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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt. Geeignete klinische und Laborstrategien gewährleisten maximale Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit von Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlungen.

Zusammenfassung

Die Erhaltung der weiblichen Fruchtbarkeit ist in einem multifunktionalen Gesundheitssystem, das sich um die zukünftige Lebensqualität der Patienten kümmert, von entscheidender Bedeutung. Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen. Die wichtigsten medizinischen Indikationen sind onkologische Erkrankungen, gynäkologische Erkrankungen wie schwere Endometriose, systemische Erkrankungen, die die Eierstockreserve beeinträchtigen, und genetische Erkrankungen mit vorzeitiger Menopause. Dieses Papier beschreibt die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung, indem es Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert. Darüber hinaus konzentriert es sich auf die Wirksamkeit des Verfahrens und beschreibt die am besten geeigneten Strategien, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen wurden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben.

Einleitung

Die Entwicklung und Implementierung eines effizienten Kryokonservierungsprogramms für menschliche Eizellen war ein bedeutender Durchbruch in der Reproduktionsmedizin. Jüngsten Erkenntnissen zufolge ist die Vitrifikation die effektivste Strategie zur Kryokonservierung von Eizellen der Metaphase II (MII), da sie unabhängig von der Patientenpopulation (unfruchtbare Patientinnen oder Eizellspendeprogramm) zu statistisch höheren Überlebensraten im Vergleich zum langsamen Einfrieren führt1,2,3. Die bemerkenswerten Errungenschaften der Eizellvitrifikation veranlassten die Praxiskomitees der American Society for Reproductive Medicine (ASRM) und der Society for Assisted Reproductive Technology (SART), diese Technik als die effektivste für die elektive Fruchtbarkeitserhaltung bei postpubertären Frauen zu erklären, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen4,5,6. Medizinische Indikationen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit umfassen (i) Krebs und Autoimmunerkrankungen, die Therapien7 wie Strahlentherapie, zytotoxische Chemotherapie und endokrine Therapie erfordern (deren schädliche Wirkung auf die Eierstockreserve mit dem Alter der Mutter sowie art und dosis der Behandlung verbunden ist); ii) Eierstockerkrankungen, die eine wiederholte oder radikale Operation erfordern (z. B. Endometriose)8; und (iii) genetische Erkrankungen (z. B. X-fragile) oder vorzeitiges Ovarialversagen. Darüber hinaus ist die Erhaltung der Fruchtbarkeit zu einer wertvollen Option für alle Frauen geworden, die ihr elterliches Ziel aus nicht-medizinischen Gründen nicht erreicht haben (auch bekannt als Social Freezing).

Unabhängig von der Indikation zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und gemäß den wichtigsten internationalen Richtlinien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sollten alle Patientinnen, die bereit sind, ihre Eizellen zu vitrifizieren, eine angemessene Beratung erhalten, um über ihre realistischen Erfolgschancen, die Kosten, Risiken und Einschränkungen des Verfahrens informiert zu werden9,10,11,12,13. Am wichtigsten ist, dass klar sein sollte, dass die Vitrifizierung einer Kohorte von MII-Eizellen keine Schwangerschaft gewährleistet, sondern dass sie eine höhere Erfolgschance für die zukünftige In-vitro-Fertilisation (IVF) bietet, falls erforderlich14. In dieser Hinsicht ist das Alter der Frau zum Zeitpunkt der Vitrifizierung der Eizellen sicherlich der wichtigste limitierende Faktor15, da das fortgeschrittene mütterliche Alter (AMA; >35 Jahre) die Hauptursache für weibliche Unfruchtbarkeit ist16. Neben einer fortschreitenden Verringerung der Ovarialreserve ist AMA mit einer Beeinträchtigung der Eizellkompetenz aufgrund defekter physiologischer Wege wie Stoffwechsel, epigenetische Regulation, Zellzyklus-Checkpoints und meiotische Segregation verbunden17. Daher hängt die angemessene Anzahl der zu vitrifizierenden Eier hauptsächlich vom Alter der Mutter ab. Bei Frauen unter 36 Jahren sind mindestens 8-10 MII-Eizellen18 erforderlich, um die Erfolgschancen zu maximieren. Im Allgemeinen gilt: Je höher die Anzahl der vitrifizierten Eizellen, desto höher ist die Erfolgswahrscheinlichkeit. Daher ist die Anpassung der ovariellen Stimulation an ovariellen Reservemarkern wie Anti-Müller-Hormon (AMH) oder Antralfollikelzahl (AFC) entscheidend, um die Eierstockreserve in kürzester Zeit voll auszuschöpfen.

Die Sicherheit des gesamten Verfahrens ist das andere Schlüsselthema bei der Aufnahme von Patienten zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Kliniker sollten die besten Strategien anwenden, um die Risiken zu minimieren und (i) das ovarielle Hyperstimulationssyndrom (OHSS) zu verhindern, indem sie sichere Ansätze wie das Gonadotrophin-Releasing-Hormon (GnRH) -Antagonistenprotokoll verwenden, gefolgt von einem GnRH-Agonistenauslöser19 und (ii) den entfernten, aber möglichen Risiken von Peritonealblutungen, Verletzungen der Beckenstrukturen (Harnleiter, Darm, Blinddarm, Nerven) oder Beckeninfektionen während der Eizellentnahme. Schließlich (iii) traditionelle Stimulationsschemata sind mit supraphysiologischem Serumestradiol verbunden und werden daher bei östrogenempfindlichen Erkrankungen wie Brustkrebs nicht empfohlen. Protokolle mit Aromatasehemmern (wie Letrozol oder Tamoxifen) sind in diesen Fällen besser geeignet20,21. Im Labor ist das am weitesten verbreitete Protokoll zur Vitrifikation von Eizellen immer noch das von Kuwayama und Kollegen 2,23beschriebene Protokoll, das auseinemschrittweisen Verfahren besteht, bei dem Kryoprotektoren (CPAs) schrittweise hinzugefügt werden. In der ersten Phase (Gleichgewicht/Dehydratation) werden Eizellen in einer CPA-Lösung exponiert, die 7,5% v/v Ethylenglykol und 7,5% v/v Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält, während in der zweiten Phase Eizellen in eine Vitrifikationslösung mit 15% v/v Ethylenglykol und 15% v/v DMSO plus 0,5 mol/L Saccharose bewegt werden. Nach einer kurzen Inkubation im Medium der Vitrifikation können die Eizellen in speziell entwickelte, offene Kryodevices gelegt und schließlich bei -196 °C in flüssigen Stickstoff getaucht werden, um bis zur Verwendung gelagert zu werden.

Hier wurde die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung beschrieben, indem (i) Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert wurden, (ii) die Kosteneffizienz des Verfahrens im Mittelpunkt stand und (iii) die am besten geeigneten Strategien beschrieben wurden, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen werden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben. Da andere Protokolle oder Anpassungen dieses Protokolls in der Literatur existieren, gelten die repräsentativen Ergebnisse und die Diskussionsabschnitte dieses Manuskripts nur für dieses Verfahren.

Protokoll

1. Aufarbeitung und klinische Beratung

HINWEIS: Im Falle von Patienten, die aus onkologischen Gründen eine Erhaltung der Fruchtbarkeit benötigen, stellen Sie sicher, dass es keine Warteliste für die Planung der Konsultation gibt und der Termin so schnell wie möglich zur Verfügung gestellt wird.

  1. Untersuchen Sie die Krankengeschichte und die vorherige Dokumentation und beurteilen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten.
  2. Zeichnen Sie alle Informationen (einschließlich der Genehmigung des Onkologen zur Stimulation der Eierstöcke bei Krebspatienten) in einer relationalen Datenbank auf.
  3. Bieten Sie dem Patienten eine spezifische Beratung über die Machbarkeit des Verfahrens. Erklären Sie die Schritte des Verfahrens (Stimulation der Eierstöcke, Eizellentnahme, Vitrifikation der Eizellen) und informieren Sie sie über die realistischen Erfolgschancen (hauptsächlich abhängig vom Alter der Mutter und der erwarteten Anzahl von MII-Eizellen zum Zeitpunkt der Eizellentnahme) sowie die Kosten und Einschränkungen des Verfahrens.
  4. Führen Sie einen transvaginalen Ultraschall durch, um Informationen über die Eierstockreserve (z. B. AFC) zu erhalten und die Zugänglichkeit der Eierstöcke für die Eizellentnahme zu beurteilen.
  5. Fordern Sie Bluttests zur Beurteilung der Blutgruppe und des Rhesusfaktors, des Gerinnungsscreenings (Blutbild, Prothrombin, Thromboplastin, Fibrinogen, Protein C, Protein S, Antithromboin III, Homocystein) und Infektionskrankheiten (Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Venereal Disease Research Laboratory / Treponema pallidum Hemagglutination Assay) an.
    HINWEIS: Im Falle von Patienten, die aus nicht dringenden medizinischen Gründen auf ein Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm zugreifen, kann eine umfassendere Beurteilung basalfollikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Östradiol, AMH, Brustuntersuchung, Papanicolaou-Test, genetisches Screening der Gerinnung (Faktor V von Leiden und Prothrombin) und TORCH-Screening (Toxoplasmose, Röteln, Cytomegalievirus) umfassen.
  6. Fordern Sie eine kardiologische Beurteilung (Elektrokardiogramm) an.
  7. Empfehlen Sie psychologische Beratung.

2. Kontrollierte Stimulationsprotokolle der Eierstöcke zur Erhaltung der Fruchtbarkeit

HINWEIS: Wenn die verfügbare Zeit vor Beginn der Krebsbehandlung begrenzt ist, wird das Random-Start-Protokoll (d. H. Beginn der ovariellen Stimulation zu jeder Zeit während des Menstruationszyklus) für die Stimulation der Eierstöcke bei onkologischen Patientinnen empfohlen, die Kandidaten für die Erhaltung der Fruchtbarkeit sind. In einem Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm aus nicht dringenden medizinischen oder sozialen Gründen ist eine konventionelle Stimulation ab der frühen Follikelphase vorzuziehen, und die Stimulation der Eierstöcke wird basierend auf dem Menstruationszyklus begonnen. Ansätze zur kontrollierten Ovarialstimulation (COS) sollten gemäß den jüngsten Richtlinien der Europäischen Gesellschaft für menschliche Reproduktion und Embryologie (ESHRE)24durchgeführt werden.

  1. Passen Sie COS an die Eigenschaften der Patientin und die Reservemarker der Eierstöcke an, hauptsächlich an das Alter der Mutter, FSH, AMH und AFC.
  2. Beginnen Sie COS am Tag 5 des Menstruationszyklus mit rekombinantem oder harnärem FSH mit einer festen Dosis von 150-300 IE / Tag (Antagonistenprotokoll).
    HINWEIS: In einer bestimmten Patientenpopulation mit LH-Mangel oder schlecht-suboptimalem Ansprechen kann zusätzliche LH 75/150 IE / Tag entsprechend der Ovarialreaktion, dem LH-Spiegel und dem Urteil des Gynäkologen verabreicht werden.
  3. Bei Patienten mit östrogenempfindlichen Erkrankungen gehören Gonadotropine, die mit Aromatasehemmern (Letrozol) vom Tag 1 der Stimulation bis zum Tag 7 nach der Eizellentnahme assoziiert sind.
  4. Verabreichen Sie eine feste Dosis Gonadotropine für 4 Tage.
  5. Überwachen Sie das Follikelwachstum am Tag 5 und dann alle 2-3 Tage; Passen Sie schließlich die Gonadotropin-Dosierung an.
  6. Sobald mindestens 3 Follikel einen Durchmesser von 17-18 mm erreicht haben, verabreichen Sie den Auslöser für die endgültige Eizellreifung mit einem einzigen subkutanen Bolus des GnRH-Agonisten in der Dosis von 0,5 ml.

3. Eizellentnahme

  1. Vorbereitung auf die Eizellentnahme
    1. Für die erforderlichen Materialien, lesen Sie die Tabelle der Materialienund halten Sie Laborschuhe und -outfit, chirurgische Gesichtsmaske, Haarabdeckung, chirurgische Handschuhe, einen permanenten ungiftigen Marker, Pinzetten, sterile kleine Gazen, Einweg- oder wiederverwendbare Spekulum, vaginale chirurgische Geräte und Oberflächendesinfektionsmittel bereit. Stellen Sie die Verfügbarkeit von Wiederbelebungsgeräten, Anästhetika zur Umkehrung, einem für die Behandlung von anaphylaktischen Schocks vorbereiteten Kit und Sauerstoff im Operationssaal sicher.
    2. Führen Sie das Eizellentnahmeverfahren gemäß den Empfehlungen der ESHRE-Arbeitsgruppe für Ultraschall in assistierten Reproduktionstechnologien (ART)25 durch.
      1. Sedierung oder Vollnarkose und Antibiotika zur Prophylaxe verabreichen.
        HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine tiefe Sedierung durch die Gabe von Propofol (dessen Dosierung je nach Gewicht des Patienten angepasst wird) und 50-100 μg Fentanyl, 1000 mg Paracetamol und assistierte Maskenbeatmung mit Sauerstoff erreicht.
      2. Führen Sie die Eizellentnahme mit einer Aspirationseinheit durch, die aus einer Vakuumpumpe, einem Sammelrohr, das mit einer 17-G-Einlumennadel verbunden ist, und einem Eizellensammelschlauch besteht. Überschreiten Sie während der Entnahme nicht einen Druck von ~ 120 mmHg, um das Risiko einer Schädigung der Eizellen wie das Abstreifen der Kumuluszellen oder das Brechen der Zona pellucida zu vermeiden.
      3. Kalibrieren Sie die Arbeitsoberflächentemperatur, um 37 °C in den Nährmedien sicherzustellen. Minimieren Sie während des gesamten Verfahrens die Exposition der Eizellen gegenüber einer temperaturbeglichen Temperatur, die ihre Entwicklungskompetenz beeinträchtigen kann.
      4. Beobachten Sie die Patientin am Ende der Eizellentnahme 3-4 Stunden vor der Entlassung.
  2. Operationssaal
    1. Bevor Sie den Operationssaal betreten, identifizieren Sie den Patienten und bestätigen Sie den Zeitpunkt des Eisprungauslösers.
    2. Lassen Sie die Patientin in gynäkologischer Position auf dem Operationstisch liegen.
    3. Reinigen Sie die Vagina / den Gebärmutterhals vor der Eizellentnahme, um die bakterielle Kontamination zu minimieren.
    4. Führen Sie einen vorläufigen transvaginalen Ultraschall durch, um die Position der Eierstöcke und die anatomischen Beziehungen zu den verschiedenen Organen und Blutgefäßen zu beurteilen.
    5. Führen Sie unter Ultraschallführung eine Ein-Lumen-Nadel durch die Vaginalwand und in einen Eierstockfollikel ein, wobei Sie darauf achten, die Organe oder Blutgefäße zwischen der Vaginalwand und dem Eierstock nicht zu verletzen.
    6. Beginnen Sie mit der Aspiration vom nächsten Follikel aus und gehen Sie zu den distalsten über.
    7. Punktieren Sie alle Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 11-12 mm und führen Sie "Drehbewegungen" der Nadel durch, um die gesamte Follikelflüssigkeit abzusaugen, die dann in ein steriles Rohr (runder Boden 14 ml) freigesetzt wird, das in der Blockheizung des Operationssaals vorgewärmt wird.
    8. Versiegeln und beschriften Sie den Schlauch unmittelbar nach der Entnahme mit Details zur Identität des Patienten.
    9. Stellen Sie sicher, dass die Krankenschwester die Röhre ins Labor bringt, wo sie sofort auf das Vorhandensein von Kumulus-Eizell-Komplexen (COCs) untersucht wird.
    10. Weisen Sie die Embryologen an, den Kliniker über die Gesamtzahl der abgerufenen COCs zu informieren.
    11. Sobald der Eingriff für den ersten Eierstock abgeschlossen ist, spülen Sie die Nadel mit sauberem Medium und fahren Sie mit dem zweiten Eierstock mit dem gleichen Verfahren fort.
    12. Bewerten Sie nach der Eizellentnahme blutungen aus den Eierstöcken oder Blutgefäßen des Parametriums und der freien Flüssigkeit im Beutel von Douglas.
      HINWEIS: Um die Wirksamkeit der Rückverfolgbarkeit von Gameten und Embryonen auf klinischer Ebene zu automatisieren und zu verbessern, wurde im Zentrum ein elektronisches Zeugensystem (EWS) implementiert26. Dennoch erwähnt dieses Protokoll nicht das EWS, um die Reproduzierbarkeit des Protokolls in jedem IVF-Labor zu gewährleisten. Bedenken Sie jedoch, dass alle Schritte des Verfahrens einen zweiten Bediener (d. H. Einen Zeugen) erfordern, um die Rückverfolgbarkeit von Gameten und Embryonen zu gewährleisten.

4. IVF-Labor

  1. Am Tag vor der Eizellentnahme
    1. Bereiten Sie Eizellensammelröhrchen vor (siehe Materialtabelle).
      1. Geben Sie 1 ml IVF-Medium (siehe Materialtabelle)in jedes Eizellensammelröhrchen (runder Boden, 5 ml) und bedecken Sie es mit 0,2 ml Mineralöl (siehe Materialtabelle)für die Embryokultur.
        HINWEIS: Die Anzahl der Röhrchen wird entsprechend der Anzahl der Follikel definiert, die voraussichtlich abgerufen werden. Jede Tube kann bis zu 4 COCs enthalten.
    2. Verschließen Sie die Schläuche mit der Kappe (erster Schnappschuss). Beschriften Sie die Röhrchen mit Angaben zur Art des Mediums und zum Herstellungsdatum. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 °C in kontrollierter Atmosphäre (6% CO2, 5% 02).
  2. Am Tag der Eizellentnahme
    1. Die Kunststoffvorräte bei 37 °C vorwärmen (sterile Kulturschalen und Pasteur-Pipetten).
    2. Bitten Sie die Patientinnen, ihre Identität (vollständiger Name und Geburtsdatum) und den Zeitpunkt des Eisprungauslösers zu bestätigen. Kommentieren Sie auf dem Laborblatt, dass das Identifizierungsverfahren (ID) durchgeführt wurde und dass der Zeitpunkt des Eisprungauslösers bestätigt wurde.
    3. Nehmen Sie die Eizellensammelröhrchen aus dem Inkubator (kurz vor Beginn des Eingriffs) und drücken Sie die Kappe nach unten, um einen festen Verschluss zu gewährleisten. Beschriften Sie die Eizellentnahmeröhrchen mit den Informationen der Patientin. Legen Sie die Eizellensammelröhrchen bei 37 °C in die Blockheizung.
    4. Untersuchen Sie die Follikelflüssigkeit in den vorgewarmten sterilen Kulturschalen und identifizieren Sie COCs. Sobald ein oder mehrere COCs identifiziert sind, spülen Sie sie zweimal in zwei Tropfen Medium, um die Follikelflüssigkeit und die Blutkontamination zu entfernen.
    5. Übertragen Sie die COCs in die Eizellensammelröhrchen und kommentieren Sie die Anzahl der COCs auf der Tube. Lösen Sie die Kappen der Mediumröhrchen und inkubieren Sie sie umgehend bei 37 °C in einer Atmosphäre von 6%CO2,5%O2.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 7 bis 9 entsprechend der Anzahl der entnommenen Eizellen. Aktualisieren Sie das Laborblatt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass ein Zeuge überprüft, ob alle Röhrenerwärmungsblöcke (einschließlich der im Operationssaal) leer sind und den Abschluss des Verfahrens auf dem Laborblatt unterschreibt.
    7. Wischen Sie die Arbeitsphase nach Abschluss des Vorgangs ab.

5. Eizelldenudation

  1. Vorwarmes 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-gepuffertes Medium und Hyaluronidase (siehe Materialtabelle)bei 37 °C mindestens 1 h vor Beginn.
  2. Bereiten Sie eine 4-Well-IVF-Platte (siehe Materialtabelle)mit 0,6 ml /Vertiefung vorgewärmtem HEPES-gepuffertem Medium (ergänzt mit 5% humanem Serumalbumin [HSA]) vor, das mit 0,3 ml Mineralöl für die Embryokultur bedeckt ist, und erwärmen Sie es bei 37 °C für mindestens 30 Minuten.
  3. Beschriften Sie die Eizelldenudationsplatte mit Details zur Identität der Patientin.
  4. Unmittelbar vor Beginn des Verfahrens hyaluronidase in die erste Vertiefung geben, um eine Endkonzentration von etwa 20 IE / ml zu erhalten.
  5. Legen Sie eine begrenzte Anzahl von COCs (bis zu 6) in die erste Vertiefung, die das Enzym enthält, um die Kumuluszellen zu dispergieren.
  6. Um die enzymatische Entfernung der Kumulus- und Koronazellen zu verbessern, führen Sie das von Kumuluszellen durch, indem Sie die Eizellen wiederholt durch eine Pasteur-Pipette mit einem Innendurchmesser von etwa 250 μm für bis zu 30 s pipettieren. Nachdem eine anfängliche Zelldissoziation beobachtet wurde, übertragen Sie die Eizellen in die zweite Vertiefung, die nur HEPES-gepuffertes Medium enthält, und achten Sie darauf, eine minimale Menge des Enzyms zu transportieren.
  7. Führen Sie eine weitere Denudation durch, um die Koronazellen zu entfernen, indem Sie Entwundungspipetten mit abnehmenden Innendurchmessern (170-145 μm) verwenden. Verwenden Sie niedrigere Durchmesser (135μm) nur, wenn dies unbedingt erforderlich ist.
  8. Waschen Sie die entzähten Eizellen vorsichtig, um das Enzym auszuwaschen.
  9. Untersuchen Sie nach der Denudation die Eizellen unter einem invertierten Mikroskop, um ihre Integrität und ihr Reifestadium zu beurteilen. Trennen Sie MII-Eizellen von den unreifen (Keimbläschen und Metaphase-I).
  10. Bewegen Sie die MII-Eizellen in den Vitrifikationsbereich, um sofort eine Kryokonservierung durchzuführen. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

6. Vitrifikation der Eizellen

HINWEIS: Führen Sie die Eizellvitrifikation vorzugsweise innerhalb von 38 h nach der Eizellentnahme und unmittelbar nach der Denudation durch. Das hier beschriebene Vitrifikationsverfahren muss bei Raumtemperatur (RT) und unter Verwendung einer Stripperpipette mit einem Innendurchmesser von 170 μm durchgeführt werden, um Eizellen bei der Manipulation nicht zu beschädigen.

  1. Ca. 30 minuten vor dem Eingriff die Gleichgewichtslösung (ES) und die Vitrifikationslösung (VS) auf RT (25-27 °C) bringen.
  2. Beschriften Sie die Kryodevices ordnungsgemäß mit dem Namen und der ID der Patientin, der Behandlungs-ID, dem Datum des Einfrierens, der Anzahl der Eizellen und dem Kryobarcode.
  3. Füllen Sie ein Einweg-Kühlregal bis oben mit frischem flüssigem Stickstoff und starten Sie den Sterilisationsprozess.
  4. Beschriften Sie die Vitrifikationsplatte (siehe Materialtabelle)mit dem Namen und der ID des Patienten. Bitten Sie einen Zeugen, die korrekte ID der Kryodevices zu überprüfen.
  5. Kehren Sie jede Durchstechflasche vorsichtig zweimal um, um ihren Inhalt vor Gebrauch zu mischen, und bereiten Sie den Deckel einer 6 mm Petrischale mit einem Tropfen 30 μL HEPES-gepuffertes Medium (mit 5% HSA) und einem angrenzenden Tropfen von 30 μL ES vor.
    HINWEIS: Legen Sie Tropfen kurz vor dem Gebrauch, um die mittlere Verdunstung zu begrenzen.
  6. Legen Sie die Eizellen (bis zu 9) mit einer Stripperpipette mit einem Durchmesser von 170 μm in den ersten Tropfen mit einem möglichst kleinen Mediumsvolumen. Erzeugen Sie mit der Stripperpipette eine Mediumsbrücke zwischen dem Tropfen Nr. 1 und n.2, um eine allmähliche Erhöhung der Konzentration der CPAs zu erhalten (Abbildung 1A).
  7. Inkubieren Sie die Eizellen im ersten Tropfen für 3 Minuten. Fügen Sie einen dritten Tropfen 30 μL ES (n.3) hinzu. Nach 3 min die Eizellen in den zweiten ES-Tropfen geben und eine mittlere Brücke zwischen den Tropfen n.3 und n.2 schaffen (Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Eizellen in Tropfen n.3 für 3 min.
  8. Fügen Sie während der Inkubation einen 30 μL-Tropfen ES für jedes kryodevice hinzu, das verwendet wird (wenn 9 Eizellen kryokonserviert werden sollen, legen Sie 3 Tropfen ES mit 3 Eizellen in jeden Tropfen ES). Bewegen Sie die Eizellen in reine ES-Lösung und lassen Sie sie für 6-9 Minuten (bis sie nach dem Schrumpfen ihre ursprüngliche Größe wiedererlangen) (Abbildung 1C).
  9. Bereiten Sie ein zentrales Brunnengericht (60 x 15 mm) mit 1 ml VS zu. Am Ende der ersten 6 Minuten werden die kryokonservierten Eizellen in die VS-Lösung übertragen und so wenig Medium wie möglich freigesetzt. Lassen Sie die Eizellen für 1 Minute in VS und waschen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie von unten nach oben in der Schüssel bewegen, um den Überschuss an ES zu entfernen.
  10. Etwa 10 s vor dem Ende der Inkubationsminute legen Sie das Kryodevice unter das Mikroskop und stellen den Fokus auf die schwarze Markierung (dh die Spitze des Kryodevics) ein. Legen Sie die Eizellen auf das Kryodevic neben der schwarzen Markierung mit der minimalen Menge an VS (Abbildung 2A).
  11. Bewegen Sie die Stripperpipette von den Eizellen weg und entfernen Sie den Überschuss an VS-Medium (Abbildung 2B), so dass die Eizellen von einer dünnen Mediumschicht bedeckt bleiben (Abbildung 2C).
  12. Tauchen Sie das Kryodevic schnell in flüssigen Stickstoff und schütteln Sie es schnell, um Luftblasen von seiner Oberfläche zu entfernen. Halten Sie die Schutzkappe des Kryodevics mit einer Pinzette und füllen Sie sie mit flüssigem Stickstoff; Dann führen Sie das Kryodevic ein, während die Propylenstreifen in flüssigem Stickstoff gehalten werden.
  13. Bewahren Sie das Kryodevic in einer Visiotube auf, die zuvor mit den Informationen des Patienten beschriftet war. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

7. Eizellerwärmung

  1. Ca. 30 minuten vor dem Eingriff die Auftaulösung (TS), die Verdünnungslösung (DS) und die Waschlösung (WS) auf RT (25-27 °C) erwärmen. Kehren Sie jede Durchstechflasche vorsichtig zweimal um, um ihren Inhalt zu mischen. 1 ml TS in eine zentrale Petrischale geben und bei 37 °C erwärmen, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
  2. Kennzeichnen Sie alle Kunststoffzubehörteile mit dem Namen und der ID des Patienten und der Art der Lösung. Bitten Sie einen Zeugen, die Informationen des Patienten über das Kryodevic zu bestätigen.
  3. Bereiten Sie für jedes zu erwärmende Kryodevice eine 6-Well-Platte mit 200 μL DS in der ersten Vertiefung und einer gleichen Menge WS in der zweiten und dritten (genannt WS1 bzw. WS2) vor. Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder steriles Wasser im Bereich außerhalb der Brunnen hinzu, um eine Verdunstung zu verhindern.
  4. Nehmen Sie die TS-Schale aus dem Inkubator und legen Sie sie unter das Mikroskop. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops auf die Mitte der Petrischale ein.
  5. Drehen und entfernen Sie vorsichtig die Schutzkappe des Kryodevics, während die Propylenstreifen in flüssigem Stickstoff gehalten werden. Übertragen Sie das Kryodevic aus flüssigem Stickstoff so schnell wie möglich in das TS, um das Risiko einer Devitrifikation zu vermeiden und den Countdown (1 min) einzuleiten.
  6. Lokalisieren Sie die Eizellen, indem Sie sich auf die Spitze des Kryodevics (dh die schwarze Markierung) konzentrieren. Lösen Sie mit einer Stripperpipette die Eizellen aus dem Kryodevic.
    HINWEIS: Versuchen Sie, die Eizellen nicht aus dem Kryodevic zu aspirieren; Geben Sie vorsichtig einige Medien auf ihnen ab, bis sie in den TS übergehen.
  7. Übertragen Sie die Eizellen mit einer Stripperpipette mit einem Durchmesser von 170 μm mit einer kleinen Menge TS (um einen Gradienten zu erzeugen) auf DS und lassen Sie sie für 3 min im DS. Bewegen Sie die Eizellen ebenfalls zu WS1 und lassen Sie sie für 5 minuten. Zum Schluss die Eizellen für 1 min auf WS2 übertragen.
  8. Übertragen Sie die Eizellen in ein geeignetes vorgleiches IVF-Kulturmedium und inkubieren Sie sie für 1 h, bevor Sie mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) fortfahren. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

Ergebnisse

Überblick über das Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm im Zentrum

Über einen Zeitraum von 12 Jahren (2008-2020) wurden 285 Frauen mindestens einer Eizellentnahme unterzogen, was die Vitrifizierung der gesamten Kohorte der gesammelten reifen Eizellen beinhaltete. Die meisten dieser Frauen (n = 250) wurden einer einzigen Entnahme unterzogen, und 35 wurden mehreren Abrufen unterzogen. Die Gründe für die Eizellentnahme zur Vitrifizierung von Eizellen sind in 4 Kategorien zusamme...

Diskussion

Klinische Überlegungen

Obwohl neue Strategien wie die Kryokonservierung von Eierstockgewebe und die In-vitro-Reifung erforscht wurden, ist die Vitrifikation von Eizellen nach COS die Goldstandardtechnik zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. In diesem Szenario sollte die Anzahl der entnommenen und kryokonservierten Eizellen in kürzester Zeit maximiert werden, da die meisten Krebspatientinnen möglicherweise nur von einem Eierstockzyklus profitieren, bevor sie mit ihrer Krebsbehan...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Nichts

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Vacuum PumpCookK-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria DishCorning353803Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubesFalcon352001Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubesFalcon352003Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubatorEppendorfGalaxy 14S
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum AlbuminthermoFisher Scietific9988
HyaluronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dishFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum AlbuminFujifilm Irvine Scientific9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kitFujifilm Irvine Scientific90133-so2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
SAtripping pipette tips (300µm)CookK-FPIP-1300-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kitFujifilm Irvine Scientific90137-so4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

Referenzen

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