Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин. Соответствующие клинические и лабораторные стратегии обеспечивают максимальную эффективность, результативность и безопасность методов лечения бесплодия.
Сохранение женской фертильности имеет решающее значение в многофункциональной системе здравоохранения, которая заботится о будущем качестве жизни пациентов. Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям. Основными медицинскими показаниями являются онкологические заболевания, гинекологические заболевания, такие как тяжелый эндометриоз, системные заболевания, ставящие под угрозу овариальный резерв, и генетические состояния, связанные с преждевременной менопаузой. В этой статье описывается вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности путем изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультированию. Кроме того, основное внимание уделяется эффективности процедуры и описываются наиболее подходящие стратегии для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов были подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности.
Разработка и внедрение эффективной программы криоконсервации ооцитов человека стала значительным прорывом в репродуктивной медицине. Согласно последним данным, витрификация является наиболее эффективной стратегией криоконсервации метафазных II (MII) ооцитов, поскольку она приводит к статистически более высоким показателям выживаемости по сравнению с медленным замораживанием, независимо от популяции пациентов (бесплодных пациентов или программы донорства ооцитов)1,2,3. Замечательные достижения витрификации ооцитов привели к тому, что практические комитеты Американского общества репродуктивной медицины (ASRM) и Общества вспомогательных репродуктивных технологий (SART) объявили этот метод наиболее эффективным для выборного сохранения фертильности у женщин в постпубертатном периоде, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям4,5,6. Медицинские показания для сохранения фертильности включают (i) рак и аутоиммунные заболевания, которые требуюттерапии 7, такой как лучевая терапия, цитотоксическая химиотерапия и эндокринная терапия (чье пагубное влияние на овариальный резерв связано с возрастом матери, а также с типом и дозой лечения); ii) заболевания яичников, требующие повторного или радикальногохирургического вмешательства (например, эндометриоз)8; и iii) генетические условия (например, X-хрупкий) или преждевременная недостаточность яичников. Кроме того, сохранение фертильности стало ценным вариантом для всех женщин, которые не достигли своей родительской цели по немедицинским причинам (также известным как социальное замораживание).
Независимо от показаний к сохранению фертильности и в соответствии с основными международными руководящими принципами по сохранению фертильности, все пациенты, желающие витрифицировать свои ооциты, должны получить соответствующую консультацию, чтобы быть информированными об их реальных шансах на успех, стоимости, рисках и ограничениях процедуры9,10, 11,12,13. Самое главное, должно быть ясно, что витрифицирование когорты ооцитов МИИ не обеспечивает беременность, но что она предлагает более высокие шансы на успех для будущего лечения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при необходимости14. В связи с этим возраст женщины на момент витрификации ооцитов, безусловно, является важнейшим ограничивающим фактором15, так как преклонный возраст матери (АМА; >35 лет) является основной причиной женского бесплодия16. Помимо прогрессирующего снижения овариального резерва, АМА связана с ухудшением компетентности ооцитов из-за дефектных физиологических путей, таких как метаболизм, эпигенетическая регуляция, контрольные точки клеточного цикла и мейотическая сегрегация17. Поэтому разумное количество яйцеклеток для витры в основном зависит от возраста матери. У женщин моложе 36 лет требуется не менее 8-10 МИИ ооцитов18, чтобы максимизировать шансы на успех. В целом, чем выше количество витрифицированных ооцитов, тем выше вероятность успеха. Поэтому адаптация стимуляции яичников в соответствии с маркерами овариального резерва, такими как уровень антимюллерова гормона (AMH) или количество антральных фолликулов (AFC), имеет решающее значение для полного использования овариального резерва в кратчайшие сроки.
Безопасность всей процедуры является другим ключевым вопросом при регистрации пациентов для сохранения фертильности. Клиницисты должны использовать лучшие стратегии для минимизации рисков и предотвращения (i)синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) с использованием безопасных подходов, таких как протокол антагониста гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), за которым следует триггер агониста ГнРГ19 и (ii) отдаленные, но возможные, риски перитонеального кровотечения, повреждения тазовых структур (мочеточник, кишечник, аппендикс, нервы) или тазовой инфекции во время извлечения яйцеклеток. Наконец, (iii) традиционные схемы стимуляции связаны с супрафизиологическим сывороточным эстрадиолом и, следовательно, не рекомендуются при эстроген-чувствительных заболеваниях, таких как рак молочной железы. Протоколы с участием ингибиторов ароматазы (таких как летрозол или тамоксифен) более подходят в этих случаях20,21. В лабораторных условиях наиболее распространенным протоколом витрификации ооцитов по-прежнему является тот, который впервые описан Куваямой и его коллегами2,23,который состоит из поэтапной процедуры, включающей постепенное добавление криопротекторов (CPA). В первой фазе (равновесие/обезвоживание) ооциты подвергают воздействию в растворе CPA, содержащем 7,5% v/v этиленгликоля и 7,5% v/v диметилсульфоксида (DMSO), в то время как во второй фазе ооциты перемещают в раствор витрификации с 15% v/v этиленгликолем и 15% v/v DMSO, плюс 0,5 моль/л сахарозы. После короткой инкубации в среде витрификации ооциты могут быть помещены в специально разработанные открытые криодевицы и, наконец, погружены в жидкий азот при -196 °C для хранения до использования.
Здесь вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности была описана путем (i) изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультирования, (ii) сосредоточения внимания на экономической эффективности процедуры и (iii) описания наиболее подходящих стратегий для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов будут подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности. Поскольку в литературе существуют другие протоколы или адаптации этого протокола, репрезентативные результаты и разделы обсуждения этой рукописи применяются только к этой процедуре.
1. Разработка и клиническое консультирование
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае пациентов, нуждающихся в сохранении фертильности по онкологическим причинам, убедитесь, что нет списка ожидания для назначения консультации, и запись на прием предоставляется как можно скорее.
2. Контролируемые протоколы стимуляции яичников для сохранения фертильности
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда время, доступное до начала лечения рака, ограничено, протокол случайного запуска (т. Е. Начало стимуляции яичников в любое время в течение менструального цикла) рекомендуется для стимуляции яичников у онкологических пациентов, которые являются кандидатами на сохранение фертильности. В программе сохранения фертильности по несрочным медицинским или социальным причинам предпочтительнее обычная стимуляция, начинающаяся в ранней фолликулярной фазе, а стимуляция яичников начинается на основе менструального цикла. Подходы контролируемой стимуляции яичников (COS) должны выполняться в соответствии с недавними руководящими принципами Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE)24.
3. Извлечение ооцитов
4. Лаборатория ЭКО
5. Денудация ооцитов
6. Витрификация ооцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводят витрификацию ооцитов предпочтительно в течение 38 ч после извлечения ооцитов и сразу после денудации. Описанная здесь процедура витрификации должна выполняться при комнатной температуре (RT) и с использованием пипетки стриппера с внутренним диаметром 170 мкм, чтобы не повредить ооциты во время манипуляции.
7. Согревание ооцитов
Обзор программы сохранения фертильности в центре
За 12-летний период (2008-2020 гг.) 285 женщин подверглись по крайней мере одному извлечению ооцитов, влекущего за собой витрификацию всей когорты собранных зрелых яйцеклеток. Большинство из этих женщин (n = 250) подверглис...
Клинические соображения
Хотя новые стратегии, такие как криоконсервация ткани яичников и созревание in vitro, были изучены, витрификация ооцитов после COS является золотым стандартом для сохранения фертильности. В этом сценарии количество извлеченных и криоконсер...
Авторам нечего раскрывать.
Никакой
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collection | |||
Equipment | |||
Hot plate | IVF TECH | ||
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Thermometer | |||
Test tube Warmer | |||
Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
Consumables | |||
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish |
Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
Denudation | |||
Equipment | |||
CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
Warming | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены