la préparation de la suspension de cellules sanguines marquées par fluorescence provenant de souris; 2) construction d’une fenêtre vasculaire ouverte pour la microscopie intravitale chez une souris anesthésiée, et 3) mesure de la vitesse et du volume du flux sanguin à l’aide d’un enregistrement hors ligne de l’imagerie. La méthode est présentée sous forme vidéo pour montrer comment utiliser l’approche de la fenêtre ouverte chez la souris pour étudier les changements structurels et fonctionnels dans la microcirculation cochléaire dans des conditions normales et pathologiques.

Introduction

La fonction normale de la microcirculation dans la paroi cochléaire latérale (comprenant la majorité des capillaires du ligament spiralé et de la strie vasculaire) est d’une importance cruciale pour le maintien de la fonction auditive¹. La CoBF anormale est impliquée dans la physiopathologie de nombreux troubles de l’oreille interne, y compris la perte auditive induite par le bruit, l’hydrops de l’oreille et la presbyacousie 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualisation du CoBF intravital permettra de mieux comprendre les liens entre la fonction auditive et la pathologie vasculaire cochléaire.

Bien que la complexité et l’emplacement de la cochlée dans l’os temporal empêchent la visualisation et la mesure directes du CoBF, diverses méthodes ont été développées pour l’évaluation du CoBF, notamment la débitmétrie laser-Doppler (LDF)10,11,12, l’imagerie par résonance magnétique (IRM)¹³, la microscopie intravitale à fluorescence (FIVM)14, la microendoscopie à fluorescence (FME)15^, l’imagerie endoscopique par contraste de moucheture laser (LSCI)¹⁶ , et des approches basées sur l’injection de marqueurs marqués et de microsphères marquées radioactivement dans la circulation sanguine (microangiographie optique, OMAG)^17,18,19,20. Cependant, aucune de ces méthodes n’a permis un suivi absolu en temps réel des changements dans le CoBF in vivo, à l’exception du FIVM. FIVM, en combinaison avec une fenêtre vasculaire dans la paroi cochléaire latérale, est une approche qui a été utilisée et validée chez le cobaye dans différentes conditions expérimentales par divers laboratoires^14,21,22.

Une méthode FIVM a été établie avec succès pour étudier les changements structurels et fonctionnels de la microcirculation cochléaire chez la souris en utilisant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme produit de contraste et un colorant de fluorescence - DiO (perchlorate de 3, 3′-dioctadécyloxacarbocyanine, vert) ou Dil (perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindocarbocyanine, rouge) - pour prémarquer les cellules sanguines, visualiser les vaisseaux et suivre la vitesse du flux sanguin. Dans la présente étude, le protocole de cette méthode a été décrit pour l’imagerie et la quantification des changements dans le CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques (comme après une exposition au bruit). Cette technique donne au chercheur les outils nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents du CoBF liés au dysfonctionnement auditif et à la pathologie de la strie vasculaire, en particulier lorsqu’il est appliqué en conjonction avec des modèles murins transgéniques facilement disponibles.

Protocole

REMARQUE: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oregon Health & Science University (numéro d’approbation IACUC : TR01_IP00000968).

1. Préparation des cellules sanguines marquées par fluorescence

1. Anesthésier les souris donneuses (souris mâles C57BL/6J âgées de ~6 semaines) avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de solution anesthésique de kétamine/xylazine (5 mL/kg, voir le tableau des matières).
   REMARQUE: Ce protocole d’anesthésie est très fiable et maintient la pression artérielle systémique.
2. Posez la souris sur le dos, ouvrez la peau et exposez la cavité thoracique à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux à disséquer. Coupez le diaphragme, saisissez la base du sternum à l’aide de ciseaux à pince, coupez à travers la cage thoracique et soulevez pour exposer le cœur. Prélever 1 mL de sang dans l’héparine (15 UI/mL de sang) par ponction cardiaque et centrifuger à 3 000 × g pendant 3 min à 4 °C. Euthanasier la souris par luxation cervicale après prélèvement sanguin.
3. Retirer le plasma, laver la pastille de cellules sanguines avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et centrifuger 3x à 3000 × g pendant 3 min à 4 °C.
4. Étiqueter les cellules sanguines avec 1 mL de 20 mM DiO ou Dil dans PBS, et incuber dans l’obscurité pendant 30 min à température^{ambiante 23,24}.
5. Centrifuger et laver les cellules sanguines marquées avec 1 mL de PBS, centrifuger 3x à 3000 × g pendant 3 min à 4 °C, et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 30% d’hématocrite avec ~0,9 mL de PBS (volume final ~1,3 mL) avant l’injection.

2. Chirurgie pour créer une fenêtre ouverte ²⁵

1. Préparez les instruments chirurgicaux stériles et la plateforme d’imagerie, et placez un coussin chauffant sous le champ (figure 1A). Anesthésiez les souris (souris mâles C57BL/6J âgées de ~6 semaines) comme décrit à l’étape 1.1, et vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le réflexe de la patte et le tonus musculaire général. Placez l’animal sur le coussin chauffant chaud et maintenez la température rectale à 37 °C.
2. Placez la queue de l’animal dans le système de surveillance CODATM pour surveiller la pression artérielle et le rythme cardiaque (voir le tableau des matériaux). Notez la pression artérielle systolique, la pression artérielle diastolique et la pression artérielle moyenne (MBP) de l’animal dans l’état anesthésié.
   REMARQUE : Aucune différence n’est observée chez les animaux à l’état anesthésié et non anesthésié (107 ± 11 mmHg contre 97 ± 7 mmHg). La fréquence cardiaque de l’animal est stable sous anesthésie, bien que plus faible (toujours dans la plage normale) que dans l’état non anesthésié (357 ± 12 bmp contre 709 ± 3 bmp). Il faut s’attendre à une légère augmentation du rythme cardiaque chez les animaux placés en contention²⁶.
3. Ouvrez la bulle tympanique gauche par une approche latérale et ventrale au stéréomicroscope (voir le tableau des matériaux), en laissant la membrane tympanique et les osselets intacts²¹.
   1. Faites une incision le long de la ligne médiane du cou de l’animal avec sa tête immobilisée et positionnée de manière à minimiser les mouvements (figure 1B). Retirez la glande sous-maxillaire gauche et le ventre postérieur du muscle digastrique et cautériser.
      REMARQUE: Injecter par voie sous-cutanée de la buprénorphine à 0,05 mg / kg pour réduire la douleur pendant la chirurgie.
   2. Localisez et exposez la bulle osseuse en identifiant le muscle sternocléidomastoïdien et le nerf facial s’étendant antérieurement vers la bulle.
   3. Ouvrez la bulle osseuse à l’aide d’une aiguille de 30 G et retirez délicatement l’os environnant à l’aide d’une pince chirurgicale pour offrir une vue dégagée de la cochlée et de l’artère stapédienne, avec sa marge médiale située sur le bord de la niche ronde de la fenêtre et se dirigeant antérieurement supérieur vers la fenêtre ovale (figure 1C, D).
      REMARQUE: La trachéotomie est effectuée pour garder les voies respiratoires dégagées et ne doit être effectuée que lorsque l’animal a un problème respiratoire pendant la chirurgie. En général, la plupart des animaux sous anesthésie ont une respiration douce. Cependant, si les animaux ont subi une trachéotomie pendant la chirurgie, le débit sanguin enregistré ne doit pas être utilisé pour toute comparaison.
4. Utilisez une petite lame de couteau (scalpel #16 fraisé sur mesure) pour gratter l’os de la paroi latérale au sommet médian de la cochlée de souris, à environ 1,25 mm de l’apex jusqu’à ce qu’une fine tache soit fissurée. Retirez les éclats osseux à l’aide de petits crochets métalliques (figure 1E).
5. Couvrir la fenêtre du récipient avec une lamelle de couverture coupée pour préserver les conditions physiologiques normales et fournir une vue optique pour l’enregistrement des images du navire.
   REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées avec prudence. En plus de surveiller la température corporelle, les signes vitaux de l’animal, y compris la pression artérielle et le rythme cardiaque, doivent également être surveillés tout au long de la chirurgie.

3. Imagerie du CoBF sous FIVM

1. Faites une incision de ~1 cm le long de la veine saphène droite pour exposer le vaisseau (Figure 1F).
2. Injecter successivement dans l’animal 100 μL de la solution FITC-dextran (2000 kDa, 40 mg/mL dans PBS) et 100 μL d’une suspension de cellules sanguines (hématocrite à 30 %) dans l’animal par la veine saphène (Figure 1G) pour permettre la visualisation des vaisseaux sanguins et le suivi de la vitesse du flux sanguin.
3. Observez le flux sanguin en temps réel directement sur un moniteur vidéo 5 min après l’injection. Imagez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif à longue distance de travail (L.D. 30,5 mm, 10x, ouverture numérique 0,26) et d’un boîtier de lampe contenant un filtre d’excitation à bandes multiples et un filtre d’émission compatible (Tableau des matériaux). Enregistrez la vidéo à l’aide d’une caméra numérique haute résolution noir et blanc à couplage de charge (Table of Materials) à 2 images/s). Obtenez plus de 350 images par vidéo pour assurer une analyse réussie de la vitesse d’écoulement.
   REMARQUE: Les vaisseaux sanguins du ligament spiralé et de la strie vasculaire peuvent être imagés en ajustant le foyer optique (vidéo supplémentaire 1).

4. Analyse vidéo

1. Mesurez le diamètre du récipient à l’aide d’un logiciel approprié (Tableau des matériaux) et déterminez la distance entre deux points fixes à travers le récipient dans les images acquises.
2. Calculez la vitesse du flux sanguin à partir d’images vidéo capturées en traçant le mouvement des cellules sanguines marquées dans la distance spatiale entre les emplacements des images²⁷.
   1. Ouvrez la vidéo du flux sanguin dans le logiciel (Fiji [ImageJ] a été utilisé dans ce protocole) et définissez l’échelle des images.
   2. Suivez les cellules sanguines colorées DiO sélectionnées à l’aide de la fonction de suivi. Utilisez la distance parcourue par les cellules et l’intervalle de temps entre les images de la vidéo pour calculer automatiquement la vitesse d’écoulement.
3. Calculer le débit volumétrique (F) selon l’équation suivante : F = V × A. (V : vitesse ; A : section transversale du navire).

5. Exposition au bruit

1. Placez les animaux dans des cages en treillis métallique. Exposez-les à un bruit à large bande à un niveau de pression acoustique de 120 dB dans une cabine d’exposition acoustique pendant 3 h et pendant 3 heures supplémentaires le lendemain.
   NOTE: Ce régime d’exposition au bruit, couramment utilisé dans ce laboratoire, produit une perte permanente de sensibilité cochléaire²⁸.

Résultats

Après exposition chirurgicale des capillaires cochléaires de la paroi latérale (Figure 1), l’observation microscopique par fluorescence intravitale à haute résolution de cellules sanguines marquées par Dil dans des vaisseaux marqués FITC-dexton a été possible à travers une fenêtre vasculaire ouverte. La figure 2A est une image représentative prise sous FIVM qui montre les capillaires de la paroi latérale apex cochl...

Discussion

Cet article démontre comment les capillaires dans la paroi latérale cochléaire (et dans la strie vasculaire) d’un modèle murin peuvent être visualisés avec le marquage fluorophore dans une préparation vaisseau-fenêtre ouverte sous un système FIVM. Le modèle murin est largement utilisé et préféré comme modèle de mammifère pour étudier la santé et les maladies humaines. Le protocole décrit ici est une approche réalisable pour l’imagerie et l’étude du CoBF dans la paroi latérale de la souris (en ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope