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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la norme d’or pour la préservation de la fertilité chez les femmes postpubères. Des stratégies cliniques et de laboratoire appropriées garantissent une efficacité, une efficience et une sécurité maximales des traitements de préservation de la fertilité.

Résumé

La préservation de la fertilité féminine est cruciale dans un système de santé multifonctionnel qui prend soin de la qualité de vie future des patients. La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la référence en matière de préservation de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour des indications médicales que non médicales. Les principales indications médicales sont les maladies oncologiques, les maladies gynécologiques telles que l’endométriose sévère, les maladies systémiques compromettant la réserve ovarienne et les conditions génétiques impliquant une ménopause prématurée. Cet article décrit l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité en décrivant des recommandations pour des conseils objectifs et fondés sur des preuves. En outre, il se concentre sur l’efficacité de la procédure et décrit les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification ont été détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité.

Introduction

Le développement et la mise en œuvre d’un programme efficace de cryoconservation des ovocytes humains ont été une percée importante en médecine de la reproduction. Selon des preuves récentes, la vitrification est la stratégie la plus efficace pour cryoconserver les ovocytes de la métaphase II (MII), car elle entraîne des taux de survie statistiquement plus élevés par rapport à la congélation lente, indépendamment de la population de patients (patients infertiles ou programme de don d’ovocytes)1,2,3. Les réalisations remarquables de la vitrification ovocytaire ont conduit les comités de pratique de l’American Society for Reproductive Medicine (ASRM) et de la Society for Assisted Reproductive Technology (SART) à déclarer que cette technique était la plus efficace pour la préservation élective de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour les indications médicales que non médicales4,5,6. Les indications médicales pour la préservation de la fertilité comprennent (i) le cancer et les maladies auto-immunes qui nécessitent des thérapies7 telles que la radiothérapie, la chimiothérapie cytotoxique et la thérapie endocrinienne (dont l’effet néfaste sur la réserve ovarienne est associé à l’âge maternel ainsi qu’au type et à la dose du traitement); ii) les maladies de l’ovaire nécessitant une chirurgie répétée ou radicale (comme l’endométriose)8; et (iii) des affections génétiques (p. ex., X-fragile) ou une insuffisance ovarienne prématurée. En outre, la préservation de la fertilité est devenue une option précieuse pour toutes les femmes qui n’ont pas atteint leur objectif parental pour des raisons non médicales (également connu sous le nom de gel social).

Quelle que soit l’indication pour la préservation de la fertilité et conformément aux principales directives internationales sur la préservation de la fertilité, tous les patients désireux de vitrifier leurs ovocytes doivent recevoir des conseils appropriés pour être informés de leurs chances réalistes de succès, des coûts, des risques et des limites de la procédure9,10 , 11,12,13. Plus important encore, il devrait être clair que la vitrification d’une cohorte d’ovocytes MII n’assure pas une grossesse, mais qu’elle offre une plus grande chance de succès pour le futur traitement de fécondation in vitro (FIV), si nécessaire14. À cet égard, l’âge de la femme au moment de la vitrification ovocytaire est certainement le facteur limitant le plus important15 car l’âge maternel avancé (AMA; >35 ans) est la principale cause d’infertilité féminine16. Outre une réduction progressive de la réserve ovarienne, l’AMA est associée à une altération de la compétence ovocytaire due à des voies physiologiques défectueuses telles que le métabolisme, la régulation épigénétique, les points de contrôle du cycle cellulaire et la ségrégation méiotique17. Par conséquent, le nombre raisonnable d’ovules à vitrifier dépend principalement de l’âge de la mère. Chez les femmes de moins de 36 ans, au moins 8 à 10 ovocytes MII18 sont nécessaires pour maximiser les chances de succès. En général, plus le nombre d’ovocytes vitrifiés est élevé, plus la probabilité de succès est élevée. Par conséquent, l’adaptation de la stimulation ovarienne en fonction de marqueurs de réserve ovarienne tels que les niveaux d’hormone anti-müllérienne (AMH) ou le nombre de follicules antraux (AFC) est cruciale pour exploiter pleinement la réserve ovarienne dans les plus brefs délais.

La sécurité de l’ensemble de la procédure est l’autre question clé lors de l’inscription de patients pour la préservation de la fertilité. Les cliniciens devraient employer les meilleures stratégies pour minimiser les risques et prévenir (i) le syndrome d’hyperstimulation ovarienne (SHO) en utilisant des approches sûres telles que le protocole d’antagoniste de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) suivi d’un déclencheur agoniste de la GnRH19 et (ii) les risques éloignés, mais possibles, de saignement péritonéal, de lésion des structures pelviennes (uretère, intestin, appendice, nerfs) ou d’infection pelvienne lors du prélèvement d’ovocytes. Enfin, (iii) les schémas thérapeutiques traditionnels de stimulation sont associés à l’œstradiol sérique supraphysiologique et ne sont donc pas recommandés dans les maladies sensibles aux œstrogènes telles que le cancer du sein. Les protocoles impliquant des inhibiteurs de l’aromatase (tels que le létrozole ou le tamoxifène) sont plus appropriés dans ces cas20,21. En laboratoire, le protocole le plus répandu pour la vitrification ovocytaire est encore celui décrit pour la première fois par Kuwayama et ses collègues2,23, qui consiste en une procédure par étapes impliquant l’ajout progressif de cryoprotecteurs (CPA). Dans la première phase (équilibre/déshydratation), les ovocytes sont exposés dans une solution de CPA contenant 7,5 % v/v d’éthylène glycol et 7,5 % v/v de diméthylsulfoxyde (DMSO), tandis que dans la deuxième phase, les ovocytes sont déplacés vers une solution de vitrification avec 15 % v/v d’éthylène glycol et 15 % v/v de DMSO, plus 0,5 mol/L de saccharose. Après une courte incubation dans le milieu de la vitrification, les ovocytes peuvent être placés dans des cryodispositifs ouverts spécialement conçus et finalement plongés dans de l’azote liquide à -196 °C pour être conservés jusqu’à utilisation.

Ici, l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité a été décrit en (i) décrivant des recommandations pour un conseil objectif et fondé sur des preuves, (ii) en se concentrant sur le rapport coût-efficacité de la procédure et (iii) en décrivant les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification seront détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité. Comme d’autres protocoles ou adaptations de ce protocole existent dans la littérature, les résultats représentatifs et les sections de discussion de ce manuscrit ne s’appliquent qu’à cette procédure.

Protocole

1. Travail et counseling clinique

REMARQUE: Dans le cas de patients nécessitant une préservation de la fertilité pour des raisons oncologiques, assurez-vous qu’il n’y a pas de liste d’attente pour planifier la consultation et que le rendez-vous est fourni dès que possible.

  1. Examinez les antécédents médicaux et la documentation antérieure et évaluez l’état de santé général du patient.
  2. Enregistrer toutes les informations (y compris l’approbation de l’oncologue pour subir une stimulation ovarienne en cas de patientes atteintes de cancer) dans une base de données relationnelle.
  3. Fournir au patient des conseils spécifiques sur la faisabilité de la procédure. Expliquez les étapes de la procédure (stimulation ovarienne, prélèvement d’ovocytes, vitrification ovocytaire) et informez-la des chances réalistes de succès (principalement en fonction de l’âge maternel et du nombre prévu d’ovocytes MII au moment du prélèvement d’ovocytes), ainsi que du coût et des limites de la procédure.
  4. Effectuer une échographie transvaginale pour obtenir des informations sur la réserve ovarienne (c.-à-d. AFC) et pour évaluer l’accessibilité des ovaires pour la collecte d’ovules.
  5. Demander des tests sanguins pour évaluer le groupe sanguin et le facteur rhésus, le dépistage de la coagulation (numération globulaire, prothrombine, thromboplastine, fibrinogène, protéine C, protéine S, anti-thrombine III, homocystéine) et les maladies infectieuses (hépatite B, hépatite C, VIH, laboratoire de recherche sur les maladies vénériennes / test d’hémagglutination Treponema pallidum).
    REMARQUE: Dans le cas de patients accédant à un programme de préservation de la fertilité pour des raisons médicales non urgentes, une évaluation plus complète peut inclure l’hormone folliculo-stimulante basale (FSH), l’hormone lutéinisante (LH), l’œstradiol, l’AMH, l’examen des seins, le test Papanicolaou, le dépistage génétique de la coagulation (facteur V de Leiden et prothrombine) et le dépistage TORCH (toxoplasmose, rubéole, cytomégalovirus).
  6. Demander une évaluation cardiologique (électrocardiogramme).
  7. Recommander des conseils psychologiques.

2. Protocoles de stimulation ovarienne contrôlée pour la préservation de la fertilité

REMARQUE: Lorsque le temps disponible avant de commencer le traitement du cancer est limité, le protocole de démarrage aléatoire (c.-à-d. commencer la stimulation ovarienne à tout moment pendant le cycle menstruel) est recommandé pour la stimulation ovarienne chez les patientes oncologiques qui sont candidates à la préservation de la fertilité. Dans un programme de préservation de la fertilité pour des raisons médicales non urgentes ou sociales, une stimulation conventionnelle commençant au début de la phase folliculaire est préférable, et la stimulation ovarienne est commencée en fonction du cycle menstruel. Les approches de stimulation ovarienne contrôlée (COS) doivent être réalisées conformément aux récentes lignes directrices de la Société européenne de reproduction humaine et d’embryologie (ESHRE)24.

  1. Adapter le COS en fonction des caractéristiques de la patiente et des marqueurs de la réserve ovarienne, principalement l’âge maternel, la FSH, l’AMH et l’AFC.
  2. Commencez le COS le jour 5 du cycle menstruel en utilisant la FSH recombinante ou urinaire avec une dose fixe de 150-300 UI / jour (protocole antagoniste).
    REMARQUE: Dans une population spécifique de patientes présentant un déficit en LH ou une réponse sous-optimale médiocre, une augmentation de LH 75/150 UI / jour peut être administrée en fonction de la réponse ovarienne, des taux de LH et du jugement du gynécologue.
  3. Chez les patients atteints de maladies sensibles aux œstrogènes, inclure les gonadotrophines associées aux inhibiteurs de l’aromatase (létrozole) du jour 1 de la stimulation jusqu’au jour 7 après le prélèvement des ovocytes.
  4. Administrer une dose fixe de gonadotrophines pendant 4 jours.
  5. Surveiller la croissance folliculaire le jour 5, puis tous les 2-3 jours; finalement, ajustez la dose de gonadotrophine.
  6. Une fois qu’au moins 3 follicules atteignent 17-18 mm de diamètre, administrer le déclencheur de maturation finale des ovocytes avec un seul bolus sous-cutané d’agoniste de la GnRH à la dose de 0,5 mL.

3. Prélèvement d’ovocytes

  1. Préparation au prélèvement d’ovocytes
    1. Pour le matériel requis, reportez-vous à la Table des matériauxet gardez prêts les chaussures et la tenue de laboratoire, le masque chirurgical, la housse de cheveux, les gants chirurgicaux, un marqueur permanent non toxique, une pince à épier, de petites gazes stériles, du spéculum jetable ou réutilisable, de l’équipement de chirurgie vaginale et un désinfectant de surface. Assurer la disponibilité de l’équipement de réanimation, des médicaments anesthésiques pour l’inversion, d’une trousse préparée pour le traitement du choc anaphylactique et de l’oxygène dans la salle d’opération.
    2. Effectuer la procédure de prélèvement d’ovocytes conformément aux recommandations du groupe de travail de l’ESHRE sur les ultrasons dans les technologies de procréation assistée (ART)25.
      1. Administrer une sédation ou une anesthésie générale et des antibiotiques pour la prophylaxie.
        REMARQUE: Dans ce protocole, une sédation profonde a été obtenue en administrant du propofol (dont la posologie est ajustée en fonction du poids du patient) et 50 à 100 μg de fentanyl, 1000 mg de paracétamol et une ventilation assistée du masque avec de l’oxygène.
      2. Effectuer le prélèvement d’ovocytes à l’aide d’une unité d’aspiration composée d’une pompe à vide, d’un tube collecteur relié à une aiguille mono-lumen de 17 G et d’un tube collecteur d’ovocytes. Pendant le prélèvement, ne pas dépasser une pression d’environ 120 mmHg pour éviter le risque d’endommagement des ovocytes tels que le décapage des cellules du cumulus ou la fracturation de la zone pellucide.
      3. Calibrer la température de la surface de travail pour assurer une température de 37 °C dans le milieu de culture. Pendant toute la procédure, minimisez l’exposition des ovocytes à une température même transitoire qui peut affecter leurs compétences développementales.
      4. À la fin du prélèvement d’ovocytes, observez la patiente pendant 3-4 heures avant la sortie.
  2. Salle d’opération
    1. Avant d’entrer dans la salle d’opération, identifiez la patiente et confirmez l’heure du déclenchement de l’ovulation.
    2. Demandez à la patiente de s’allonger sur la table d’opération en position gynécologique.
    3. Nettoyer le vagin / col de l’utérus avant le prélèvement d’ovocytes pour minimiser la contamination bactérienne.
    4. Effectuer une échographie transvaginale préliminaire pour évaluer la position des ovaires et les relations anatomiques avec les différents organes et vaisseaux sanguins.
    5. Sous guidage échographique, insérez une aiguille à une seule lumière à travers la paroi vaginale et dans un follicule ovarien, en prenant soin de ne pas blesser les organes ou les vaisseaux sanguins situés entre la paroi vaginale et l’ovaire.
    6. Commencez l’aspiration à partir du follicule le plus proche et passez aux follicules les plus distaux.
    7. Perforer tous les follicules d’un diamètre supérieur à 11-12 mm, en effectuant des « mouvements de torsion » de l’aiguille pour aspirer tout le liquide folliculaire, qui est ensuite libéré dans un tube stérile (fond rond 14 mL) préchauffé dans le bloc chauffant de la salle d’opération.
    8. Immédiatement après la récupération, scellez et étiquetez le tube avec des détails sur l’identité du patient.
    9. Assurez-vous que l’infirmière apporte le tube au laboratoire, où il est immédiatement dépisté pour la présence de complexes cumulus-ovocytes (COC).
    10. Demandez aux embryologistes d’informer le clinicien du nombre total de COC récupérés.
    11. Une fois la procédure terminée pour le premier ovaire, rincez l’aiguille avec un milieu propre et procédez au deuxième ovaire en utilisant la même procédure.
    12. Après le prélèvement d’ovocytes, évaluer tout saignement des ovaires ou des vaisseaux sanguins du paramètre et du liquide libre dans la poche de Douglas.
      NOTE: Pour automatiser et améliorer l’efficacité de la traçabilité des gamètes et des embryons au niveau clinique, un système de témoin électronique (EWS) a été mis en place dans le centre26. Néanmoins, ce protocole ne mentionne pas l’EWS, pour assurer la reproductibilité du protocole dans tout laboratoire de FIV. Néanmoins, considérez que toutes les étapes de la procédure nécessitent un deuxième opérateur (c’est-à-dire un témoin) pour assurer la traçabilité des gamètes et des embryons.

4. Laboratoire de FIV

  1. La veille de la procédure de prélèvement d’ovocytes
    1. Préparer des tubes collecteurs d’ovocytes (voir la Table des matériaux).
      1. Distribuer 1 mL de milieu de FIV (voir la Table des matériaux)dans chaque tube de prélèvement d’ovocytes (fond rond, 5 mL), et couvrir avec 0,2 mL d’huile minérale (voir la Table des matériaux)pour la culture d’embryons.
        NOTE: Le nombre de tubes sera défini en fonction du nombre de follicules qui devraient être récupérés. Chaque tube peut contenir jusqu’à 4 COC.
    2. Scellez les tubes avec le capuchon (premier bouton-pression). Étiquetez les tubes avec des détails sur le type de milieu et la date de préparation. Incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C dans une atmosphère contrôlée (6% CO2,5% 02).
  2. Le jour du prélèvement d’ovocytes
    1. Pré-pré-pré-déformation des approvisionnements en plastique à 37 °C (plats de culture stériles et pipettes Pasteur).
    2. Demandez aux patientes de confirmer leur identité (nom complet et date de naissance) et l’heure du déclenchement de l’ovulation. Annotez sur la feuille de laboratoire que la procédure d’identification (ID) a été accomplie et que le moment du déclenchement de l’ovulation a été confirmé.
    3. Retirez les tubes de prélèvement d’ovocytes de l’incubateur (juste avant le début de la procédure) et poussez le capuchon vers le bas pour assurer une fermeture étanche. Étiquetez les tubes de prélèvement d’ovocytes avec les informations de la patiente. Placez les tubes de prélèvement d’ovocytes dans le bloc chauffant à 37 °C.
    4. Examinez le liquide folliculaire dans les plats de culture stérile pré-avertis et identifiez les COC. Une fois qu’un ou plusieurs COC sont identifiés, rincez-les deux fois dans deux gouttes de milieu pour éliminer le liquide folliculaire et la contamination du sang.
    5. Transférer les COC dans les tubes de prélèvement d’ovocytes et annoter le nombre de COC sur le tube. Desserrer les bouchons des tubes moyens, et les incuber rapidement à 37 °C dans une atmosphère de 6% CO2,5%O2.
    6. Répétez les étapes 7 à 9 en fonction du nombre d’ovocytes prélevés. Mettez à jour la fiche de laboratoire.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’un témoin vérifie que tous les blocs chauffants (y compris ceux de la salle d’opération) sont vides et signe la clôture de la procédure sur la feuille de laboratoire.
    7. Essuyez l’étape de travail après la fin de la procédure.

5. Dénudation des ovocytes

  1. Milieu tamponné à l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) préwarme et hyaluronidase (voir la table des matériaux)à 37 °C au moins 1 h avant le départ.
  2. Préparer une plaque de FIV à 4 puits (voir la Table des matériaux)avec 0,6 mL/puits de milieu tamponné HEPES pré-averti (complété par 5% d’albumine sérique humaine [HSA]) recouverte de 0,3 mL d’huile minérale pour la culture embryonnaire, et chaude à 37 °C pendant au moins 30 min.
  3. Étiquetez la plaque de dénudation des ovocytes avec les détails de l’identité de la patiente.
  4. Immédiatement avant de commencer la procédure, ajouter la hyaluronidase au premier puits pour obtenir une concentration finale d’environ 20 UI / mL.
  5. Placez un nombre limité de COC (jusqu’à 6) dans le premier puits contenant l’enzyme pour disperser les cellules du cumulus.
  6. Pour améliorer l’élimination enzymatique des cellules cumulus et corona, effectuez le décapage des cellules cumulus en pipetant les ovocytes à plusieurs reprises à travers une pipette Pasteur d’un diamètre intérieur d’environ 250 μm pendant 30 s. Après avoir observé une dissociation cellulaire initiale, transférer les ovocytes dans le deuxième puits contenant uniquement un milieu tamponné HEPES, en prenant soin de transporter une quantité minimale de l’enzyme.
  7. Effectuer une dénudation supplémentaire pour éliminer les cellules corona en utilisant des pipettes de dénudage avec des diamètres intérieurs décroissants (170-145 μm). Utilisez des diamètres inférieurs (135 μm) uniquement si cela est strictement nécessaire.
  8. Lavez soigneusement les ovocytes dénudés pour éliminer l’enzyme.
  9. Après la dénudation, examinez les ovocytes au microscope inversé pour évaluer leur intégrité et leur stade de maturation. Séparer les ovocytes MII des ovocytes immatures (vésicule germinale et métaphase-I).
  10. Déplacez les ovocytes MII vers la zone de vitrification pour effectuer immédiatement la cryoconservation. Mettez à jour la fiche de laboratoire.

6. Vitrification des ovocytes

REMARQUE: Effectuer la vitrification des ovocytes de préférence dans les 38 heures suivant le prélèvement d’ovocytes et immédiatement après la dénudation. La procédure de vitrification décrite ici doit être réalisée à température ambiante (RT) et en utilisant une pipette décapante d’un diamètre intérieur de 170 μm afin de ne pas endommager les ovocytes lors de la manipulation.

  1. Environ 30 minutes avant la procédure, porter la solution d’équilibrage (ES) et la solution de vitrification (VS) à RT (25-27 °C).
  2. Étiquetez correctement les cryodispositifs avec le nom et l’ID du patient, l’ID de traitement, la date de congélation, le nombre d’ovocytes et le code-barres du cryo.
  3. Remplissez une grille de refroidissement jetable jusqu’au sommet avec de l’azote liquide frais et commencez le processus de stérilisation.
  4. Étiquetez la plaque de vitrification (reportez-vous à la table des matériaux)avec le nom et la pièce d’identité du patient. Demandez à un témoin de vérifier l’ID correct des cryodispositifs.
  5. Inverser soigneusement chaque flacon deux fois pour mélanger son contenu avant utilisation, et préparer le couvercle d’une boîte de Petri de 6 mm avec une goutte de 30 μL de milieu tamponné HEPES (avec 5% HSA) et une goutte adjacente de 30 μL d’ES.
    REMARQUE: Placez les gouttes juste avant utilisation pour limiter l’évaporation du milieu.
  6. À l’aide d’une pipette décapante de 170 μm de diamètre, placez les ovocytes (jusqu’à 9) dans la première goutte avec le plus petit volume de milieu possible. À l’aide de la pipette de décapage, créer un pont de milieu entre la goutte n.1 et n.2 pour obtenir une augmentation progressive de la concentration des CPA (Figure 1A).
  7. Incuber les ovocytes dans la première goutte pendant 3 minutes. Ajouter une troisième goutte de 30 μL d’ES (n.3). Après 3 min, transférer les ovocytes dans la deuxième goutte d’ES, et créer un pont moyen entre les gouttes n.3 et n.2 (Figure 1B). Incuber les ovocytes en goutte n.3 pendant 3 min.
  8. Pendant l’incubation, ajoutez une goutte de 30 μL d’ES pour chaque cryodispositif qui sera utilisé (si 9 ovocytes doivent être cryoconservés, placez 3 gouttes de ES avec 3 ovocytes dans chaque goutte d’ES). Déplacez les ovocytes dans une solution ES pure et laissez-les pendant 6 à 9 minutes (jusqu’à ce qu’ils retrouvent leur taille initiale après le rétrécissement) (Figure 1C).
  9. Préparer un plat de puits central (60 x 15 mm) avec 1 mL de VS. À la fin des 6 premières minutes, transférer les ovocytes à cryoconserver dans la solution VS, en libérant le moins de milieu possible. Laissez les ovocytes dans VS pendant 1 min et lavez-les soigneusement en les déplaçant du bas vers le haut du plat pour éliminer l’excès de SE.
  10. Environ 10 s avant la fin de la minute d’incubation, placez le cryodispositif sous le microscope et ajustez la mise au point sur la marque noire (c.-à-d. la pointe du cryodispositif). Placer les ovocytes sur le cryodispositif à côté de la marque noire avec la quantité minimale de VS (Figure 2A).
  11. Éloignez la pipette du décapant des ovocytes et retirez l’excès de milieu VS (Figure 2B) afin que les ovocytes restent recouverts d’une fine couche de milieu (Figure 2C).
  12. Plongez rapidement le cryodispositif dans de l’azote liquide, en le secouant rapidement pour éliminer les bulles d’air de sa surface. Tenez le capuchon protecteur du cryodispositif avec une pince à épiler et remplissez-le d’azote liquide; puis insérez le cryodispositif à l’intérieur tout en gardant les bandes de propylène dans de l’azote liquide.
  13. Stockez le cryodispositif dans un visiotube préalablement étiqueté avec les informations du patient. Mettez à jour la fiche de laboratoire.

7. Réchauffement des ovocytes

  1. Environ 30 minutes avant l’intervention, réchauffer la solution de décongélation (TS), la solution de dilution (DS) et la solution de lavage (WS) à RT (25-27 °C). Inverser soigneusement chaque flacon deux fois pour mélanger son contenu. Placer 1 mL de TS dans une boîte de Petri de puits central et la réchauffer à 37 °C pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure.
  2. Étiquetez toutes les fournitures en plastique avec le nom et l’identifiant du patient et le type de solution. Demandez à un témoin de confirmer les informations du patient sur le cryodispositif.
  3. Pour chaque cryodispositif à réchauffer, préparez une plaque de 6 puits avec 200 μL de DS dans le premier puits et une quantité égale de WS dans les deuxième et troisième puits (nommés WS1 et WS2, respectivement). Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou de l’eau stérile dans la zone à l’extérieur des puits pour éviter l’évaporation.
  4. Sortez la boîte TS de l’incubateur et placez-la sous le microscope. Ajustez la mise au point du microscope au centre de la boîte de Pétri.
  5. Tournez et retirez soigneusement le capuchon protecteur du cryodispositif, tout en conservant les bandes de propylène dans de l’azote liquide. Transférer le cryodispositif de l’azote liquide dans le TS le plus rapidement possible pour éviter le risque de dévitrification et lancer le compte à rebours (1 min).
  6. Localisez les ovocytes en se concentrant sur l’extrémité du cryodispositif (c’est-à-dire la marque noire). À l’aide d’une pipette décapante, libérez les ovocytes du cryodispositif.
    REMARQUE: Essayez de ne pas aspirer les ovocytes du cryodispositif; relâchez doucement des médias sur eux jusqu’à ce qu’ils se déplacent dans le TS.
  7. À l’aide d’une pipette décapante de 170 μm de diamètre, transférez les ovocytes dans DS avec une petite quantité de TS (pour créer un gradient) et laissez-les dans le DS pendant 3 min. Déplacez les ovocytes vers WS1 de même, et laissez-les pendant 5 min. Enfin, transférez les ovocytes à WS2 pendant 1 min.
  8. Transférer les ovocytes dans un milieu de culture de FIV prééquilibré approprié et les incuber pendant 1 h avant de procéder à une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). Mettez à jour la fiche de laboratoire.

Résultats

Aperçu du programme de préservation de la fertilité au centre

Sur une période de 12 ans (2008-2020), 285 femmes ont subi au moins un prélèvement d’ovocytes impliquant la vitrification de toute la cohorte d’ovules matures collectés. La plupart de ces femmes (n = 250) ont subi une seule récupération, et 35 ont subi plusieurs récupérations. Les raisons de subir un prélèvement d’ovocytes pour la vitrification des ovules sont résumées en 4 catégories: médical...

Discussion

Considérations cliniques

Bien que des stratégies émergentes, telles que la cryoconservation du tissu ovarien et la maturation in vitro, aient été explorées, la vitrification des ovocytes après COS est la technique de référence pour la préservation de la fertilité. Dans ce scénario, le nombre d’ovocytes prélevés et cryoconservés devrait être maximisé dans les plus brefs délais, car la plupart des patientes atteintes de cancer pourraient bénéficier uniquem...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Aucun

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Vacuum PumpCookK-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria DishCorning353803Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubesFalcon352001Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubesFalcon352003Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubatorEppendorfGalaxy 14S
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum AlbuminthermoFisher Scietific9988
HyaluronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dishFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum AlbuminFujifilm Irvine Scientific9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kitFujifilm Irvine Scientific90133-so2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
SAtripping pipette tips (300µm)CookK-FPIP-1300-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kitFujifilm Irvine Scientific90137-so4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

Références

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