使用上格拉夫方法估计植物生物质的晶体纤维素含量

摘要

上格拉夫法是纤维素估计使用最广泛的方法。本次演示的主要目的是提供详细的上格拉夫协议，用于估算植物生物质样本中的纤维素含量。

摘要

纤维素是地球上光合作用产生的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁通过提供细胞生长的强度、刚度、速率和方向、细胞形状维护以及生物和非生物应激源的保护，在植物生长发育中发挥着重要作用。细胞壁主要由纤维素、木质素、血糖和果胶组成。最近，植物细胞壁成为第二代生物燃料和生物能源生产的目标。具体来说，植物细胞壁的纤维素成分用于纤维素乙醇的生产。生物量纤维素含量的估计对于基础和应用细胞壁研究至关重要。Updegraff方法简单、坚固，是估计植物生物量结晶纤维素含量的最广泛应用的方法。酒精不溶性粗细胞壁分数在治疗与厄普德格拉夫试剂消除血细胞素和木质素分数。后来，上格拉夫耐纤维素分量受到硫酸处理，将纤维素同聚合体水解成单体葡萄糖单位。使用各种葡萄糖浓度开发回归线，用于估计实验样本中纤维素水解后释放的葡萄糖量。最后，纤维素含量根据按彩色测定炭甲基检测的葡萄糖单体量进行估计。

引言

纤维素是细胞壁的主要承重成分，存在于主细胞壁和辅助细胞壁中。细胞壁是环绕植物细胞的细胞外基质，主要由纤维素、木质素、血糖、果胶和基质蛋白组成。大约三分之一的植物生物量是纤维素^1，它通过提供强度、刚性、细胞生长的速度和方向、细胞形状维护以及防止生物和非生物应激因素，在植物生长发育中发挥着重要作用。棉纤维含有95%纤维素²含量，而树木含有40%至50%的纤维素，这取决于植物种类和器官类型^3。纤维素由纤维素的重复单位组成，纤维素是葡萄糖残留物的去除，由β-1，4糖体键⁴连接。纤维素乙醇是由葡萄糖从植物^细胞壁5中存在的纤维素中提取的。纤维素纤维由几个微纤维组成，其中每个微纤维作为核心单位与500-15000葡萄糖单体^1，6。纤维素同聚物由等离子膜嵌入纤维素合成酶复合物（CSC的^）1，7合成。单个纤维素合成酶A（CESA）蛋白合成葡萄糖链和相邻的葡萄糖链通过氢键连接，形成晶体纤维素

研究方案

1. 实验准备

1. 将干燥的植物材料磨成细粉末。
2. 蛋白质溶解缓冲区 （PSB）： 准备 1 M 三重奏 （pH 8.8）， 0.5 M 乙酰胺乙酰氨基酸 （EDTA） （pH 8.0） 的库存解决方案，并将其高压灭菌。从这些库存解决方案中制作新鲜的PSB缓冲，最终浓度为50m Tris、0.5 m EDTA 和 10% 硫酸钠 （SDS） 无菌水中。
3. 准备100mL的70%乙醇（v/v）：70mL的100%乙醇和30mL的无菌水。
4. 准备100mL的甲醇：氯仿在1：1的比例（50mL甲醇和50mL氯仿）。
5. 准备 82.5 mL 的上格拉夫试剂。将 75 mL 的 80% 醋酸添加到 7.5 mL 的硝酸中，使水的最终比例：醋酸：硝酸在 2：8：1 （v/v） 中。要准备80%的醋酸，在20毫升无菌水中溶解80mL的冰川醋酸（v/v）。
6. 准备1毫克/mL葡萄糖溶液的新鲜库存。在10mL水中溶解10毫克葡萄糖（w/v）。
7. 要准备 100 mL 的 67% 硫酸（v/v），在 33 mL 水中加入 67 mL 的浓缩硫酸。始终使用玻璃瓶，并缓慢地在水中加入酸。此步骤是外热（释放热量）。因此，在冰上准备此溶液，并在冰箱中冷却至少 2 小时，然后再使用。
8. 为每批实验样品准备新鲜的 0.2% 炭离子 （w/v）。重0.2克的炭热，溶解在用铝箔包裹的玻璃瓶中100毫升预冷浓缩硫酸中。在冰箱使用....

结果

在绿房子里种植的棉花植物被选为这项研究的人选。选择两种不同的棉花实验线进行纤维素含量的比较分析。对于每个实验线，根组织是从三个生物复制品中收集的。总共500毫克的组织是同质化的，其中20毫克用于粗细胞壁提取。后来，5毫克的粗细胞壁提取物用于上格拉夫试剂处理，从纤维素中去除血细胞素和木质素。纯纤维素通过硫酸处理进行水解，将纤维素分解成葡萄糖单位。吸收读数为620?.......

讨论

棉纤维是用棉籽生产的天然纤维。棉纤维是一种单细胞，纤维素含量约95%，^纤维素含量高，在纺织行业具有广泛的应用^。由于棉纤维含有约95%的纤维素，我们使用棉根组织来演示水晶纤维素含量的估计。棉根组织中等丰富的结晶纤维素含量，是一种常见的植物生物量。晶体纤维素含量所需的总细胞壁量仅为5毫克，因此可用于估计不同发育阶段/组织特定纤维素?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol