מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

Summary

גישה של חלון כלי דם פתוח באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים מספקת רזולוציה מספקת למדידת זרימת דם שבלולית (CoBF). השיטה מאפשרת לחקור שינויים מבניים ותפקודיים ב- CoBF בעכבר בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Abstract

התמרת קול היא תובענית מבחינה מטבולית, והתפקוד התקין של המיקרו-ווסקולטורה בדופן הצידית הוא קריטי לשמירה על הפוטנציאל האנדו-שבלולי, הובלת יונים ומאזן נוזלים. דווח כי צורות שונות של הפרעות שמיעה מערבות מיקרו-סירקולציה לא תקינה בשבלול. חקירת האופן שבו פתולוגיה של זרימת הדם השבלולית (CoBF) משפיעה על תפקוד השמיעה היא מאתגרת בשל היעדר שיטות חקירה אפשריות והקושי בגישה לאוזן הפנימית. חלון כלי פתוח בדופן השבלול הצדדית, בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית, שימש לחקר שינויי CoBF in vivo, אך בעיקר בחזירי ים ורק לאחרונה בעכבר. מאמר זה והסרטון הנלווה אליו מתארים את שיטת חלון כלי הדם הפתוח להמחשת זרימת הדם בשבלול העכבר. הפרטים כוללים 1) הכנת תרחיף תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט מעכברים; 2) בניית חלון כלי פתוח למיקרוסקופיה תוך-חיונית בעכבר מורדם, ו-3) מדידת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות הקלטה לא מקוונת של ההדמיה. השיטה מוצגת בפורמט וידאו כדי להראות כיצד להשתמש בגישת החלון הפתוח בעכבר כדי לחקור שינויים מבניים ותפקודיים במיקרו-סירקולציה של השבלול בתנאים רגילים ופתולוגיים.

Introduction

תפקוד תקין של המיקרו-סירקולציה בדופן השבלול הלטרלי (המהווה את רוב הנימים ברצועה הספירלית ובסטריה וסקולריס) חשוב ביותר לשמירה על תפקוד השמיעה¹. CoBF לא תקין מעורב בפתופיזיולוגיה של הפרעות רבות באוזן הפנימית, כולל אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש, הידרופס באוזן ופרסביקוזיס 2,3,4,5,6,7,8,9^. הדמיה של CoBF תוך-חיוני תאפשר הבנה טובה יותר של הקשרים בין תפקוד השמיעה לפתולוגיה של כלי הדם בשבלול.

למרות שהמורכבות והמיקום של השבלול בתוך העצם הטמפורלית מונעים הדמיה ומדידה ישירה של CoBF, פותחו שיטות שונות להערכת CoBF, כולל זרימת לייזר-דופלר (LDF)10,11,12, הדמיית תהודה מגנטית (MRI)13, מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית (FIVM)14, מיקרואנדוסקופיה פלואורסצנטית (FME)15^, הדמיית ניגודיות של כתמי לייזר אנדוסקופיים (LSCI)¹⁶ וגישות המבוססות על הזרקת סמנים מסומנים ומיקרוספרות מתויגות רדיואקטיבית לזרם הדם (מיקרואנגיוגרפיה אופטית, OMAG)^17,18,19,20.^, עם זאת, אף אחת משיטות אלה לא אפשרה מעקב מוחלט בזמן אמת אחר שינויים ב- CoBF in vivo, למעט FIVM. FIVM, בשילוב עם חלון כלי בדופן השבלול הצדדית, היא גישה שנעשה בה שימוש ואומתה בחזירי ים בתנאי ניסוי שונים על ידי מעבדות שונות 14,21,22^.

שיטת FIVM הוקמה בהצלחה לחקר השינויים המבניים והתפקודיים במיקרו-סירקולציה של שבלול בעכבר באמצעות פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן כאמצעי ניגוד וצבע פלואורסצנטי - או DiO (3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט, ירוק) או דיל (1,1-דיוקטדציל-3,3,3,3,3-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלורט, אדום) - לתיוג מוקדם של תאי דם, הדמיה של כלי דם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם. במחקר הנוכחי תואר הפרוטוקול של שיטה זו להדמיה וכימות של שינויים ב-CoBF בעכבר בתנאים רגילים ופתולוגיים (כגון לאחר חשיפה לרעש). טכניקה זו מעניקה לחוקר את הכלים הדרושים כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של CoBF הקשורים לתפקוד לקוי של השמיעה ולפתולוגיה בסטריה וסקולריס, במיוחד כאשר היא מיושמת בשילוב עם מודלים זמינים של עכברים מהונדסים.

Protocol

הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי. כל ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (מספר אישור IACUC: TR01_IP00000968).

1. הכנת תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט

1. הרדמת העכברים התורמים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תמיסת הרדמה קטמין/קסילזין (5 מ"ל/ק"ג, ראו טבלת חומרים).
   הערה: פרוטוקול הרדמה זה אמין מאוד ושומר על לחץ דם סיסטמי.
2. הניחו את העכבר על גבו, פתחו את העור וחשפו את חלל החזה באמצעות פינצטה ומספריים לנתח. חותכים לפתוח את הסרעפת, לתפוס בבסיס עצם החזה באמצעות מספריים מהדק, לחתוך דרך הצלעות ולהרים כדי לחשוף את הלב. לאסוף 1 מ"ל של דם בהפרין (15 IU / mL דם) על ידי ניקור לב, צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F). להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם לאחר איסוף הדם.
3. הסר את הפלזמה, לשטוף את גלולת תאי הדם עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
4. תייג את תאי הדם עם 1 מ"ל של 20 mM DiO או Dil ב- PBS, ודגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר^23,24.
5. צנטריפוגה ולשטוף את תאי הדם המסומנים עם 1 מ"ל של PBS, צנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F), ו להשעות את גלולת התא ב 30% hematocrit עם ~ 0.9 מ"ל של PBS (נפח סופי ~ 1.3 מ"ל) לפני ההזרקה.

2. ניתוח ליצירת חלון פתוח ²⁵

1. הכינו את כלי הניתוח הסטריליים ואת פלטפורמת ההדמיה, והניחו כרית חימום מתחת לווילון (איור 1A). הרדימו את העכברים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) כמתואר בשלב 1.1, ובדקו את עומק ההרדמה על ידי מעקב אחר רפלקס כפות הרגליים וטונוס השרירים הכללי. מניחים את החיה על כרית החימום החמה, ושומרים על הטמפרטורה הרקטלית ב-37 מעלות צלזיוס.
2. הניחו את זנב החיה במערכת ניטור CODATM לניטור לחץ דם ודופק (ראו טבלת חומרים). רשום את לחץ הדם הסיסטולי של החיה, לחץ הדם הדיאסטולי ולחץ הדם הממוצע (MBP) במצב המרדים.
   הערה: לא נראה הבדל ב- MBP של בעלי חיים במצב מורדם ולא מורדם (107 ± 11 מ"מ כספית לעומת 97 ± 7 מ"מ כספית). קצב הלב של בעלי החיים יציב תחת הרדמה, אם כי נמוך יותר (עדיין בטווח התקין) מאשר במצב שאינו מורדם (357 ± 12 פעימות לדקה לעומת 709 ± 3 פעימות לדקה). יש לצפות לפעימות לב מוגברות מעט אצל בעלי חיים הממוקמים באיפוק²⁶.
3. פתח את הבולה הטימפנית השמאלית באמצעות גישה צידית וגחונית תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראה טבלת החומרים), והשאר את הממברנה הטימפנית ואת המערכות ללא פגע²¹.
   1. בצעו חתך לאורך קו האמצע של צוואר החיה כשראשה משותק וממוקם כדי למזער את התנועה (איור 1B). הסר את הבלוטה התת-מנדיבולרית השמאלית ואת הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי ו cauterize.
      הערה: יש להזריק בופרנורפין באופן תת עורי במינון של 0.05 מ"ג/ק"ג כדי להפחית את הכאב במהלך הניתוח.
   2. אתר וחשוף את הבולה הגרמית על ידי זיהוי שריר הסטרנוקלידומסטואיד ועצב הפנים המשתרע קדמית לכיוון הבולה.
   3. פתח את הבולה הגרמית עם מחט של 30 G, והסר בזהירות את העצם המקיפה אותה באמצעות פינצטה כירורגית כדי לספק מבט ברור על עורק השבלול והעורק הסטפטיאלי, כאשר השוליים המדיאליים שלה מונחים על קצה גומחת החלון העגולה, וקורסים קדמיים-עליונים לכיוון החלון הסגלגל (איור 1C, D).
      הערה: טרכאוטומיה מבוצעת כדי לשמור על דרכי הנשימה ללא הפרעה ויש לעשות זאת רק כאשר לבעל החיים יש בעיה נשימתית במהלך ניתוח. באופן כללי, רוב בעלי החיים תחת הרדמה יש נשימה חלקה. עם זאת, אם בעלי חיים קיבלו טרכאוטומיה במהלך הניתוח, אין להשתמש בזרימת הדם המוקלטת לצורך השוואה כלשהי.
4. השתמש בלהב סכין קטן (אזמל #16 טחון בהתאמה אישית) כדי לגרד את עצם הדופן הצדדית בסיבוב האמצעי-גבוה של שבלול העכבר, כ-1.25 מ"מ מהפסגה, עד שנקודה דקה נסדקה. הסירו את שבבי העצם בעזרת ווי תיל קטנים (איור 1E).
5. כסה את חלון כלי השיט בכיסוי חתוך כדי שמירה על תנאים פיזיולוגיים תקינים וספק תצוגה אופטית להקלטת תמונות כלי השיט.
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים בזהירות. בנוסף לניטור טמפרטורת הגוף, יש לעקוב אחר הסימנים החיוניים של החיה, כולל לחץ דם ודופק, לאורך כל הניתוח.

3. הדמיה של CoBF תחת FIVM

1. בצע חתך של ~1 ס"מ לאורך הווריד הספנוס הימני כדי לחשוף את כלי הדם (איור 1F).
2. החדירו 100 μL של תמיסת FITC-dextran (2000 kDa, 40 מ"ג/מ"ל ב-PBS) ו-100 μL של תרחיף תאי דם (30% המטוקריט) ברצף לתוך החיה דרך הווריד הספנוסי (איור 1G) כדי לאפשר הדמיה של כלי הדם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם.
3. שימו לב לזרימת הדם בזמן אמת ישירות על צג וידאו 5 דקות לאחר ההזרקה. דמיינו את כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך (W.D.) (W.D. 30.5 מ"מ, צמצם מספרי 10x, 0.26) ובית מנורה המכיל מסנן עירור מרובה פסים ומסנן פליטה תואם (Table of Materials). הקלט את הסרטון באמצעות מצלמת התקן דיגיטלית בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה (Table of Materials) במהירות של 2 פריימים לשנייה). רכוש יותר מ-350 תמונות לסרטון כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות הזרימה.
   הערה: ניתן לצלם את כלי הדם של הרצועה הספירלית ושל כלי הדם של סטריה על ידי התאמת המיקוד האופטי (וידאו משלים 1).

4. ניתוח וידאו

1. מדוד את קוטר כלי השיט באמצעות תוכנה מתאימה (Table of Materials), וקבע את המרחק בין שתי נקודות קבועות על פני כלי השיט בתמונות שנרכשו.
2. חשב את מהירות זרימת הדם ממסגרות וידאו שצולמו על-ידי מעקב אחר תנועת תאי הדם המסומנים במרחק המרחבי בין מיקומי תמונה²⁷.
   1. פתח את הווידאו של זרימת הדם בתוכנה (פיג'י [ImageJ] שימש בפרוטוקול זה), וקבע את קנה המידה של התמונות.
   2. עקוב אחר תאי הדם המוכתמים ב- DiO שנבחרו באמצעות פונקציית המעקב. השתמש במרחק שהתאים עברו ובמרווח הזמן בין מסגרות תמונה בסרטון לצורך חישוב אוטומטי של מהירות הזרימה.
3. חישוב הזרימה הנפחית (F) לפי המשוואה הבאה: F = V × A. (V: מהירות; A: שטח חתך של כלי השיט).

5. חשיפה לרעש

1. מניחים את החיות בכלובי רשת תיל. חשוף אותם לרעש פס רחב ברמת לחץ קול של 120 dB בתא חשיפה לקול למשך 3 שעות ולמשך 3 שעות נוספות למחרת.
   הערה: משטר חשיפה לרעש זה, הנמצא בשימוש שגרתי במעבדה זו, גורם לאובדן קבוע של רגישות לשבלול²⁸.

תוצאות

לאחר חשיפה כירורגית של נימי השבלול בדופן הצידית (איור 1), תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של תאי דם המסומנים ב-Dil בכלי דם המסומנים ב-FITC-dextran הייתה אפשרית דרך חלון כלי פתוח. איור 2A הוא תמונה מייצגת שצולמה תחת FIVM שמרא?...

Discussion

מאמר זה מדגים כיצד ניתן לדמיין נימים בדופן הצידית של השבלול (ובסטריה וסקולריס) של מודל עכבר באמצעות תיוג פלואורופור בהכנה של חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM. מודל העכבר נמצא בשימוש נרחב ומועדף כמודל יונקים לחקר בריאות האדם ומחלותיו. הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה אפשרית להדמיה וחקירה של CoBF בדופ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope