JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин. Соответствующие клинические и лабораторные стратегии обеспечивают максимальную эффективность, результативность и безопасность методов лечения бесплодия.

Аннотация

Сохранение женской фертильности имеет решающее значение в многофункциональной системе здравоохранения, которая заботится о будущем качестве жизни пациентов. Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям. Основными медицинскими показаниями являются онкологические заболевания, гинекологические заболевания, такие как тяжелый эндометриоз, системные заболевания, ставящие под угрозу овариальный резерв, и генетические состояния, связанные с преждевременной менопаузой. В этой статье описывается вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности путем изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультированию. Кроме того, основное внимание уделяется эффективности процедуры и описываются наиболее подходящие стратегии для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов были подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности.

Введение

Разработка и внедрение эффективной программы криоконсервации ооцитов человека стала значительным прорывом в репродуктивной медицине. Согласно последним данным, витрификация является наиболее эффективной стратегией криоконсервации метафазных II (MII) ооцитов, поскольку она приводит к статистически более высоким показателям выживаемости по сравнению с медленным замораживанием, независимо от популяции пациентов (бесплодных пациентов или программы донорства ооцитов)1,2,3. Замечательные достижения витрификации ооцитов привели к тому, что практические комитеты Американского общества репродуктивной медицины (ASRM) и Общества вспомогательных репродуктивных технологий (SART) объявили этот метод наиболее эффективным для выборного сохранения фертильности у женщин в постпубертатном периоде, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям4,5,6. Медицинские показания для сохранения фертильности включают (i) рак и аутоиммунные заболевания, которые требуюттерапии 7, такой как лучевая терапия, цитотоксическая химиотерапия и эндокринная терапия (чье пагубное влияние на овариальный резерв связано с возрастом матери, а также с типом и дозой лечения); ii) заболевания яичников, требующие повторного или радикальногохирургического вмешательства (например, эндометриоз)8; и iii) генетические условия (например, X-хрупкий) или преждевременная недостаточность яичников. Кроме того, сохранение фертильности стало ценным вариантом для всех женщин, которые не достигли своей родительской цели по немедицинским причинам (также известным как социальное замораживание).

Независимо от показаний к сохранению фертильности и в соответствии с основными международными руководящими принципами по сохранению фертильности, все пациенты, желающие витрифицировать свои ооциты, должны получить соответствующую консультацию, чтобы быть информированными об их реальных шансах на успех, стоимости, рисках и ограничениях процедуры9,10, 11,12,13. Самое главное, должно быть ясно, что витрифицирование когорты ооцитов МИИ не обеспечивает беременность, но что она предлагает более высокие шансы на успех для будущего лечения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при необходимости14. В связи с этим возраст женщины на момент витрификации ооцитов, безусловно, является важнейшим ограничивающим фактором15, так как преклонный возраст матери (АМА; >35 лет) является основной причиной женского бесплодия16. Помимо прогрессирующего снижения овариального резерва, АМА связана с ухудшением компетентности ооцитов из-за дефектных физиологических путей, таких как метаболизм, эпигенетическая регуляция, контрольные точки клеточного цикла и мейотическая сегрегация17. Поэтому разумное количество яйцеклеток для витры в основном зависит от возраста матери. У женщин моложе 36 лет требуется не менее 8-10 МИИ ооцитов18, чтобы максимизировать шансы на успех. В целом, чем выше количество витрифицированных ооцитов, тем выше вероятность успеха. Поэтому адаптация стимуляции яичников в соответствии с маркерами овариального резерва, такими как уровень антимюллерова гормона (AMH) или количество антральных фолликулов (AFC), имеет решающее значение для полного использования овариального резерва в кратчайшие сроки.

Безопасность всей процедуры является другим ключевым вопросом при регистрации пациентов для сохранения фертильности. Клиницисты должны использовать лучшие стратегии для минимизации рисков и предотвращения (i)синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) с использованием безопасных подходов, таких как протокол антагониста гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), за которым следует триггер агониста ГнРГ19 и (ii) отдаленные, но возможные, риски перитонеального кровотечения, повреждения тазовых структур (мочеточник, кишечник, аппендикс, нервы) или тазовой инфекции во время извлечения яйцеклеток. Наконец, (iii) традиционные схемы стимуляции связаны с супрафизиологическим сывороточным эстрадиолом и, следовательно, не рекомендуются при эстроген-чувствительных заболеваниях, таких как рак молочной железы. Протоколы с участием ингибиторов ароматазы (таких как летрозол или тамоксифен) более подходят в этих случаях20,21. В лабораторных условиях наиболее распространенным протоколом витрификации ооцитов по-прежнему является тот, который впервые описан Куваямой и его коллегами2,23,который состоит из поэтапной процедуры, включающей постепенное добавление криопротекторов (CPA). В первой фазе (равновесие/обезвоживание) ооциты подвергают воздействию в растворе CPA, содержащем 7,5% v/v этиленгликоля и 7,5% v/v диметилсульфоксида (DMSO), в то время как во второй фазе ооциты перемещают в раствор витрификации с 15% v/v этиленгликолем и 15% v/v DMSO, плюс 0,5 моль/л сахарозы. После короткой инкубации в среде витрификации ооциты могут быть помещены в специально разработанные открытые криодевицы и, наконец, погружены в жидкий азот при -196 °C для хранения до использования.

Здесь вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности была описана путем (i) изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультирования, (ii) сосредоточения внимания на экономической эффективности процедуры и (iii) описания наиболее подходящих стратегий для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов будут подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности. Поскольку в литературе существуют другие протоколы или адаптации этого протокола, репрезентативные результаты и разделы обсуждения этой рукописи применяются только к этой процедуре.

протокол

1. Разработка и клиническое консультирование

ПРИМЕЧАНИЕ: В случае пациентов, нуждающихся в сохранении фертильности по онкологическим причинам, убедитесь, что нет списка ожидания для назначения консультации, и запись на прием предоставляется как можно скорее.

  1. Изучите историю болезни и предыдущую документацию и оцените общее состояние здоровья пациента.
  2. Запишите всю информацию (включая согласие онколога на стимуляцию яичников у больных раком) в реляционную базу данных.
  3. Предоставьте пациенту конкретную консультацию о целесообразности процедуры. Объясните этапы процедуры (стимуляция яичников, извлечение ооцитов, витрификация ооцитов) и сообщите ей о реальных шансах на успех (в основном зависящих от возраста матери и ожидаемого количества ооцитов MII на момент извлечения ооцитов), а также о стоимости и ограничениях процедуры.
  4. Выполнить трансвагинальное УЗИ для получения информации о овариальном резерве (т.е. АФК) и оценить доступность яичников для забора яйцеклеток.
  5. Запросить анализы крови для оценки группы крови и резус-фактора, скрининга свертываемость крови (анализ крови, протромбин, тромбопластин, фибриноген, белок C, белок S, антитромбин III, гомоцистеин) и инфекционные заболевания (гепатит В, гепатит С, ВИЧ, Исследовательская лаборатория венерических заболеваний / Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае пациентов, обращающихся к программе сохранения фертильности по несрочной медицинской помощи, более всесторонняя оценка может включать базальный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), эстрадиол, АМГ, обследование молочной железы, тест Папаниколау, генетический скрининг коагуляции (фактор V Лейдена и протромбин) и скрининг TORCH (токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус).
  6. Закажите кардиологическое обследование (электрокардиограмму).
  7. Рекомендуем психологическую консультацию.

2. Контролируемые протоколы стимуляции яичников для сохранения фертильности

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда время, доступное до начала лечения рака, ограничено, протокол случайного запуска (т. Е. Начало стимуляции яичников в любое время в течение менструального цикла) рекомендуется для стимуляции яичников у онкологических пациентов, которые являются кандидатами на сохранение фертильности. В программе сохранения фертильности по несрочным медицинским или социальным причинам предпочтительнее обычная стимуляция, начинающаяся в ранней фолликулярной фазе, а стимуляция яичников начинается на основе менструального цикла. Подходы контролируемой стимуляции яичников (COS) должны выполняться в соответствии с недавними руководящими принципами Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE)24.

  1. Адаптируйте COS в соответствии с характеристиками пациента и маркерами овариалистного резерва, в основном материнского возраста, ФСГ, АМГ и АФК.
  2. Начинают КОС на 5 день менструального цикла с использованием рекомбинантного или мочевого ФСГ с фиксированной дозой 150-300 МЕ/сут (протокол антагониста).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конкретной популяции пациентов с дефицитом ЛГ или плохим неоптимальным ответом может быть введен дополнительный ЛГ 75/150 МЕ / день в соответствии с реакцией яичников, уровнями ЛГ и суждением гинеколога.
  3. У пациентов с эстроген-чувствительными заболеваниями включают гонадотропины, связанные с ингибиторами ароматазы (летрозол) с 1-го дня стимуляции до 7-го дня после извлечения ооцитов.
  4. Вводят фиксированную дозу гонадотропинов в течение 4 дней.
  5. Контролировать рост фолликулов на 5 день и затем каждые 2-3 дня; в конце концов, скорректируйте дозировку гонадотропина.
  6. Как только по меньшей мере 3 фолликула достигнут 17-18 мм в диаметре, вводят триггер для окончательного созревания ооцитов одним подкожным болюсом агониста ГнРГ в дозе 0,5 мл.

3. Извлечение ооцитов

  1. Подготовка к извлечению ооцитов
    1. Для необходимых материалов обратитесь к Таблице материалов и держите наготовелабораторную обувь и снаряжение, хирургическую маску для лица, чехол для волос, хирургические перчатки, постоянный нетоксиченный маркер, пинцет, стерильную мелкую марлю, одноразовое или многоразовое зеркало, оборудование для хирургии влагалища и дезинфицирующее средство для поверхности. Обеспечить наличие в операционной реанимационного оборудования, обезболивающих препаратов для реверса, набора, подготовленного для лечения анафилактического шока, кислорода.
    2. Выполнить процедуру извлечения ооцитов в соответствии с рекомендациями Рабочей группы ESHRE по ультразвуку в технологиях вспомогательной репродукции (ВРТ)25.
      1. Назначают сидацию или общую анестезию, а также антибиотики для профилактики.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе глубокая сакация была достигнута путем применения пропофола (дозировка которого корректируется в соответствии с весом пациента) и 50-100 мкг фентанила, 1000 мг парацетамола и вспомогательной маски с кислородом.
      2. Выполните извлечение ооцитов с помощью аспирационного блока, состоящего из вакуумного насоса, коллекторной трубки, соединенной с однопросветной иглой 17 G, и трубки, собирающей ооциты. Во время сбора не превышайте давление ~ 120 мм рт.ст., чтобы избежать риска повреждения ооцитов, такого как удаление кучевых клеток или разрыв зоны пеллюцидов.
      3. Откалибруют температуру рабочей поверхности для обеспечения 37 °C в культуральная среда. В течение всей процедуры минимизируйте воздействие ооцитов даже на переходную температуру, которая может повлиять на их компетентность в развитии.
      4. В конце извлечения яйцеклеток наблюдают за пациентом в течение 3-4 ч до выписки.
  2. Операционный зал
    1. Перед входом в операционную определите пациентку и подтвердите время срабатывания овуляции.
    2. Ложитесь пациенткой на операционный стол в гинекологическом положении.
    3. Очистите влагалище / шейку матки перед извлечением ооцитов, чтобы свести к минимуму бактериальное загрязнение.
    4. Выполните предварительное трансвагинальное УЗИ для оценки положения яичников и анатомических отношений с различными органами и кровеносными сосудами.
    5. Под ультразвуковым контролем введите однопросветную иглу через стенку влагалища и в фолликул яичника, заботясь о том, чтобы не повредить органы или кровеносные сосуды, расположенные между стенкой влагалища и яичниками.
    6. Начните аспирацию от ближайшего фолликула и переходите к самым дистальным.
    7. Прокалывают все фолликулы диаметром более 11-12 мм, выполняя «скручивающие движения» иглы для аспирации всей фолликулярной жидкости, которая затем выпускается в стерильную трубку (круглое дно 14 мл), предварительно нагретую в блок-нагреватель операционной.
    8. Сразу после извлечения запечатайте и наклейте на трубку этикетку с подробными сведениями о личности пациента.
    9. Убедитесь, что медсестра приносит трубку в лабораторию, где она немедленно проверяется на наличие кучевых-ооцитарных комплексов (КОК).
    10. Попросите эмбриологов проинформировать клинициста об общем количестве извлеченных КОК.
    11. Как только процедура будет завершена для первого яичники, промойте иглу чистой средой и приступайте ко второму яичнику, используя ту же процедуру.
    12. После извлечения ооцитов оцените любое кровотечение из яичников или кровеносных сосудов параметриума и свободной жидкости в мешочках Дугласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматизации и повышения эффективности прослеживаемости гамет и эмбрионов на клиническом уровне в центре26внедрена электронная система наблюдения (EWS). Тем не менее, в этом протоколе не упоминается EWS, чтобы обеспечить воспроизводимость протокола в любой лаборатории ЭКО. Тем не менее, учтите, что все этапы процедуры требуют второго оператора (т.е. свидетеля) для обеспечения прослеживаемости гамат и эмбрионов.

4. Лаборатория ЭКО

  1. За день до процедуры извлечения ооцитов
    1. Подготовьте пробирки для сбора ооцитов (см. Таблицу материалов).
      1. Дозировать 1 мл среды ЭКО (см. Таблицу материалов)в каждую трубку для сбора ооцитов (круглое дно, 5 мл) и покрыть 0,2 мл минерального масла (см. Таблицу материалов) для культивирования эмбрионов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество трубок будет определено в соответствии с количеством фолликулов, которые, как ожидается, будут извлечены. Каждая трубка может содержать до 4 КОК.
    2. Запечатайте трубки колпачком (первая защелка). Маркировка туб с подробными сведениями о типе среды и дате приготовления. Инкубируют трубки в течение ночи при 37 °C в контролируемой атмосфере (6% CO2,5% 02).
  2. В день забора ооцитов
    1. Предварительно прогреть пластик при 37 °C (стерильные культуральные блюда и пипетки Пастера).
    2. Попросите пациенток подтвердить свою личность (ФИО и дату рождения) и время запуска овуляции. Аннотировать на лабораторном листе, что процедура идентификации (ID) была выполнена, и что время запуска овуляции было подтверждено.
    3. Сняте трубки для сбора ооцитов из инкубатора (непосредственно перед началом процедуры) и опустите колпачок, чтобы обеспечить плотное закрытие. Пометьте трубки для сбора ооцитов информацией о пациенте. Поместите трубки для сбора ооцитов в блок-нагреватель при 37 °C.
    4. Исследуйте фолликулярную жидкость в предварительной стерильной культуре посуды и выявляйте КОК. Как только один или несколько КОК идентифицированы, промойте их дважды в двух каплях среды, чтобы удалить фолликулярную жидкость и загрязнение крови.
    5. Перенесите КОК в пробирки для сбора ооцитов и аннотируют количество КОК на трубке. Ослабьте колпачки средних трубок и быстро инкубируют их при 37 °C в атмосфере 6% CO2,5% O2.
    6. Повторите шаги с 7 по 9 в зависимости от количества извлеченных ооцитов. Обновите лабораторный лист.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свидетель проверяет, что все блоки подогрева труб (включая те, которые находятся в операционной) пусты, и подписывает закрытие процедуры на лабораторном листе.
    7. Протрите рабочую стадию после завершения процедуры.

5. Денудация ооцитов

  1. Дожимная 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота (HEPES)-буферная среда и гиалуронидаза (см. Таблицу материалов)при 37 °C не менее чем за 1 ч до начала.
  2. Подготовьте 4-скважинную пластину ЭКО (см. Таблицу материалов)с 0,6 мл / скважину предварительно располованной hePES-буферной среды (дополненной 5% сывороточного альбумина человека [HSA]), покрытую 0,3 мл минерального масла для культивирование эмбрионов, и прогрейте при 37 °C в течение не менее 30 минут.
  3. Пометьте пластину денудации ооцитов с подробными сведениями о личности пациента.
  4. Непосредственно перед началом процедуры добавляют гиалуронидазу в первую скважину для получения конечной концентрации около 20 МЕ/мл.
  5. Поместите ограниченное количество КОК (до 6) в первую скважину, содержащую фермент для диспергирования кучевых клеток.
  6. Чтобы усилить ферментативное удаление кучевых и коронных клеток, выполняют удаление кучевых клеток путем многократного пипетирования ооцитов через пипетку Пастера с внутренним диаметром примерно 250 мкм на срок до 30 с. После того, как наблюдается начальная диссоциация клеток, переносят ооциты во вторую скважину, содержащую только HEPES-буферную среду, заботясь о переносе минимального количества фермента.
  7. Выполняют дальнейшую денудацию для удаления коронных клеток с помощью оголенных пипеток с уменьшающимися внутренними диаметрами (170-145 мкм). Используйте меньшие диаметры (135 мкм) только в случае строгой необходимости.
  8. Тщательно промыть оголенные ооциты, чтобы вымыть фермент.
  9. После денудации исследуют ооциты под инвертным микроскопом, чтобы оценить их целостность и стадию созревания. Отделить ооциты МИИ от незрелых (зародышевый жизикул и метафаза-I).
  10. Переместите ооциты MII в область витрификации, чтобы немедленно выполнить криоконсервацию. Обновите лабораторный лист.

6. Витрификация ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводят витрификацию ооцитов предпочтительно в течение 38 ч после извлечения ооцитов и сразу после денудации. Описанная здесь процедура витрификации должна выполняться при комнатной температуре (RT) и с использованием пипетки стриппера с внутренним диаметром 170 мкм, чтобы не повредить ооциты во время манипуляции.

  1. Примерно за 30 мин до процедуры доведите раствор равновесия (ES) и раствор для витрификации (VS) до RT (25-27 °C).
  2. Правильно маркируйте криоустройства именем и удостоверением личности пациента, идентификатором лечения, датой замораживания, количеством ооцитов и криобаркодом.
  3. Заполните одноразовую охлаждающую стойку до верха свежим жидким азотом и начните процесс стерилизации.
  4. Наклейте на пластину витрификации (см. Таблицу материалов)имя и удостоверение личности пациента. Попросите свидетеля проверить правильность идентификации криоустройств.
  5. Тщательно переверняйте каждый флакон дважды, чтобы перемешать его содержимое перед использованием, и приготовьте крышку чашки Петри 6 мм с одной каплей 30 мкл hePES-буферной среды (с 5% HSA) и одной смежной каплей 30 мкл ES.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите капли непосредственно перед использованием, чтобы ограничить испарение среды.
  6. Используя пипетку стриппера диаметром 170 мкм, поместите ооциты (до 9) в первую каплю с наименьшим возможным объемом среды. Используя пипетку стриппера, создайте мост среды между каплей n.1 и n.2 для получения постепенного увеличения концентрации CPA(рисунок 1A).
  7. Инкубировать ооциты в первой капле в течение 3 минут. Добавьте третью каплю 30 мкл ES (n.3). Через 3 мин перенесите ооциты во вторую каплю ЭС и создайте средний мост между каплями n.3 и n.2(рисунок 1B). Инкубируют ооциты в капле n.3 в течение 3 мин.
  8. Во время инкубации добавьте одну каплю ЭС 30 мкл на каждое криодержание, которое будет использоваться (если необходимо криоконсервировать 9 ооцитов, поместите 3 капли ЭС с 3 ооцитами в каждую каплю ЭС). Переместите ооциты в чистый раствор ЭС и оставьте их на 6-9 мин (до тех пор, пока они не восстановят свой первоначальный размер после усадки)(рисунок 1С).
  9. Приготовьте блюдо из центрального колодца (60 х 15 мм) с 1 мл ВС. В конце первых 6 мин перенесите криоконсервированную яйцеклетку в раствор VS, высвобождая как можно меньше среды. Оставьте оциты в VS на 1 мин и тщательно вымойте их, переместив их снизу вверх посуды, чтобы удалить избыток ЭС.
  10. Примерно за 10 с до конца минуты инкубации поместите криодержа под микроскоп и отрегулируйте фокус на черную метку (т.е. кончик криодержа). Поместите ооциты на криополуча рядом с черной меткой с минимальным количеством VS(рисунок 2A).
  11. Отодвините пипетку стриппера подальше от ооцитов и удалите избыток среды VS(рисунок 2B)так, чтобы ооциты оставались покрытыми тонким слоем среды(рисунок 2C).
  12. Быстро погружайте криодержание в жидкий азот, быстро встряхивая его, чтобы удалить пузырьки воздуха с его поверхности. Задержите пинцетом защитный колпачок криоборца, и заполните его жидким азотом; затем вставьте в него криополице, сохраняя пропиленовые полоски в жидком азоте.
  13. Храните криодерживище в визиотрубе, предварительно помеченном информацией о пациенте. Обновите лабораторный лист.

7. Согревание ооцитов

  1. Примерно за 30 мин до процедуры нагрейте размораживающий раствор (TS), раствор для разведения (DS) и моющий раствор (WS) до RT (25-27 °C). Осторожно переверяйте каждый флакон дважды, чтобы перемешать его содержимое. Поместите 1 мл TS в центральную колодезную чашку Петри и разогрейте ее при 37 °C в течение не менее 1 ч перед началом процедуры.
  2. Маркировка всех пластиковых материалов с именем и удостоверением личности пациента и типом раствора. Попросите свидетеля подтвердить информацию пациента о криодевице.
  3. Для каждого криопрогреваемого криодержа подготовьте 6-скважинную пластину с 200 мкл DS в первой скважине и равным количеством WS во второй и третьей (названных WS1 и WS2 соответственно). Добавьте фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS) или стерильную воду в область за пределами скважин, чтобы предотвратить испарение.
  4. Выньте блюдо TS из инкубатора и поместите его под микроскоп. Отрегулируйте фокус микроскопа к центру чашки Петри.
  5. Осторожно скрутите и снимите защитный колпачок криодетизы, сохраняя при этом пропиленовые полоски в жидком азоте. Как можно быстрее перенесите криодерживатель из жидкого азота в ТС, чтобы избежать риска девитрификации и инициировать обратный отсчет (1 мин).
  6. Локализуйте ооциты, фокусируясь на кончике криополиции (т.е. черной метке). Используя пипетку-стриппер, освободите ооциты из криодержа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не аспирировать ооциты из криодержиссы; осторожно выпускайте некоторые медиа на них, пока они не перейдут в ТС.
  7. Используя пипетку стриппера диаметром 170 мкм, переведите ооциты в ДС с небольшим количеством TS (для создания градиента) и оставьте их в DS на 3 мин. Переместите ооциты в WS1 аналогично и оставьте их на 5 минут. Наконец, перенесите ооциты в WS2 в течение 1 мин.
  8. Переведите ооциты в соответствующую предварительно уравновешенную культурическую среду ЭКО и инкубируют их в течение 1 ч, прежде чем приступить к интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Обновите лабораторный лист.

Результаты

Обзор программы сохранения фертильности в центре

За 12-летний период (2008-2020 гг.) 285 женщин подверглись по крайней мере одному извлечению ооцитов, влекущего за собой витрификацию всей когорты собранных зрелых яйцеклеток. Большинство из этих женщин (n = 250) подверглис...

Обсуждение

Клинические соображения

Хотя новые стратегии, такие как криоконсервация ткани яичников и созревание in vitro, были изучены, витрификация ооцитов после COS является золотым стандартом для сохранения фертильности. В этом сценарии количество извлеченных и криоконсер...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Никакой

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Vacuum PumpCookK-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria DishCorning353803Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubesFalcon352001Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubesFalcon352003Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubatorEppendorfGalaxy 14S
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum AlbuminthermoFisher Scietific9988
HyaluronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dishFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum AlbuminFujifilm Irvine Scientific9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kitFujifilm Irvine Scientific90133-so2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
SAtripping pipette tips (300µm)CookK-FPIP-1300-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kitFujifilm Irvine Scientific90137-so4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

Ссылки

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175IIKPI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены