使用上格拉夫方法估计植物生物质的晶体纤维素含量

摘要

上格拉夫法是纤维素估计使用最广泛的方法。本次演示的主要目的是提供详细的上格拉夫协议，用于估算植物生物质样本中的纤维素含量。

摘要

纤维素是地球上光合作用产生的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁通过提供细胞生长的强度、刚度、速率和方向、细胞形状维护以及生物和非生物应激源的保护，在植物生长发育中发挥着重要作用。细胞壁主要由纤维素、木质素、血糖和果胶组成。最近，植物细胞壁成为第二代生物燃料和生物能源生产的目标。具体来说，植物细胞壁的纤维素成分用于纤维素乙醇的生产。生物量纤维素含量的估计对于基础和应用细胞壁研究至关重要。Updegraff方法简单、坚固，是估计植物生物量结晶纤维素含量的最广泛应用的方法。酒精不溶性粗细胞壁分数在治疗与厄普德格拉夫试剂消除血细胞素和木质素分数。后来，上格拉夫耐纤维素分量受到硫酸处理，将纤维素同聚合体水解成单体葡萄糖单位。使用各种葡萄糖浓度开发回归线，用于估计实验样本中纤维素水解后释放的葡萄糖量。最后，纤维素含量根据按彩色测定炭甲基检测的葡萄糖单体量进行估计。

引言

纤维素是细胞壁的主要承重成分，存在于主细胞壁和辅助细胞壁中。细胞壁是环绕植物细胞的细胞外基质，主要由纤维素、木质素、血糖、果胶和基质蛋白组成。大约三分之一的植物生物量是纤维素^1，它通过提供强度、刚性、细胞生长的速度和方向、细胞形状维护以及防止生物和非生物应激因素，在植物生长发育中发挥着重要作用。棉纤维含有95%纤维素²含量，而树木含有40%至50%的纤维素，这取决于植物种类和器官类型^3。纤维素由纤维素的重复单位组成，纤维素是葡萄糖残留物的去除，由β-1，4糖体键⁴连接。纤维素乙醇是由葡萄糖从植物^细胞壁5中存在的纤维素中提取的。纤维素纤维由几个微纤维组成，其中每个微纤维作为核心单位与500-15000葡萄糖单体^1，6。纤维素同聚物由等离子膜嵌入纤维素合成酶复合物（CSC的^）1，7合成。单个纤维素合成酶A（CESA）蛋白合成葡萄糖链和相邻的葡萄糖链通过氢键连接，形成晶体纤维素^1，8。纤维素存在于几个晶体形式与两种主要形式，纤维素I+和纤维素I+作为原生形式^9。在较高的植物中，纤维素存在于纤维素I+形式中，而低植物纤维素存在于I+形式^10，11中。总的来说，纤维素在向植物细胞壁传授力量和刚性方面起着重要作用。

第一代生物燃料主要产自玉米淀粉、甘蔗糖和甜菜糖，它们是食物来源，而第二代生物燃料则主要生产来自非食品植物生物质细胞壁材料¹²的生物燃料。准确估计结晶纤维素含量不仅对纤维素生物合成和细胞壁动力学的基础研究具有重要意义，而且对应用生物燃料和生物制品研究也具有重要意义。开发和优化了多种植物生物量纤维素估算方法，上格拉夫法是纤维素估算中应用最广泛的方法。第一个报告的纤维素估计方法是由克罗斯和贝文在1908^年13。该方法基于硫酸钠交替氯化和提取的原则。然而，由克罗斯和贝文方法的原始和修改协议获得的纤维素显示，除了大量的木质素和曼南¹⁴的微小部分污染。尽管对从纤维素部分去除木质素和半纤维素进行了多次修改，但交叉贝文方法保留了相当数量的曼南和纤维素。后来，库尔施纳的方法是利用硝酸和乙醇提取纤维素^15。该方法指出，总木质素和75%的五氯苯甲酸被去除，但真正的纤维素结果与十字和贝文的氯化方法估计的结果相同。另一种方法（诺曼和詹金斯）是利用甲醇苯、硫酸钠和次氯酸钠提取纤维素¹⁶而开发的。这种方法还保留了一些部分木质素 （3%）和大量的五氯苯二酯导致在纤维素的准确估计。后来，基塞尔和塞米加诺夫斯基使用另一种方法，使用80%浓缩硫酸对纤维素进行水解，而水解减少的糖分则由贝特朗的方法¹⁷估计。根据基塞尔和塞米加诺夫斯基的方法开发的两种方法，瓦克斯曼和史蒂文斯¹⁸和萨洛^14，19，也比早期的方法^20少4-5%纤维素含量。

上格拉夫法是估计结晶纤维素含量最广泛的方法。1969年²¹年，乌普德格拉夫首次对纤维素的测量方法进行描述。Updegraff方法将库尔施纳法（使用硝酸）、基塞尔和塞米诺斯基方法（用硫酸将纤维素水解成葡萄糖单体）与一些修改相结合，并结合了维尔斯和西尔弗曼的炭热检测，用于对葡萄糖和结晶纤维素含量进行简单的色度估计^。这种方法的原理是使用醋酸和硝酸（上格拉夫试剂）从同质化植物组织中去除半球素和木质素，从而留下耐醋酸/耐硝酸纤维素作进一步加工和^估计。醋酸/耐硝酸纤维素用67%的硫酸处理，将纤维素分解成葡萄糖单体，释放的葡萄糖单体估计由炭酸检测^21，23。对原来的上格拉夫方法进行了几次修改，以简化程序和纤维素估计由炭细检测^24。从广义上讲，这种方法可以分为五个阶段。在第一阶段，工厂材料已准备就绪。在第二阶段，粗细胞壁与总生物量分离，因为纤维素是植物细胞壁的关键成分。后来，在第三阶段，纤维素通过使用上格拉夫试剂处理，从非纤维素细胞壁组件中分离出来。在第四阶段，通过硫酸处理，醋酸/耐硝酸纤维素被分解成葡萄糖单体。纤维素硫酸处理导致葡萄糖单体与硫酸反应形成5-羟基硫化物化合物。最后，在最后阶段，炭热产生一个绿色的蓝色复合物，沸腾与前一阶段²⁵产生的毛皮化合物。这种基于炭铁的色度测量方法于1942年首次被德雷伍德使用。Anthrone 是一种在酸性条件下识别五氯蔗糖和六甲酸脱水产品（如 5-羟基紫外线）的毛皮化合物的染料。与五角大厦²⁵相比，六角形的反应产生强烈的色彩和更好的反应。受约束葡萄糖的含量以光谱光度计吸收量测量，在620纳米，绿色蓝色复合物的强度与样品中的糖量成正比。测量的吸收值与葡萄糖标准曲线回归线进行比较，以计算样品的葡萄糖浓度。测量的葡萄糖含量用于估计植物生物量的纤维素含量。

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研究方案

1. 实验准备

1. 将干燥的植物材料磨成细粉末。
2. 蛋白质溶解缓冲区 （PSB）: 准备 1 M 三重奏 （pH 8.8）， 0.5 M 乙酰胺乙酰氨基酸 （EDTA） （pH 8.0） 的库存解决方案，并将其高压灭菌。从这些库存解决方案中制作新鲜的PSB缓冲，最终浓度为50m Tris、0.5 m EDTA 和 10% 硫酸钠 （SDS） 无菌水中。
3. 准备100mL的70%乙醇（v/v）:70mL的100%乙醇和30mL的无菌水。
4. 准备100mL的甲醇:氯仿在1:1的比例（50mL甲醇和50mL氯仿）。
5. 准备 82.5 mL 的上格拉夫试剂。将 75 mL 的 80% 醋酸添加到 7.5 mL 的硝酸中，使水的最终比例:醋酸:硝酸在 2:8:1 （v/v） 中。要准备80%的醋酸，在20毫升无菌水中溶解80mL的冰川醋酸（v/v）。
6. 准备1毫克/mL葡萄糖溶液的新鲜库存。在10mL水中溶解10毫克葡萄糖（w/v）。
7. 要准备 100 mL 的 67% 硫酸（v/v），在 33 mL 水中加入 67 mL 的浓缩硫酸。始终使用玻璃瓶，并缓慢地在水中加入酸。此步骤是外热（释放热量）。因此，在冰上准备此溶液，并在冰箱中冷却至少 2 小时，然后再使用。
8. 为每批实验样品准备新鲜的 0.2% 炭离子 （w/v）。重0.2克的炭热，溶解在用铝箔包裹的玻璃瓶中100毫升预冷浓缩硫酸中。在冰箱使用前保持1-2小时。
   注:实验当天冰箱中预冷浓缩硫酸，强烈建议对炭热进行新鲜制备，以准确估计葡萄糖含量。

2. 植物生物质材料的制备

1. 从生长条件相同、发育阶段相同、植物位置相同、组织类型相同的温室中生长的2个月大棉花实验线采集植物生物质样本（叶/茎/根）。
   注:为每个样本收集至少三个生物复制品。用水彻底清洗它们，去除根组织中的所有污垢。
2. 在室温下用纸巾在纸巾上干燥根组织2天，以去除水分含量（图1）。
   注意:空气干燥所需的组织纤维素估计，以防止任何真菌污染。
3. 将根样本放入单个容器中。然后在 49 °C 的孵化器中标记并干燥它们 10 天 （材料表）。
   注:或者，冷冻干燥机可用于在更短的时间内（1 或 2 天）干燥植物组织，而不会对植物生物质材料造成任何化学变化。
4. 将干燥的样品切成小块，用液氮冷冻，然后使用砂浆和砂浆、冰柜磨床或生物质研磨机研磨成均匀的细粉（图1）。
   注:冷冻机在3个周期中以10 cps的速度使用。
5. 收集接地组织（图2），然后进行细胞壁提取。
   注意:此时可以通过在室温下将样品储存在密封容器中来暂停这个过程。

3. 从植物生物质中提取粗细胞壁

注:植物细胞壁含有纤维素、木质素、非纤维素成分、果胶、基质蛋白、酚类化合物和水^26。由于纤维素存在于细胞壁中，第一步是将细胞壁成分与植物生物质²⁶的非细胞壁成分分离。

1. 在启动细胞壁提取过程之前，标记和称重单个空白的 2 mL 管。
2. 在进一步进行之前，请在实验室笔记本中记下空管重量。
3. 从步骤 2.5 起称重 20 毫克粉末组织，并将其转移到预称的 2 mL 管中并贴上标签。
4. 加入 1 mL 蛋白质溶解缓冲 （PSB） （50 mM 盐酸三酯 （HCl） 缓冲 pH 8.8、0.5 mM EDTA 和 10% 硫酸钠 （SDS） 以溶解蛋白质。涡流和离心机在室温下 5 分钟 25，200 x g。离心后，丢弃超自然药物并保存颗粒。
   注:如果需要分析蛋白质成分，可以保存超自然。
5. 再重复步骤 3.4 两次。
6. 在保留的颗粒中，加入 1 mL 蒸馏水和漩涡。离心机在室温下（RT）下5分钟在25，200 x g处，并去除超自然。
7. 再重复步骤 3.6 两次。
8. 将 1 mL 的 70% 乙醇添加到保存的颗粒、涡流中，并在水浴/热块中以 70 °C 加热 1 小时，从样品中去除可溶性组件和淀粉。漩涡和离心机在 Rt 5 分钟内以 25， 200 x g 的速度。 丢弃超母体并保存颗粒。
9. 再重复一次步骤3.8。
10. 在颗粒中加入1mL的100%甲醇和涡流。离心机在室温下（RT）下5分钟在25，200 x g处，并去除超自然。
11. 在颗粒和涡流中加入 1 mL 氯仿/甲醇（氯仿和甲醇比例为 1:1）。离心机在 RT 5 分钟内 25，200 x g，并去除超自然。甲醇和氯仿溶剂的加入使生物量²⁷中的脂质部分溶解并去除。
12. 在颗粒中，加入1mL的100%风向标和涡流。在室温下孵育5分钟。离心机在 RT 5 分钟内 25，200 x g，并去除超自然。醋酸去除色素，如叶绿素和游离脂肪酸从生物质^28，29。
13. 在 37 °C 的夜间干燥颗粒，或通过真空干燥进一步干燥。
    注:干颗粒是用于晶体纤维素估计的粗细胞壁。此时可以暂停该过程，或使用真空干燥器进一步干燥样品。

4. 使用上格拉夫试剂（醋酸和硝酸）治疗，以去除非纤维化成分

注:该协议涉及使用酸和其他化学品。在整个过程中佩戴个人防护装备 （PPE）。

1. 将 5 毫克的干粗细胞壁颗粒测量为新的 2 mL 螺丝盖管。注意确切的重量（图3）30。
2. 此时包括正控。使用2毫克滤纸（材料表）作为正控制，产生80%的纤维素含量。
3. 将 1.5 mL 的 Updegraff 试剂添加到重达 5 毫克的细胞壁提取物和正控制中。通过漩涡混合。
   注:从此步骤开始，应以与实验样本相同的方式处理正对照。这一步骤应在烟雾罩中进行，并配备适当的个人防护装备 （PPE）。
   注意:此步骤应在螺丝帽管中执行，以防止样品溅出和管子弹出。应包括每个样本的三个生物复制品以及三个用于阳性控制的复制品。
4. 在开水浴中将悬架加热 100 °C 30 分钟，在长凳上冷却 10 分钟。离心机在 Rt 10 分钟内以 25， 200 x g 的速度离心机。 通过离心去除超自然药物， 并保存颗粒。
   注:产生的废物应分别收集有机溶剂、硫酸和上格拉夫试剂（醋酸和硝酸）。含有醋酸和硝酸的废物应保持在凉爽的温度下，并带有通风帽，切勿与任何其他有机溶剂和其他酸混合以防止任何爆炸。
5. 向颗粒中加入 1 mL 的水。离心机在 RT 10 分钟内以 25，200 x g 的速度工作。取出超自然人的 500 μL，并在管中加入 1 mL 的 Acetone。
6. 离心机在 25，200 x g 5 分钟在 Rt. 删除 1 mL 的超纳特， 并添加 1 mL 的王牌到管和离心机在 25， 200 x g 5 分钟在 Rt 。
7. 离心后，取出所有超纳特，将颗粒悬浮在1mL的王牌中。在室温下孵化管5分钟，在RT旋转25，200 x 克5分钟。
8. 丢弃超自然，保存颗粒。在 37 °C 过夜干燥颗粒 （图 3）。
   注意:此时可以暂停该过程，或继续使用真空干燥器进行干燥，然后进入下一步。

5. 通过酸对纤维素进行水解，以产生葡萄糖单体单位

1. 在干燥的颗粒中加入 1 mL 的 67% 硫酸。漩涡将颗粒完全混合在酸中。
2. 在室温下摇动管1小时，将纤维素颗粒溶解在67%的硫酸中。
   注:作为替代，在摇床中30分钟的孵化后，通过对每个样品进行10分钟的声波化，可以改善67%硫酸中纤维素颗粒的溶解。声波化后，样品可以在RT的摇床中重新孵化。然而，当我们从5毫克粗细胞壁提取物开始时，我们观察到纤维素颗粒的完全溶解性，没有声波（图3）。这个程序对各种植物生物质样品效果很好^。

6. 通过甲基苯丙烷检测和纤维素含量估算测量葡萄糖含量

1. 在这个阶段，纤维素是自由葡萄糖单体的形式。通过光谱光度测量测量样品中葡萄糖的含量，确定纤维素的含量。
2. 从步骤 5 中取 10 μL 的样品，将其添加到 490 μL 的无菌蒸馏水中，使每个样品稀释到 500 μL。 Vortex 稀释样品和水的混合物 10 秒。
3. 在每个管中加入 1 mL 的 0.2% 新鲜制备的炭热试剂，并通过漩涡立即混合。
4. 在 100 °C 下煮样品 10 分钟，在冰上冷却管 5 分钟。在 96 井板的三口井中传输每个样品的 200 μL。将 96 井板加载到光谱仪中，以测量 620 nm 的吸收度。
   注意:对于在高温下沸腾，使用螺丝管防止有害化学品溅出，避免样品丢失。

7. 葡萄糖标准曲线的准备

1. 要制定葡萄糖标准，在 10 mL 的无菌蒸馏水中溶解 10 毫克葡萄糖，使葡萄糖新鲜存量为 1 毫克/mL。以 20μL 增量 （0， 20、 40、 60、 80，100，120，140， 160， 180 μL） 到无菌蒸馏水 （总体积 1 mL）， 以制定 0μg 至 180μg/mL 浓度的葡萄糖标准 （图 3）。加入无菌水后，每个葡萄糖标准漩涡。
2. 从这10种不同的浓度中，将每个葡萄糖浓度的500μL引用到一个新的2mL螺丝盖管中。
3. 将1mL新准备的0.2%炭热加入每个管子，通过漩涡立即混合。在冰上孵化，在100°C煮10分钟，然后在冰上孵育5分钟²³分钟。
4. 将每个标准的 200 μL 转移到 96 井微滴定板中的三口井中，用于三次技术复制，并在 620 nm（图 3）下测量吸收量。
5. 通过绘制不同的葡萄糖浓度（0 至 180 μg/mL）与 620 nm（图 7）的正常吸收值对比，形成标准葡萄糖曲线。使用吸收值生成的回归线 Y= mx+c 计算已准备好的样品中的纤维素含量。
   注:每组实验都必须为葡萄糖标准准备新标准。如果OD值过高/过低，应增加葡萄糖的浓度，使这些值属于标准曲线吸收值的范围。回归线根据每批样品使用的葡萄糖标准生成不同的 m 和 c 值。混合管后，立即添加炭离子^23。由于这种反应的外热性质，在进行炭热检测之前，总是保持冷清，稀释样品和制备标准。

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结果

在绿房子里种植的棉花植物被选为这项研究的人选。选择两种不同的棉花实验线进行纤维素含量的比较分析。对于每个实验线，根组织是从三个生物复制品中收集的。总共500毫克的组织是同质化的，其中20毫克用于粗细胞壁提取。后来，5毫克的粗细胞壁提取物用于上格拉夫试剂处理，从纤维素中去除血细胞素和木质素。纯纤维素通过硫酸处理进行水解，将纤维素分解成葡萄糖单位。吸收读数为620?...

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讨论

棉纤维是用棉籽生产的天然纤维。棉纤维是一种单细胞，纤维素含量约95%，^纤维素含量高，在纺织行业具有广泛的应用^。由于棉纤维含有约95%的纤维素，我们使用棉根组织来演示水晶纤维素含量的估计。棉根组织中等丰富的结晶纤维素含量，是一种常见的植物生物量。晶体纤维素含量所需的总细胞壁量仅为5毫克，因此可用于估计不同发育阶段/组织特定纤维素?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol