通过卵母细胞维他化保存生育能力:临床和实验室视角

摘要

卵母细胞冷冻保存被一些国际科学协会确认为后普生妇女生育保护的黄金标准。适当的临床和实验室策略可确保生育保护治疗的最大疗效、效率和安全性。

摘要

在照顾患者未来生活质量的多功能医疗保健系统中，保持女性生育能力至关重要。卵母细胞冷冻保存被一些国际科学协会确认为后普生妇女生育保护的黄金标准，用于医疗和非医学适应症。主要医学适应症是结节性疾病、严重子宫内膜异位症等妇科疾病、影响卵巢储备的全身性疾病以及涉及早年更年期的遗传疾病。本文通过概述客观和循证咨询的建议，描述了生育保护治疗的整个临床和实验室工作。此外，它侧重于程序的有效性，并描述了充分利用卵巢储备和在尽可能短的时间内检索卵母细胞数量的最适当策略。卵巢储备的评估、理想刺激协议的定义以及卵母细胞检索、鉴定和病毒化程序以及最大限度地提高卵巢的疗效、效率和安全性的方法都得到了详细阐述。

引言

开发和实施有效的人类卵母细胞冷冻保存方案是生殖医学的重大突破。根据最近的证据，病毒化是冷冻保存元相II（MII）卵母细胞的最有效策略，因为它导致统计学上更高的存活率相比，缓慢冻结，独立于患者群体（不孕不育患者或卵母细胞捐赠计划）1，2，3。卵母细胞化的显著成就导致美国生殖医学学会（ASRM）和辅助生殖技术协会（SART）的实践委员会宣布这项技术对于选择性生育保护在后普生妇女中最为有效，无论是医疗还是非医学适应症^4，5，6。维持生育力的医学适应症包括（一） 癌症和自身免疫性疾病，需要治疗^7，如放疗、细胞毒性化疗和内分泌治疗（其对卵巢储备的有害影响与产妇年龄以及治疗的类型和剂量有关）:（二） 需要重复或彻底手术的卵巢疾病（如子宫内膜异位症^）8:和 （iii） 遗传条件（如 X 脆弱）或卵巢过早衰竭。此外，对于所有因非医疗原因（也称为社会冻结）而未能完成父母目标的妇女来说，生育保护已成为一个有价值的选择。

无论生育保护的迹象如何，根据关于生育保护的主要国际准则，所有愿意使卵母细胞变质的患者都应接受适当的咨询，了解其成功的实际机会、费用、风险和程序^{9、10、11、12、13}的局限性。最重要的是，应该清楚的是，对一组MII卵母细胞进行视网化并不能确保怀孕，^{但如果有必要的话}，它为未来的体外受精（IVF）治疗提供了更高的成功机会。在这方面，女性在卵母细胞化时的年龄无疑是最重要的限制因素¹⁵作为晚期产妇年龄（AMA:>35岁）是女性不育的主要原因^16。除了卵巢储备的逐步减少外，AMA还与卵母细胞能力受损有关，原因是有缺陷的生理途径，如新陈代谢、表观遗传调节、细胞周期检查点和美血隔离^17。因此，卵子的合理数量主要取决于产妇的年龄。在36岁以下的女性中，至少需要8-10个MII卵母细胞¹⁸个，以最大限度地提高成功的机会。一般来说，卵母细胞的数量越多，成功的可能性就越大。因此，根据卵巢储备标记（如抗梅勒激素 （AMH） 水平或蚂蚁卵泡计数 （AFC） 定制卵巢刺激对于在尽可能短的时间内充分利用卵巢储备至关重要。

在整个程序的安全性是另一个关键问题，当注册患者为生育保护。临床医生应采用最佳策略，通过使用安全的方法，如腺激素释放激素 （GnRH） 拮抗协议，然后使用 GnRH 激动剂触发¹⁹和 （ii） 远程， 来最大限度地降低风险并预防 （i） 卵巢过度刺激综合征 （OHSS）。 然而，在卵母细胞检索过程中，腹膜出血、骨盆结构（尿管、肠道、附录、神经）受伤或骨盆感染的风险是可能的。最后，（三） 刺激的传统方案与超生理血清雌二醇有关，因此，在雌激素敏感疾病（如乳腺癌）中不建议使用。涉及芳香酶抑制剂（如莱罗佐尔或塔莫西芬）的协议更适合在这些情况下^20，21。在实验室环境中，最广泛的卵母细胞化方案仍然是Kuwayama和同事^2，23首先描述的，其中包括一个循序渐进的程序，涉及逐步添加低温保护剂（CMA）。在第一阶段（均衡/脱水），卵母细胞暴露在包含 7.5% v/v 乙二醇和 7.5% v/v 二甲基硫化物 （DMSO） 的 CPA 溶液中，而在第二阶段， 卵母细胞被转移到一个葡萄化解决方案与15%v/v乙二醇和15%v/v DMSO，加上0.5摩尔/L蔗糖。在病毒化介质中短暂孵化后，卵母细胞可以放置在专门设计的开放式低温中，最后在 -196 °C 下沉入液氮中储存，直至使用。

在这里，（一） 概述了客观和循证咨询的建议，（二） 侧重于手术的成本效益，（三） 描述了充分利用卵巢储备和在最短时间内检索卵母细胞数量的最适当策略。卵巢储备的评估、理想刺激协议的定义以及卵母细胞检索、鉴定和病毒化程序将与最大限度地提高卵巢疗效、效率和安全性的方法一起进行详细评估。由于文献中存在本协议的其他协议或改编，因此本手稿的代表性结果和讨论部分仅适用于此程序。

研究方案

1. 工作和临床咨询

注:如因不合逻辑原因需要保育的病人，确保没有预约会诊的等候名单，并尽快提供预约。

1. 检查病史和以前的文件，并评估患者的一般健康状况。
2. 在关系数据库中记录所有信息（包括肿瘤学家批准在癌症患者的情况下接受卵巢刺激）。
3. 为患者提供有关手术可行性的具体咨询。解释手术的步骤（卵巢刺激、卵母细胞检索、卵母细胞病毒化），并告知她成功的实际机会（主要取决于母体年龄和卵母细胞检索时预计的MII卵母细胞数量），以及手术的成本和限制。
4. 进行阴道超声波检查，以获取有关卵巢储备的信息（即AFC），并评估卵巢收集卵子的可及性。
5. 要求血液测试，以评估血型和恒河因子，凝血筛查（血液计数，前列腺素，血栓形成素，纤维蛋白原，蛋白质C，蛋白质S，抗血栓III，同型半胱氨酸），和传染病（乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，静脉疾病研究实验室/特雷波内马苍白血栓分析）。
   注:如果患者因非紧急医疗原因获得生育保护计划，更全面的评估可能包括基底卵泡刺激激素（FSH）、叶黄素化激素（LH）、雌二醇、AMH、乳房检查、帕帕尼科拉乌测试、凝血基因筛查（莱顿和前列腺素的因素V）和火炬筛查（弓形虫病、风疹、巨细胞病毒）。
6. 请求心分评估（心电图）。
7. 推荐心理咨询。

2. 控制卵巢刺激程序，以保持生育能力

注:当开始癌症治疗前可用的时间有限时，建议在月经周期内随时开始卵巢刺激的随机启动方案（即在月经周期内随时开始卵巢刺激）用于选择生育保护的肿瘤患者的卵巢刺激。在出于非紧急医疗原因或社会原因的生育保护计划中，从卵泡早期开始的传统刺激更可取，卵巢刺激基于月经周期开始。受控卵巢刺激（COS）方法应根据最近的欧洲人类生殖和胚胎学会（ESHRE）指南²⁴进行。

1. 根据患者的特点和卵巢储备标记量身定做 COS，主要是母体年龄、FSH、AMH 和 AFC。
2. 在月经周期的第 5 天使用重组剂或泌尿 FSH 开始 COS，固定剂量为 150-300 IU/天（拮抗协议）。
   注:在有LH缺乏或反应欠佳的特定患者群体中，可根据卵巢反应、LH水平和妇科医生的判断，每天额外管理LH 75/150 IU/天。
3. 在雌激素敏感性疾病的患者中，包括从刺激的第一天到卵母细胞检索后的第 7 天与芳香酶抑制剂 （letrozole） 相关的角蛋白。
4. 服用固定剂量的戈纳多特罗平4天。
5. 监测第5天，然后每2-3天监测卵泡生长;最终， 调整戈纳多特罗平剂量。
6. 一旦至少3个毛囊达到17-18毫米直径，管理触发器的最后卵母细胞成熟与单皮的GnRH激动剂在0.5ml的剂量。

3. 卵母细胞检索

1. 准备卵母细胞检索
   1. 对于所需的材料，请参阅 材料表，并保留现成的实验室鞋类和服装、手术面罩、护发罩、手术手套、永久无毒标记、钳子、无菌小纱布、一次性或可重复使用的镜面、阴道手术设备和表面消毒剂。确保复苏设备、用于逆转的麻醉药物、用于治疗过敏性休克的试剂盒和手术室中的氧气供应。
   2. 根据辅助生殖技术超声^（ART）25的ESHRE超声工作组的建议，执行卵母细胞检索程序。
      1. 施用安乐或全身麻醉，以及预防抗生素。
         注:在本协议中，通过管理异丙酚（其剂量根据患者的体重进行调整）和50-100μg芬太尼，1000毫克扑热息痛，并协助面罩用氧气通气，实现了深度沉着。
      2. 使用真空泵、连接到 17 G 单流明针的收集管和卵母细胞收集管组成的吸气装置进行卵母细胞检索。在收集过程中，不要超过 ±120 mmHg 的压力，以避免卵母细胞受损的风险，例如剥离积细胞或压裂佐纳颗粒。
      3. 校准工作表面温度，以确保培养介质中的 37 °C。在整个过程中，尽量减少卵母细胞暴露在甚至可能影响其发育能力的瞬态温度下。
      4. 在卵母细胞检索结束时，在出院前观察患者3-4小时。
2. 手术室
   1. 在进入手术室之前，识别患者并确认排卵触发时间。
   2. 让病人躺在手术台上，处于妇科位置。
   3. 在卵母细胞检索之前清洁阴道/子宫颈，以尽量减少细菌污染。
   4. 进行初步的阴道超声波检查，以评估卵巢的位置以及与各种器官和血管的解剖关系。
   5. 在超声波指导下，将单流明针插入阴道壁和卵巢卵泡，注意不要伤害位于阴道壁和卵巢之间的器官或血管。
   6. 从最近的毛囊开始渴望，然后转向最远的毛囊。
   7. 刺穿直径大于 11-12 mm 的所有毛囊，执行针头的"扭曲运动"，以吸气整个卵泡液，然后释放到手术室块加热器中预热的无菌管（圆形底部 14 mL）中。
   8. 取回后，立即密封并标记管子，并注照患者身份的详细信息。
   9. 确保护士将管子带到实验室，在那里立即筛查是否存在积聚卵母细胞复合物 （COC）。
   10. 指示胚胎学家将检索到的 COC 总数通知临床医生。
   11. 第一卵巢完成手术后，用清洁介质冲洗针头，然后使用相同的程序继续使用第二卵巢。
   12. 卵母细胞检索后，评估任何出血从卵巢或血管的副位和自由液体在道格拉斯袋。
       注:为了自动化和提高在临床层面的游戏和胚胎可追溯性的有效性，在中心²⁶号实施了电子见证系统（EWS）。然而，本协议没有提到EWS，以确保协议在任何试管婴儿实验室的可重复性。不过，请考虑程序的所有步骤都需要第二个操作员（即证人），以确保游戏和胚胎的可追溯性。

4. 试管婴儿实验室

1. 卵母细胞检索程序的前一天
   1. 准备卵母细胞收集管（指 材料表）。
      1. 在每个卵母细胞收集管（圆底，5 mL）中分配1mL的试管管（指 材料表），并盖上0.2兆L的矿物油（指 材料表），用于胚胎培养。
         注:管的数量将根据预期检索的卵泡数量来定义。每个管子可能包含多达 4 个 COC。
   2. 用盖子密封管子（第一次捕捉）。给管子贴上中等类型和准备日期的详细信息。在受控大气中（6% CO 2，5%_{0 2）}在 37 °C 下隔夜孵育_管子。
2. 卵母细胞检索当天
   1. 在 37 °C（无菌培养皿和巴斯德移液器）预温塑料供应。
   2. 要求患者确认其身份（全名和出生日期）和排卵触发时间。在实验室表上注明身份识别（ID）程序已经完成，排卵触发器的时间已得到确认。
   3. 将卵母细胞收集管从孵化器上取下（在手术开始前），并按下盖子以确保紧闭。将卵母细胞收集管标注与患者信息。将卵母细胞收集管置于 37 °C 的块加热器中。
   4. 检查预保温无菌培养皿中的卵泡液，并识别 COC。一旦发现一个或多个COC，在两滴中冲洗两次，以消除卵泡液和血液污染。
   5. 将 COC 转移到卵母细胞收集管中，并注释管上的 COC 数量。松开中管的盖子，在37°C的大气中迅速孵育它们，温度为6%CO2，5%O_2。
   6. 根据检索到的卵母细胞数量重复步骤 7 到 9。更新实验室表。
      注意:确保证人检查所有管加热块（包括手术室的块）是否空，并在实验室纸上签署关闭程序的提示。
   7. 完成程序后擦拭工作阶段。

5. 卵母细胞否认

1. 预热4-（2-羟基乙基）-1-管道酸（HEPES）缓冲介质和透明质酶（指 材料表）在37°C至少1小时开始前。
2. 准备一个4井IVF板（指 材料表）与0.6 mL/井预热HPES缓冲介质（辅以5%的人类血清白蛋白[HSA]）覆盖0.3mL矿物油胚胎培养，并在37°C加热至少30分钟。
3. 将卵母细胞识别板贴上患者身份详情的标签。
4. 在开始手术之前，将透明质酶添加到第一口井中，以获得约 20 IU/mL 的最终浓度。
5. 将数量有限的COC（最多6个）放在含有酶的第一口井中，以分散积积细胞。
6. 为了增强积液和日冕细胞的酶去除，通过巴斯德移液器反复管道将积血细胞剥离，其内径约为 250 μm，最高可达 30 s。观察初始细胞分离后，将卵母细胞转移到仅含有 HEPES 缓冲介质的第二口井，小心地携带最少数量的酶。
7. 使用内径不断减小的凹陷移液器（170-145 μm）进行进一步的除臭，以去除日冕细胞。只有在严格必要的情况下才使用直径较低的（135μm）。
8. 小心地清洗凹陷的卵母细胞，以洗掉酶。
9. 鉴定后，在倒置显微镜下检查卵母细胞，以评估其完整性和成熟阶段。将MII卵母细胞与未成熟细胞（老年囊泡和元相-I）分开。
10. 将 MII 卵母细胞移到病毒化区域，立即进行低温保存。更新实验室表。

6. 卵母细胞化

注:执行卵母细胞化最好在卵母细胞检索后的 38 小时内和被鉴定后立即执行。这里描述的病毒化过程必须在室温 （RT） 下完成，并且使用内径为 170 μm 的脱衣舞移液器，以免在操作过程中损坏卵母细胞。

1. 手术前约 30 分钟，将均衡溶液 （ES） 和病毒化解决方案 （VS） 带到 RT （25-27 °C）。
2. 正确标记冷冻器件，标有患者的姓名和 ID、治疗 ID、冷冻日期、卵母细胞数量和冷冻条码。
3. 用新鲜的液氮将一次性冷却架填充到顶部，并开始消毒过程。
4. 将化验板（指 材料表）标上患者的姓名和身份证。请证人检查冷冻器的正确ID。
5. 小心地倒置每个小瓶两次，在使用前混合其内容，并用一滴 30 μL 的 HEPES 缓冲介质（5% HSA）和 ES 的相邻 30 μL 的相邻滴水准备 6 mm Petri 盘的盖子。
   注意:在使用前放置掉落以限制中等蒸发。
6. 使用直径为 170 μm 的脱衣舞移液器，将卵母细胞（最多 9 个）放在第一滴中，最大介质体积最小。使用脱衣舞移液器，在滴 1 和 n.2 之间架起一座介质的桥梁，以逐步增加 CPU 的浓度（图 1A）。
7. 在第一滴中孵育卵母细胞3分钟。添加 ES （n.3） 的第三滴 30 μL。3分钟后，将卵母细胞转移到ES的第二滴，并在滴n.3和n.2之间架起一座中等桥（图1B）。将卵母细胞在滴 n.3 中孵育 3 分钟。
8. 在孵化过程中，为将要使用的每个低温切口添加一滴 30 μL 的 ES（如果要冷冻保存 9 个卵母细胞，则每滴 ES 中放置 3 滴 ES，每滴 ES 中加入 3 个卵母细胞）。将卵母细胞移入纯 ES 溶液中，并让它们保持 6-9 分钟（直到收缩后恢复初始大小）（图 1C）。
9. 准备一个中央井盘（60 x 15毫米）与1mL的VS。在前 6 分钟结束时，将卵母细胞转移到 VS 解决方案中，释放出尽可能少的介质。将卵母细胞留在 VS 中 1 分钟，并小心清洗，将它们从底端移到盘的顶部，以去除 ES 的过量。
10. 在孵化一分钟结束前大约10秒，将低温放在显微镜下，并调整对黑色标记（即低温的尖端）的聚焦。将卵母细胞放在黑色标记旁边的冰面上，最小VS量（图2A）。
11. 将脱衣舞移液器移离卵母细胞，并去除VS介质（图2B）的过量，使卵母细胞保持被薄薄的中层覆盖（图2C）。
12. 迅速将低温液注入液氮中，快速摇晃以去除表面的气泡。用钳子抓住低温的保护帽，用液氮填充:然后将低温加入其中，同时将丙烯条保持在液氮中。
13. 将低温储存在以前标有患者信息的视网管中。更新实验室表。

7. 卵母细胞变暖

1. 手术前约 30 分钟，将解冻溶液 （TS）、稀释溶液 （DS） 和洗涤液 （WS） 加热至 RT （25-27 °C）。小心地倒置每个小瓶两次，以混合其内容。将 1 mL 的 TS 放在中央井培养皿中，在 37 °C 下加热至少 1 小时，然后再开始手术。
2. 将所有塑料用品标有患者的姓名、ID 和溶液类型。请证人确认患者关于低温的信息。
3. 要加热每个低温，应在第一口井中准备一个 6 井板，第一口井中 200 μL 的 DS，在第二口和第三口井中准备同等数量的 WS（分别命名为 WS1 和 WS2）。在井外区域添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）或无菌水，以防止蒸发。
4. 将 TS 菜从孵化器中取出，放在显微镜下。将显微镜的聚焦调整到培养皿的中心。
5. 小心地扭动和取下低温的保护盖，同时将丙烯条保持在液氮中。尽快将低温从液氮转移到 TS 中，以避免脱毒风险，并启动倒计时（1 分钟）。
6. 通过聚焦低温（即黑色标记）的尖端来定位卵母细胞。使用脱衣舞移液器，将卵母细胞从低温中释放出来。
   注意:尽量不要从低温中吸出卵母细胞:轻轻地释放一些媒体， 直到他们进入 Ts 。
7. 使用直径为 170 μm 的脱衣舞移液器，将卵母细胞与少量 TS（创建梯度）转移到 DS，并将它们留在 DS 中 3 分钟。将卵母细胞移到 WS1 也一样，并离开它们 5 分钟。最后，将卵母细胞转移到WS21分钟。
8. 将卵母细胞转移到适当的预平衡IVF培养介质中，在进行细胞内精子注射（ICSI）之前孵育1小时。更新实验室表。

结果

中心生育保护计划概述

在12年期间（2008-2020年），285名妇女至少接受了一次卵母细胞检索，使收集的成熟卵子全部被检出。这些妇女中的大多数（n=250）接受了一次检索，35名妇女接受了多次检索。接受卵母细胞检索的原因归纳为4类:医疗（癌症除外）、癌症、非医学等。在250名接受卵母细胞检索的250名妇女中，8%有癌症以外的医学原因（10例子宫内膜异位症、3例?...

讨论

临床考虑

虽然已经探索了卵巢组织冷冻保存和体外成熟等新兴策略，但COS后卵母细胞体质化是保存生育力的黄金标准技术。在这种情况下，应在最短的时间内最大限度地增加检索和冷冻保存的卵母细胞数量，因为大多数癌症患者在开始癌症治疗之前可能仅从一个卵巢周期中受益。因此，适当的卵巢刺激方案对于充分利用卵巢储备和增加未来活产²⁸

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collection
Equipment
Hot plate	IVF TECH
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Vacuum Pump	Cook	K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)	Cook	K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish	Corning	353803	Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes	Falcon	352001	Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes	Falcon	352003	Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator	Eppendorf	Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin	thermoFisher Scietific	9988
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101	80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish	Falcon	353653	Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA	1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-6	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )	Cook	K-FPIP-1130-10BS-7	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin	Fujifilm Irvine Scientific	9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-so	2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit	Coopersurgical Origio	42782001A	VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
SAtripping pipette tips (300µm)	Cook	K-FPIP-1300-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-so	4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)