研究斑马鱼脊椎动物分割的三维尾部外植培养

摘要

在这里，我们介绍了斑马鱼后体轴的三维组织培养方案，从而能够对脊椎动物分割进行实时研究。此除草模型可控制轴伸长、形态源的改变以及细胞下分辨率组织水平的实时成像。

摘要

脊椎动物胚胎将它们的主要身体轴图案为重复性索米特，椎骨、肌肉和皮肤的前体。当胚胎的尾端后拉长时，从前体间皮（PSM）逐渐分割。索米特形成定期和规模。斑马鱼是一种流行的模型生物体，因为它具有遗传可遗传性，并具有透明的胚胎，允许活成像。然而，在蛋黄化过程中，鱼胚胎被包裹在一个大的四舍五入的蛋黄上。此几何形状限制斑马鱼胚胎中 PSM 组织的实时成像，尤其是在需要接近客观工作距离的更高分辨率下。在这里，我们介绍了一个扁平的三维组织培养方法，用于斑马鱼尾部外植的活成像。尾部外植模仿完整的胚胎，显示轴伸长和缩短罗斯特罗考德索米特长度的比例减慢。我们进一步能够通过去除植物培养来拖延轴伸长速度。这首次使我们能够从轴向拉伸的机械输入中解开信号梯度的化学输入。在未来的研究中，这种方法可以与微流体设置相结合，允许时间控制的药物扰动或脊椎动物分割筛查，而无需任何药物渗透问题。

引言

美洲生物分割在自然界中被广泛使用。重复的结构对于横向器官的功能至关重要，如椎骨、肌肉、神经、血管、四肢或身体平面图¹中的叶子。由于轴向对称性的生理和几何约束，大多数比拉特里亚的植物，如安妮莉德，节肢动物，和弦-展览分割他们的胚胎组织（如，等，中皮），前后。

脊椎动物胚胎沿着主身体轴依次将它们的半轴线分割成具有物种特异性间隔、计数和大小分布的草体。尽管在一个物种的个体胚胎中具有这种健壮性，但脊椎动物物种之间的软体分割是多才多艺的。细分发生在一个巨大的时间间隔（从斑马鱼的25分钟到人类的5小时），大小（从斑马鱼尾部的约20微米到小鼠的躯干隐士的200μm）和计数（从斑马鱼的32到玉米蛇的^300）2。更有趣的是，鱼胚胎可以在广泛的温度下发育（斑马鱼从 +20.5 °C 到 34 °C），同时通过补偿分割间隔和轴向拉长速度来保持其母体完好无损，并具有适当的大小分布。除了这些有趣的特征外，斑马鱼还作为一个有用的模型生物体来研究脊椎动物的分割，因为兄弟姐妹胚胎的外在、同步和透明发育以及它们可访问的遗传工具。从显微镜的角度来看，电传胚胎在笨重的球形蛋黄上发育，伸展和四舍五入周围的胃结组织（图1A）。在本文中，我们介绍了斑马鱼尾巴的扁平三维组织去移植培养物。这种去植系统绕过了蛋黄质量的球形约束，允许获得鱼胚胎的高分辨率活成像，用于蛋黄图案。

图1:斑马鱼胚胎的滑动室外植系统。（A）斑马鱼胚胎具有活成像的优点，如气化胚胎组织（蓝色）的透明度，但组织围绕一个笨重的球形蛋黄质量（黄色）形成，防止在完整的胚胎中进行近乎客观的高分辨率成像。尾部除外植物可以解剖，从从索米特（红色）组织前部切开的显微外科刀（棕色）开始，然后继续与蛋黄的边界。（B） 解剖的尾部系外植物可放在盖片（浅蓝色）逆向上:保持神经组织（浅灰色）在顶部和诺索德（深灰色）在底部。请单击此处查看此图的较大版本。

研究方案

该协议涉及使用受精后不到1天的活脊椎动物胚胎。所有的动物实验都是在辛辛那提儿童医院医疗中心的道德准则下进行的:动物议定书由机构动物护理和使用委员会审查和批准（议定书 #2017-0048）。

1. 胚胎收集

1. 在胚胎采集日的前一天晚上，在交叉的鱼缸里放上一对斑马鱼。为了精确分阶段控制胚胎发育，在交配对之间使用屏障。
2. 在首选产卵时间之前提高屏障，并在 100 毫米培养皿中 15 分钟内收集卵子。
   1. 清理培养皿中的碎屑。如果从一个离合器中收集超过 50 个胚胎，则相应地将离合器拆分为多个培养皿。
3. 在28°C的鱼系统水中孵育胚胎，直到它们达到50%的表皮阶段（受精后5小时）。标准化胚胎生长介质，如E3，也可以使用，而不是水族馆系统水，直到步骤3.2。
   1. 在立体镜下取出未受精卵，并将胚胎移到 23.5 °C 的孵化器过夜 （O/N）。胚胎应该在收集日的第二天早上 8 - 10 个索米特阶段。

2. 工具准备

1. 通过浸泡在100%乙醇（EtOH）和火釉中，对显微外科刀片、针尖（用于解剖组织）和玻璃巴斯德移液器进行消毒。
2. 在 25 mm x 75 mm 显微镜幻灯片上使用两层透明胶带（厚度约 100-120 微米）。在每个幻灯片的胶带中央用手术刀盖住切开约 18 毫米 x 18 毫米方形井。
   1. 用 70% EtOH 擦拭准备好的滑动室。这些油井将容纳约40μL的介质。

3. 样品准备

1. 在立体镜下使用两个针注射器尖端来分质胚胎。将胚胎转移到单独的培养皿中，用鱼系统水冲洗。
2. 使用火釉无菌玻璃巴斯德移液器，在含有解剖介质的 6 厘米培养皿中移植胚胎（Leibovitz-15 细胞培养介质，L-谷氨酰胺无酚红色，0.8 mM CaCl₂ 和 1×抗生素抗菌溶液）。
   注意:在此步骤之后，继续使用消毒玻璃移液器进行所有转移。
   1. 使用玻璃培养皿进行去卸过程，以避免在解剖过程中多苯乙烯芯片。
3. 将 50 μL 的组织生长介质（解剖介质和 10% FBS）放入滑动室中。
4. 在后脑附近的蛋黄组织交叉口用针尖稳定胚胎，在立体镜下进行解剖。
5. 用针头保持胚胎组织稳定，使用刀片在45°处的显微外科刀将组织前部切开后脑，从前部开始剥落胚胎组织，朝尾芽移动（图1A）。
   注意:清洁蛋黄时小心不要丢失皮肤组织。在解剖过程中，皮肤很容易剥落，成为胚胎周围的侧翼单层弹性组织，因此很容易识别。
6. 一旦蛋黄完全从胚胎体中取出，从尾蕾上切下侧翼皮肤组织。保持最后形成的3-4个母体完好无损，切掉更多的前组织（全轴外植）。
   1. 蛋黄应该主要从这个程序完好无损地脱落。在蛋黄破裂的情况下，大量蛋黄颗粒可以附着在组织的腹腔表面。如果是这样，使用睫毛工具轻轻清理剩余的蛋黄颗粒。
      注:去剂侧面皮肤组织的不平衡不允许组织保持直线生长方向。相反，去皮将弯曲向更拉伸的皮肤的一侧。这种不平衡可以通过显微外科刀的辅助破坏皮肤层来纠正立体镜下的不平衡。
   2. 对于无皮的去皮植物，用针头按压皮肤层的尖端，用显微外科刀剥去去植的组织。这些系外植物不会拉长其在文化中的身体轴线。
   3. 除了全轴除外，本步骤还可以进行替代性除外植物。例如，使用显微外科刀（全PSM除外植物）解剖已经分割的松下，或解剖PSM到其半前柱（半PSM除草剂）。有关此类替代性解释的应用，请参阅第 5.1 节。
7. 立即将解剖的去移植物转移到 22 mm x 22 mm 盖片上进行成像。
   1. 将去剂平放在后部轴上，腹侧接触盖片（图1B）。使用 20 μL 过滤尖端移液器轻轻去除组织去除剂周围的过多介质。
      注意:解剖的外层植物延迟转移到盖片会导致组织变形，因为它从蛋黄的几何约束中解脱出来。
8. 迅速而小心地翻转盖片与外植在生长介质填充滑动室。
   1. 为防止气泡形成，将方形盖片的一侧放在磁带室上，然后轻轻地释放另一侧。注意不要在此步骤中移动/变形除外植物。
   2. 通过将滑动室压在实验室组织上，轻轻去除室外多余的介质出血。由于液体介质表面张力，没有任何密封，盖片将稳定地坐在滑梯室进行实时成像。
   3. 对于长期的培养（>6小时），使用更大的室。在这种情况下，可以使用 22 mm x 50 mm 矩形盖片以及幻灯片上的两条平行胶带层车道。在两条胶带通道之间可以留出约 1 毫米宽的间隙，以便于空气进入生长介质。
9. 重复步骤 3.3-3.8 以准备更多的解释。准备好的系外植物将拉长其A-P身体轴的平均30μm/h的速度，并以+40分钟的时间间隔在25°C（图2A，视频1）分割他们的草皮。
   1. 对于非拉长的解释性植物，在将多余的介质吸出实验室组织时，对将样品按在步骤 3.8.2 的滑梯两侧施加温和压力。或者，也可以在单磁带层滑动室中培养去种。此外，用I型胶原蛋白对滑动室表面进行化学激活将导致不拉长的解释（图2B，视频2）。
      1. 提前用 I 型胶原蛋白对腔室进行涂层，在室温下用 15-20 mL 的预稀胶原蛋白溶液充分覆盖滑动室，长达 1 小时。使用层压流罩为此协议保持不育。小心地冲洗末端带有解剖介质的腔室。
   2. 对于年龄超过15个索米特阶段的胚胎，横向安装尾部除外组织，而不是平坦的（多索文特尔）安装（视频3）。为了防止肌肉抽搐，在文化媒体中加入0.004%的三卡因溶液作为麻醉剂^3。

4. 实时图像采集

1. 图像样本要么在解剖范围内进行大范围传输的色虫分割大小和周期的光成像，要么使用转基因记者鱼线进行结构化照明/聚焦/光片显微镜。
2. 将组织去移植物的温度与成像室温度等于至少 15 分钟。
   1. 为了更精确地控制温度，请使用安装在倒显微镜上的商业温度控制系统。
3. 根据感兴趣的生物过程将图像采集帧间隔设置为 2 - 10 分钟。
   注:斑马鱼体的分割是一个快速的过程，在整个胚胎中，温度在20-55分钟之间，可存活温度为30°C至21.5°C。外植将拉长和段~30%比整个胚胎慢。
   1. 注意在通道采集集之间留出足够的延迟，以避免可能的光毒性对活组织。在超过一半的成像持续时间内，不要将组织暴露在激发光束中，并尽可能降低光束强度。
      注:活氧物种（ROS）的积累通常是活体样本中光毒性的主要原因^4。作为 ROS 清道夫的抗风酸可补充到 4 mM 浓度的生长介质中，以缓冲 ROS 活性并减轻光毒性。在现场成像过程中，可能很难注意到光毒性的不利影响。尾部外植在这方面是有利的，因为一些光毒性的视觉标记，如线粒体阻滞，阻碍组织发育（即形成索米特，尾部拉长），和分解组织更容易注意到。请参阅所提供的参考⁴ 进行详细讨论。
4. 使用单细胞阶段RNA注射胚胎获取四维图像，以细胞分辨率水平进行分割和分析。
   1. 使用 300 pg 的 RNA 从体外转录膜和核荧光记者标记质粒，如 pCS 膜 - ceruleanFP （添加金质粒#53749） 或 pCS -memb-mCherry （#53750 在注射中与 pcS2+ H2B-mTagBFP2 （添加基因质粒#99267） 或 pCS2® H2B-TagRFP-T （添加基因质粒#99271） 相结合。对于带有细胞膜和核标记的示例电影，请参阅 视频 4。
      注:PSM组织的平均细胞大小约为直径约5μm，其中核包括约3-4微米。应记录约 0.5μm 的像素大小和约 1μm 的 z 剖面，以进行适当的细胞分割。

5. 尾部去污的免疫

注意:在各种解剖方案（拉长、不拉长、尾芽解剖、半PSM等）后生长的组织，如平装尾部解释^5， 可从滑动室中恢复，以进一步免疫对感兴趣的蛋白质进行定量。在这里，我们介绍了用于二磷酸化细胞外信号调节激酶（ppERK）染色作为FGF信号梯度读出的协议。

1. 在形成隐士直到所需的阶段后，小心地将盖滑移到滑动室的一角，而无需抬起。
2. 在玻璃巴斯德移液器中约 100μL 的辅助解剖介质的帮助下，从滑梯中回收去除植物并转移到 64 井细胞培养板中。
   注:从此步骤开始，所有解决方案更换均可在解剖范围内进行，并配有用于固定样品的单独玻璃移液器。这将确保不会在井中失去外植组织或将它们转移到井中。
3. 转移所有除液后，逐一从井中吸出过量的介质，并将 PBS （PFA） 中 4% 副甲醛的 100μL 放入每口井中。
   注意事项: PFA是一种具有致癌作用的有毒溶液。处理时应使用适当的PPP。
4. 在室温下将去植物固定在 64 井板中，在摇床上固定 1 小时。
   1. 组织外植比整个胚胎对变形更敏感。相应地调整摇床速度。
5. 用 150μL 的 PBS-Tw（PBS 中的 0.1% Tween20）清洗固定剂三次。将第一次洗涤收集到特定的"PFA 废物"容器中。
6. 每次用100%甲醇（MeOH）替换~40μL的溶液，在4×5分钟内脱水。
   注意事项: MEOH是一种挥发性和易燃性有毒化学物质。在通风良好的空间中工作，并使用适当的 PPE 进行处理。
7. 作为脱水的最后一步，从井中取出所有溶液，代之以 MeOH 的 100 μL。在-20°C孵育15分钟。
   注意:使用特定的"MeOH 废物"容器收集解决方案，直到步骤 5.11。
8. 加入 50μL 的 MeOH，在室温下摇动 5 分钟。
9. 每次用 PBS-T（PBS 中的 0.1% Triton-X 100）替换约 40 μL 的溶液，在 4 ×5 分钟内重新种植脱水液。使用特定的"MeOH 废物"容器收集解决方案。
10. 作为补液的最后一步，从井中取出所有溶液，并替换为 100 μL 的 PBS-T。
11. 对于组织渗透治疗外植与1.5%Triton-X 100在PBS20分钟在室温下的摇床。
12. 用 MAB-D-T （0.1% Triton-X 100 洗涤剂和 1% 二甲基硫氧化物 （DMSO） 在 150 mM NaCl 100 mM 雄酸缓冲 pH 7.5） 3×5 分钟内清洗样品。
    注意事项: DMSO是易燃的，有毒的突变体。处理时应使用适当的PPP。
13. 在室温下将解释植物在 100 μL/井血清阻塞溶液（MAB-D-T 中 2% 胎儿牛血清）中孵化 2 小时。
14. 用 50-100 μL/井原抗体溶液替换所有阻塞溶液（血清块中单克隆小鼠抗体稀释 1:1000）。在摇床的 4 °C 处孵化样品 O/N （>16 h） 。
15. 用 MAB-D-T 5×5 分钟清洗主抗体溶液。
16. 在二次抗体溶液中孵化样品（亚历克萨氟 597 山羊防鼠IgG2b （1:200） 和霍奇斯特 33342 （1:5000） 在 MAB-D-T） O/N 在摇床 4 °C 或室温下 3 小时。
    注意:从这一步开始，用铝箔覆盖64井板，以避免二次抗体处理样品的光暴露。
    注意事项: 霍赫斯特33342是一种潜在的致病原。处理时应使用适当的PPP。
17. 用PBS-Tw 3×5分钟清洗辅助抗体溶液。
18. 在室温下用 PFA 修复样品 15 分钟。
19. 用 PBS-Tw 清洗固定物，并在 60% 甘油范围内平衡样品。显微镜幻灯片上的山去移植物，指甲油和 60% 的甘油用于成像。有关代表性免疫染色结果，请参阅 图 3。

结果

该协议使活斑马鱼尾部解释植物的平面几何培养成为可能。组织培养比整个胚胎具有三大优势:1）控制轴伸长速度，2）通过简单解剖控制各种信号（morphogen）源，3）近目标、高放大倍增和高NA活成像。

未经化学处理的滑动室允许尾部去毛板拉长其主轴（图2A），由包裹在下面组织的皮肤等体。当我们在化学激活的滑动室（与I型胶原蛋白）上培养外植时?...

讨论

本文介绍了^{我们最近开发}和用于斑马鱼胚胎的组织培养去移植技术的详细协议。我们的技术建立在以前在小鸡8和斑马鱼^9，10，11模型生物体的解释方法的基础上。 与此协议准备的尾部外植可以在一个简单的滑动室中存活长达>12小时，继续拉长其主身体轴并分割索米特，直到溶血结束。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP