Измерение стойлового кровотока у улитки мыши с использованием открытого сосудистого окна и прижизненной флуоресцентной микроскопии

Резюме

Подход с открытым окном сосудов с использованием флуоресцентных индикаторов обеспечивает достаточное разрешение для измерения кохлеарного кровотока (CoBF). Метод облегчает изучение структурно-функциональных изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях.

Аннотация

Трансдукция звука метаболически требовательна, и нормальная функция микроциркуляторного русла в боковой стенке имеет решающее значение для поддержания эндокохлеарного потенциала, транспорта ионов и баланса жидкости. Сообщается, что различные формы нарушений слуха связаны с аномальной микроциркуляцией в улитке. Исследование того, как патология кохлеарного кровотока (CoBF) влияет на функцию слуха, является сложной задачей из-за отсутствия осуществимых методов опроса и трудностей с доступом к внутреннему уху. Открытое сосудистое окно в боковой кохлеарной стенке в сочетании с флуоресцентной прижизненной микроскопией использовалось для изучения изменений CoBF in vivo, но в основном у морских свинок и только недавно у мыши. В этой статье и связанном с ней видео описывается метод визуализации кровотока в улитке мыши. Детали включают 1) приготовление флуоресцентно меченой суспензии клеток крови от мышей; 2) строительство открытого сосуда-окна для прижизненной микроскопии у анестезируемой мыши и 3) измерение скорости и объема кровотока с помощью автономной записи изображения. Метод представлен в видеоформате, чтобы показать, как использовать подход с открытым окном у мышей для исследования структурных и функциональных изменений в кохлеарной микроциркуляции в нормальных и патологических условиях.

Введение

Нормальная функция микроциркуляции в боковой кохлеарной стенке (включающей большинство капилляров в спиральной связке и stria vascularis) критически важна для поддержания слуховой функции¹. Аномальный CoBF участвует в патофизиологии многих заболеваний внутреннего уха, включая потерю слуха, вызванную шумом, ушную водянку и пресбикусис ^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Визуализация прижизненного CoBF позволит лучше понять связи между функцией слуха и кохлеарной сосудистой патологией.

Хотя сложность и расположение улитки в височной кости исключает прямую визуализацию и измерение CoBF, для оценки CoBF были разработаны различные методы, включая лазерно-допплеровскую флоуметрию (LDF)^10,11,12, магнитно-резонансную томографию (МРТ)¹³, флуоресцентную прижизненную микроскопию (FIVM)¹⁴, флуоресцентную микроэндоскопию (FME)¹⁵, эндоскопическую лазерную спекл-контрастную визуализацию (LSCI)¹⁶ , и подходы, основанные на введении меченых маркеров и радиоактивно меченых микросфер в кровоток (оптическая микроангиография, OMAG)17,18,19,20. Однако ни один из этих методов не позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения в CoBF in vivo, за исключением FIVM. FIVM, в сочетании с сосудом-окном в боковой кохлеарной стенке, является подходом, который был использован и проверен на морской свинке в различных экспериментальных условиях различными лабораториями 14,21,22.

Был успешно разработан метод FIVM для изучения структурно-функциональных изменений кохлеарной микроциркуляции у мышей с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана в качестве контрастного вещества и флуоресцентного красителя - либо DiO (3, 3'-диоктацилоксакарбоцианин перхлорат, зеленый) или Dil (1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндокарбоциан перхлорат, красный) - для предварительной маркировки клеток крови, визуализации сосудов и отслеживания скорости кровотока. В настоящем исследовании протокол этого метода был описан для визуализации и количественной оценки изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях (например, после воздействия шума). Этот метод дает исследователю инструменты, необходимые для изучения основных механизмов CoBF, связанных с дисфункцией слуха и патологией в стриях васкулярных мышц, особенно при применении в сочетании с легкодоступными трансгенными моделями мышей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не связанная с выживанием. Все процедуры, связанные с использованием животных, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Орегонском университете здравоохранения и науки (номер одобрения IACUC: TR01_IP00000968).

1. Получение флуоресцентных меченых клеток крови

1. Обезболить мышей-доноров (самцов мышей C57BL/6J в возрасте ~6 недель) внутрибрюшинной (т..) инъекцией раствора анестетика кетамина/ксилазина (5 мл/кг, см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол анестезии очень надежен и поддерживает системное кровяное давление.
2. Уложите мышь на спину, откройте кожу и обнажите грудную полость с помощью пинцета и рассекающих ножниц. Разрежьте диафрагму, захватите у основания грудины ножницами-зажимами, прорежьте грудную клетку и поднимите, чтобы обнажить сердце. Собрать 1 мл крови в гепарине (15 МЕ/мл крови) путем пункции сердца и центрифугу при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C. Усыпить мышь при вывихе шейки матки после забора крови.
3. Удалить плазму, промыть гранулу клеток крови 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и центрифугу 3x при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C.
4. Маркируют клетки крови 1 мл 20 мМ DiO или Dil в PBS и инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре^23,24.
5. Центрифугируют и промывают меченые клетки крови 1 мл PBS, центрифугу 3x при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C и повторно суспендируют клеточную гранулу в 30% гематокрите с ~0,9 мл PBS (конечный объем ~1,3 мл) перед инъекцией.

2. Операция по созданию открытого окна ²⁵

1. Подготовьте стерильные хирургические инструменты и платформу для визуализации и поместите грелку под драпировку (рисунок 1A). Обезболивают мышей (самцов мышей C57BL/6J в возрасте ~ 6 недель), как описано в шаге 1.1, и проверяют глубину анестезии, контролируя рефлекс лапы и общий мышечный тонус. Поместите животное на теплую грелку и поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 °C.
2. Поместите хвост животного в систему мониторинга CODATM для мониторинга артериального давления и сердцебиения (см. Таблицу материалов). Запишите систолическое артериальное давление животного, диастолическое артериальное давление и среднее кровяное давление (MBP) в анестезированном состоянии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не наблюдается различий в MBP животных в обезболенном и неанестезированном состоянии (107 ± 11 мм рт.ст. против 97 ± 7 мм рт.ст.). Частота сердечных сокращений животных стабильна при анестезии, хотя и ниже (все еще в пределах нормального диапазона), чем в безанестезном состоянии (357 ± 12 бмп против 709 ± 3 бмп). Следует ожидать незначительного увеличения сердцебиения у животных, помещенных в удерживающее устройство²⁶.
3. Откройте левую барабанную перепонку с помощью бокового и вентрального подхода под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов), оставив барабанную перепонку и косточки нетронутыми²¹.
   1. Сделайте разрез вдоль средней линии шеи животного с обездвиженной головой и положением, чтобы свести к минимуму движение (рисунок 1B). Удаляют левую подчелюстную железу и задний живот дигастральной мышцы и прижигают.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подкожно вводят бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг для уменьшения боли во время операции.
   2. Найдите и обнажите костную буллу, идентифицируя грудино-ключично-сосцевидную мышцу и лицевой нерв, простирающийся спереди к булле.
   3. Откройте костную буллу иглой 30 G и осторожно удалите окружающую кость хирургическим пинцетом, чтобы обеспечить четкое представление о улитке и стапедиальной артерии, с ее медиальным краем, лежащим над краем круглой оконной ниши, и курсирующим передним-верхним к овальному окну (рисунок 1C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трахеотомия выполняется, чтобы держать дыхательные пути беспрепятственными и должна выполняться только тогда, когда у животного есть проблемы с дыханием во время операции. В целом, большинство животных под наркозом имеют гладкое дыхание. Однако, если животные получили трахеотомию во время операции, зарегистрированный кровоток не следует использовать для какого-либо сравнения.
4. Используйте небольшое лезвие ножа (специально фрезерованный скальпель No 16), чтобы соскоблить кость боковой стенки на вершинно-среднем повороте улитки мыши, примерно в 1,25 мм от вершины, пока не треснет тонкое пятно. Удалите костные стружки с помощью небольших проволочных крючков (рисунок 1E).
5. Накройте сосуд-окно разрезанным чехлом для сохранения нормальных физиологических условий и обеспечения оптического обзора для записи изображений сосудов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться с осторожностью. В дополнение к мониторингу температуры тела, жизненно важные показатели животного, включая кровяное давление и сердцебиение, также должны контролироваться на протяжении всей операции.

3. Визуализация CoBF под FIVM

1. Сделайте разрез ~1 см вдоль правой подкожной вены, чтобы обнажить сосуд (рисунок 1F).
2. Вливать 100 мкл раствора FITC-декстрана (2000 кДа, 40 мг/мл в PBS) и 100 мкл суспензии клеток крови (30% гематокрит) последовательно в животное через подкожную вену (рисунок 1G), чтобы обеспечить визуализацию кровеносных сосудов и отслеживание скорости кровотока.
3. Наблюдайте за кровотоком в режиме реального времени непосредственно на видеомониторе через 5 мин после инъекции. Изобразите кровеносные сосуды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом с большим рабочим расстоянием (W.D.) (W.D. 30,5 мм, 10x, числовая апертура 0,26) и корпусом лампы, содержащим многополосный фильтр возбуждения и совместимый эмиссионный фильтр (Таблица материалов). Записывайте видео с помощью цифровой черно-белой камеры с зарядовой связью высокого разрешения (Таблица материалов) со скоростью 2 кадра/с). Получайте более 350 изображений на видео, чтобы обеспечить успешный анализ скорости потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровеносные сосуды как спиральной связки, так и сосудистой полосы могут быть визуализированы путем настройки оптического фокуса (Дополнительное видео 1).

4. Анализ видео

1. Измерьте диаметр сосуда с помощью соответствующего программного обеспечения (Таблица материалов) и определите расстояние между двумя фиксированными точками по всему сосуду на полученных изображениях.
2. Рассчитайте скорость кровотока из захваченных видеокадров, отслеживая движение меченых клеток крови на пространственном расстоянии между местами изображения²⁷.
   1. Откройте видео кровотока в программном обеспечении (в этом протоколе использовался Fiji [ImageJ] и установите масштаб изображений.
   2. Отслеживайте выбранные DiO-окрашенные клетки крови с помощью функции отслеживания. Используйте расстояние, пройденное ячейками, и интервал времени между кадрами изображения в видео для автоматического расчета скорости потока.
3. Рассчитайте объемный поток (F) по следующему уравнению: F = V × A. (V: скорость; A: площадь поперечного сечения судна).

5. Воздействие шума

1. Поместите животных в клетки из проволочной сетки. Подвергайте их широкополосному шуму при уровне звукового давления 120 дБ в кабине звуковой экспозиции в течение 3 ч и еще 3 ч на следующий день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот режим воздействия шума, обычно используемый в этой лаборатории, приводит к постоянной потере кохлеарной чувствительности²⁸.

Результаты

После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке (рисунок 1) прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за dil-мечеными клетками крови в меченых FITC-декстраном сосудах было возможно через открытое сосудистое окно.

Обсуждение

В данной работе показано, как капилляры в кохлеарной боковой стенке (и в stria vascularis) мышиной модели могут быть визуализированы с помощью флуорофорной маркировки в препарате с открытым сосудом-окном в системе FIVM. Мышиная модель широко используется и предпочтительна в качестве модели млек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope