Оценка кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений с использованием метода Updegraff

Резюме

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. Основная цель этой демонстрации заключается в предоставлении подробного протокола Updegraff для оценки содержания целлюлозы в образцах биомассы растений.

Аннотация

Целлюлоза является наиболее распространенным полимером на Земле, генерируемым фотосинтезом и основным несущим компонентом клеточных стенок. Клеточная стенка играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Клеточная стенка в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемичеллозы и пектина. Недавно стенки клеток растений были ориентированы на производство биотоплива и биоэнергии второго поколения. В частности, целлюлозный компонент стенки клеток растения используется для производства целлюлозного этанола. Оценка содержания целлюлозы в биомассе имеет решающее значение для фундаментальных и прикладных исследований клеточной стенки. Метод Updegraff прост, надежн и наиболее широко используется метод для оценки кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений. Алкоголь нерастворимых сырой фракции стенки клетки при лечении реагентом Updegraff устраняет гемичеллулозы и лигнина фракций. Позже, Updegraff реагент устойчивых целлюлозы фракция подвергается серной кислоты лечения гидролизов целлюлозы гомополимера в мономерных единиц глюкозы. Регрессионная линия разработана с использованием различных концентраций глюкозы и используется для оценки количества глюкозы, высвобождаемой при целлюлозном гидролизе в экспериментальных образцах. Наконец, содержание целлюлозы оценивается на основе количества мономеров глюкозы по колоритическому анализу антрона.

Введение

Целлюлоза является основным нагрузоносным компонентом клеточных стенок, который присутствует как в первичных, так и в вторичных клеточных стенках. Клеточная стенка является внеклеточной матрицей, которая окружает растительные клетки и в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемицеллюлозы, пектина и матричных белков. Приблизительно одна треть биомассы растений целлюлозы^{1 и играет значительную роль} в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Хлопковое волокно содержит 95% целлюлозы² содержание, в то время как деревья содержат от 40% до 50% целлюлозы в зависимости от видов растений и^{типов органов 3}. Целлюлоза состоит из повторяющихся единиц целлобиозы, дисахарид остатков глюкозы, соединенных β-1,4 гликозидионых^{связей 4}. Целлюлозный этанол производится из глюкозы, полученной из целлюлозы, присутствуют в стенках клеток растений⁵. Целлюлозное волокно состоит из нескольких микро фибрилляций, в которых каждый микро фибриллятор действует как основной блок с 500-15000 мономеров^{глюкозы 1,6}. Целлюлозный гомополимер синтезируется плазменной мембраной встроенных целлюлозно-синтазных комплексов (CSC's)^1,7. Индивидуальные целлюлозные синтазы (CESA) белки синтезируют глюкановые цепи и прилегающие к ним глюкановые цепи соединены водородными связями для формирования кристаллической^{целлюлозы 1,8.} Целлюлоза существует в нескольких кристаллических формах с двумя преобладающими формами, целлюлозой I и целлюлозой I, как родные формы⁹. В высших растениях целлюлоза существует в форме целлюлозы I, в то время как нижняя целлюлоза растений существует в^{форме I q 10,11}. В целом, целлюлоза играет значительную роль в придав прочности и жесткости стенок клеток растений.

Биотопливо первого поколения в основном производится из кукурузного крахмала, тростникового сахара и свеклы сахаров, которые являются источниками пищи, в то время как биотопливо второго поколения фокусируется на производстве биотоплива из непродовольственных растений биомассы клеточный материал^{стены 12}. Точная оценка содержания кристаллической целлюлозы важна не только для фундаментальных исследований биосинтеза целлюлозы и динамики клеточных стенок, но и для прикладных исследований биотоплива и био продуктов. Разработаны и оптимизированы различные методы оценки целлюлозы в биомассе растений, а метод Ульдеграффа является наиболее широко используемым методом оценки целлюлозы. Первый зарегистрированный метод оценки целлюлозы был Кросс и Беван в 1908^{году 13}. Метод был основан на принципе альтернативного хлорирования и экстракции сульфатом натрия. Тем не менее, целлюлоза, полученная в оригинале, а также измененные протоколы Креста и Беван метод показал загрязнение небольших фракций лигнина в дополнение к значительному количеству ксиланов и маннан¹⁴. Несмотря на несколько изменений для удаления лигнина и гемичеллозы из целлюлозной фракции, метод Кросс-Беван сохранил значительное количество маннан вместе с целлюлозой. Позже метод Куршнера был разработан с использованием азотной кислоты и этанола для извлечения целлюлозы^15. Этот метод заявил, что общий лигнин и 75% пентозанов были удалены, но истинные результаты целлюлозы были такими же, как те, которые оцениваются методом хлорирования Креста и Бевана. Другой метод (Норман и Дженкинс) был разработан с использованием метанола-бензола, сульфата натрия и гипохлорита натрия для извлечения^{целлюлозы 16}. Этот метод также сохранил некоторую долю лигнина (3%) и значительное количество пентозанов, что приводит к точной оценке целлюлозы. Позже Кизель и Семигановский использовали другой подход к гидролизной целлюлозе, используя 80% концентрированной серной кислоты, а гидролизированные пониженные сахара оценивались методом^{Бертрана 17.} Два метода, Waksman и Стивенс^{18 и Сало 14},^{19, которые были разработаны} на основе метода Kiesel и Semiganowsky, также дали 4-5% меньше содержания целлюлозы по сравнению с предыдущими методами²⁰.

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Этот метод был впервые описан Updegraff для измерения целлюлозы в 1969^{году 21}. Метод Updegraff интегрирует метод Kurschner (использование азотной кислоты), методы Кизела и Семиновского (гидролиз целлюлозы в мономеры глюкозы с использованием серной кислоты) с некоторыми модификациями, и антронный анализ Viles и Silverman для простой колоритной оценки содержания глюкозы и^{кристаллической целлюлозы 22}. Принцип этого метода является использование уксусной кислоты и азотной кислоты (Updegraff реагент) для устранения гемичеллозы и лигнина из гомогенизированных тканей растений, что оставляет уксусной / азотной кислоты устойчивых целлюлозы для дальнейшей обработки и^{оценки 15}. Ацетическая/азотная кислотная устойчивая целлюлоза лечится 67% серной кислотой, чтобы разбить целлюлозу на мономеры^{глюкозы,}а выпущенные мономеры глюкозы оцениваются по анализу^21,23. Несколько модификаций оригинального метода Updegraff были использованы для упрощения процедуры и оценки целлюлозы с помощью анализа^24. В целом этот метод можно разделить на пять этапов. На первом этапе готовится растительный материал. На втором этапе стена сырой клетки отделяется от общей биомассы, так как целлюлоза является ключевым компонентом стенок клеток растений. Позже, в третьей фазе, целлюлоза отделяется от неклеточных компонентов клеточной стенки путем лечения реагентом Updegraff. В четвертой фазе устойчивая к уксусу/азотной кислоте целлюлоза разбита на мономеры глюкозы путем лечения серной кислотой. Серная кислота лечения целлюлозы приводит к образованию 5-гидроксиметилфурфальных соединений от реакции мономеров глюкозы с серной кислотой. Наконец, на последнем этапе, антрон генерирует зеленовато-голубой комплекс путем кипения с меховым соединением, генерируемым в предыдущей фазе²⁵. Этот цветометрический метод на основе антрона был впервые использован в 1942 году Дрейвудом. Антрон является красителем, который определяет меховые соединения пентозы и шестинозных обезвоженных продуктов, таких как 5-гидроксиметилфурфурурал, в кислых условиях. Реакция с шестиосной производит интенсивный цвет и лучший ответ по сравнению с пентозами²⁵. Количество связанной глюкозы измеряется абсорбации спектрофотометра на уровне 620 нм, а интенсивность зеленовато-голубого комплекса прямо пропорциональна количеству сахара в образце. Измеренные значения абсорбции сравнивались со стандартной линией регрессии кривой глюкозы для расчета концентрации глюкозы в образце. Измеренное содержание глюкозы было использовано для оценки содержания целлюлозы в биомассе растения.

протокол

1. Экспериментальная подготовка

1. Измельчить сушеный растительный материал в мелкий порошок.
2. Белка Solubilization Buffer (PSB): Подготовка фондовых растворов 1 M Tris (рН 8,8), 0,5 М этилендиаминтетраатетической кислоты (EDTA) (рН 8,0) и автоклав их. Сделайте свежий буфер PSB из этих фондовых растворов с конечной концентрацией 50 мМ Трис, 0,5 мМ EDTA и 10% додекилового сульфата натрия (SDS) в стерильной воде.
3. Приготовьте 100 мл 70% этанола (v/v): 70 мл 100% этанола и 30 мл стерильной воды.
4. Приготовьте 100 мл метанола: хлороформ в соотношении 1:1 (метанол 50 мл и 50 мл хлороформа).
5. Приготовьте 82,5 мл реагента Updegraff. Добавьте 75 мл 80% уксусной кислоты в 7,5 мл азотной кислоты, чтобы конечное соотношение воды: уксусная кислота: азотная кислота в 2:8:1 (v/v). Для приготовления 80% уксусной кислоты растворите 80 мл ледниковой уксусной кислоты в 20 мл стерильной воды (v/v).
6. Приготовьте свежий запас раствора глюкозы 1 мг/мл. Растворите 10 мг глюкозы в 10 мл воды (w/v).
7. Для приготовления 100 мл 67% серной кислоты (v/v) добавьте 67 мл концентрированной серной кислоты в 33 мл воды. Всегда используйте стеклянную бутылку и добавить кислоту медленно в воду. Этот шаг экзотермический (высвобождает тепло). Таким образом, подготовить этот раствор на льду и охладить в холодильнике, по крайней мере за 2 часа до использования.
8. Приготовьте свежий 0,2% антрона (w/v) для каждой партии экспериментальных образцов. Взвесите 0,2 г антрона и растворите в 100 мл предварительно охлажденной концентрированной серной кислоты в стеклянной бутылке, завернутой алюминиевой фольгой. Хранить в холодильнике 1-2 часа перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охлаждающая концентрированная серная кислота в холодильнике в день эксперимента, и свежий препарат антрона настоятельно рекомендуется для точной оценки содержания глюкозы.

2. Подготовка растительного материала из биомассы

1. Сбор образцов биомассы растений из 2-месячных экспериментальных линий хлопка, выращенных в теплице с теми же условиями роста, той же стадией развития, тем же положением растений и тем же типом ткани (лист/стебель/корень).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите как минимум три биологических репликации для каждого образца. Тщательно вымойте их водой, чтобы удалить всю грязь из корневой ткани.
2. Воздушно-сухая корневая ткань в течение 2 дней на бумажных полотенцах при комнатной температуре для удаления содержания влаги(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушно-сухая желаемая ткань для оценки целлюлозы, чтобы предотвратить любое грибковое загрязнение.
3. Поместите корневые образцы в отдельные контейнеры. Затем этикетки и высушить их в инкубаторе при 49 градусов по Цельсию в течение 10дней (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, фен может быть использован для высыхания тканей растений за меньшее время (1 или 2 дня), не вызывая каких-либо химических изменений в материале биомассы растения.
4. Разрежьте высушенные образцы на мелкие кусочки, заморозьте их в жидком азоте и измельчите в единый мелкий порошок с помощью раствора и пестика, морозильной мельницы или мясорубкииз биомассы (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Морозильная мельница использовалась со скоростью 10 CPS в течение 3 циклов.
5. Соберите заземленную ткань(рисунок 2) и приступить к извлечению клеточной стенки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс может быть приостановлен в этот момент путем хранения образцов в герметичных контейнерах при комнатной температуре.

3. Извлечение стенок сырых клеток из биомассы растений

ПРИМЕЧАНИЕ: Стенки клеток растений содержат целлюлозу, лигнин, неклеточные компоненты, пектин, матричные белки, фенольные соединения и^{воду 26}. Так как целлюлоза присутствует в клеточных стенках, первым шагом является отделяние компонента клеточной стенки от неклеточных компонентов стенки биомассы растения^26.

1. Этикетка и весят отдельные пустые 2 мл труб перед началом процесса извлечения клеточной стенки.
2. Сделайте заметку о пустой массе трубки в лабораторном блокноте, прежде чем продолжить.
3. Взвесьте 20 мг порошкообразной ткани от шага 2.5 и перенесите его в предварительно взвешенные трубки 2 мл и обозначите их.
4. Добавьте 1 мл буфера растворимости белка (PSB) (50 мМ Трис гидрохлорид (HCl) буфер рН 8,8, 0,5 мМ EDTA и 10% додекил сульфата натрия (SDS) для растворимости белков. Вихрь и центрифуга при температуре 25 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). После центрифугации отбросьте супернатант и сохраните гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть сохранен, если белковый компонент нуждается в анализе.
5. Повторите шаг 3.4 еще два раза.
6. К сохраненным гранулам добавьте 1 мл дистиллированной воды и вихря. Центрифуга при температуре 25 200 х 5 мин при комнатной температуре (РТ) и удалить супернатант.
7. Повторите шаг 3.6 еще два раза.
8. Добавьте 1 мл 70% этанола в сохраненные гранулы, вихрь и нагрейте его при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 1 ч в водяной бане/тепловом блоке, чтобы удалить растворимые компоненты и крахмал из образцов. Вихрь и центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и сохраните гранулы.
9. Повторите шаг 3.8 еще раз.
10. К гранулам добавить 1 мл 100% метанола и вихря. Центрифуга при температуре 25 200 х 5 мин при комнатной температуре (РТ) и удалить супернатант.
11. Добавьте 1 мл хлороформа/метанола (хлороформ и метанол в соотношении 1:1) к гранулам и вихрю. Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант. Добавление метанола и хлороформного растворителя solubilizes и удаляет липидную фракцию из биомассы²⁷.
12. К гранулам добавьте 1 мл 100% ацетона и вихря. Инкубация при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант. Ацетон удаляет пигменты, такие как хлорофилл и свободные жирные кислоты из^{биомассы 28,29}.
13. Высушите гранулы при 37 градусах по Цельсию на ночь или продолжайте далее путем вакуумной сушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные гранулы сырой клеточной стенки, используемой для оценки кристаллической целлюлозы. Процесс может быть приостановлен в этот момент или продолжить использование вакуумной сушилки для сушки образцов.

4. Лечение реагентом Updegraff (ацетической и азотной кислотой) для удаления неклеточных компонентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол включает в себя использование кислот и других химических веществ. Носите средства индивидуальной защиты (PPE) на протяжении всего процесса.

1. Измерьте 5 мг высушенной сырой гранулы стены клетки в свежую трубку крышкой винта 2 mL. Обратите внимание на точныйвес (рисунок 3)³⁰.
2. Включите положительный контроль на данном этапе. Используйте 2 мг фильтровальнойбумаги (Таблица материалов)в качестве положительного контроля, который дает 80% содержание целлюлозы.
3. Добавьте 1,5 мл реагента Updegraff в взвешенный 5 мг экстракта клеточной стенки и положительный контроль. Смешайте вихрем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный контроль должен обрабатываться так же, как экспериментальные образцы с этого шага. Этот шаг должен быть выполнен в дымовой капот с надлежащим персональным защитным оборудованием (СИЗ).
   ВНИМАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в винт крышка труб для предотвращения брызг образца и popping труб. Следует включить три биологических реплицирования каждого образца и три репликации для положительного контроля.
4. Нагрейте подвеску при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут в кипящей водяной бане и охладите на скамейке в течение 10 минут. Центрифуга при 25200 х г в течение 10 мин на RT. Удалите супернатант центрифугой и сохраните гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образуемые отходы должны собираться отдельно для органических растворителей, серной кислоты и реагента Updegraff (уксусная кислота и азотная кислота). Отходы с уксусной кислотой и азотной кислотой следует хранить при низких температурах с вентилируемыми колпачками и никогда не смешивать с любыми другими органическими растворителями и другими кислотами, чтобы предотвратить любой взрыв.
5. Добавьте в гранулы 1 мл воды. Центрифуга при 25200 х г в течение 10 мин при RT. Удалите 500 МКЛ супернатанта и добавьте 1 мл ацетона в трубку.
6. Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин в RT. Удалите 1 мл супернатанта и добавьте 1 мл ацетона в трубку и центрифугу при 25 200 х г в течение 5 мин в RT.
7. После центрифугации снимите все супернатанты и приостановит гранулы в 1 мл ацетона. Инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 5 минут и спина на 25200 х г в течение 5 минут на RT.
8. Откажитесь от супернатанта и сохраните гранулы. Высушите гранулы при 37 градусах по Цельсию на ночь(рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс может быть приостановлен в этот момент или продолжить дальнейшее использование вакуумной сушилки для сушки и перейти к следующему шагу.

5. Гидролиз целлюлозы кислотой для производства мономерных единиц глюкозы

1. Добавьте 1 мл 67% серной кислоты в высушенные гранулы. Vortex смешать гранулы полностью в кислоте.
2. Встряхните трубки при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы растворить целлюлозные гранулы в 67% серной кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, solubilization целлюлозы гранулы в 67% серной кислоты могут быть улучшены путем sonication каждого образца в течение 10 минут после 30 мин инкубации в шейкере. После sonication, образцы могут быть повторно инкубированы в шейкере на RT. Тем не менее, мы наблюдали полную solubility целлюлозы гранулы без sonication, когда мы начинаем с 5 мг экстракта сырой клеточной стенки (Рисунок 3). Эта процедура хорошо работала для различных образцов биомассы растений³.

6. Измерение содержания глюкозы путем анализа антрона и оценки содержания целлюлозы

1. На данном этапе целлюлоза находится в виде свободных мономеров глюкозы. Определите количество целлюлозы, измерив количество глюкозы, присутствуют в образце спектрофотометрии.
2. Возьмите 10 йл образца из шага 5 и добавьте его в 490 йл стерильной дистиллированной воды, чтобы разбавить каждый образец до 500 йл. Vortex разбавленной смеси образца и воды в течение 10 секунд.
3. Добавьте 1 мл 0,2% свежеприготовленного реагента антрона в каждую трубку и немедленно перемешайте вихрем.
4. Отварить образцы при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут и охладить трубки на льду в течение 5 минут. Передача 200 йл каждого образца в трех скважинах 96 пластины скважины. Загрузите пластину 96 хорошо в спектрофотометр для измерения абсорбтности на 620 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для кипячения при высокой температуре, используйте винтовые трубки, чтобы предотвратить брызги вредных химических веществ и избежать потери образцов.

7. Подготовка стандартной кривой глюкозы

1. Для приготовления стандарта глюкозы сделайте свежий бульон из 1 мг/мл глюкозы путем растворения 10 мг глюкозы в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Добавьте этот запас раствор 1 мг/мл в 20 шагом (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 МКЛ) к стерильной дистиллированной воде (общий объем 1 мл) для подготовки стандартов глюкозы в диапазоне от 0 мкг до 180 мкг/мл концентраций (рисунок 3). Vortex каждого стандарта глюкозы после добавления стерильной воды.
2. Из этих 10 различных концентраций, aliquot 500 йл каждой концентрации глюкозы в свежем 2 мл винт ограничен трубки.
3. Добавьте 1 мл свежеприготовленного 0,2% антрона в каждую трубку и немедленно перемешайте вихрем. Инкубировать на льду и кипятить при 100 градусах Цельсия в течение 10 мин с последующим инкубацией на льду в течение 5^{мин 23}.
4. Передача 200 йл каждого стандарта на три скважины в 96 колодцах микро рейтеровой пластины для трех технических репликаций и измерение поглощения на уровне 620 нм(рисунок 3).
5. Разработать стандартную кривую глюкозы путем построения различных концентраций глюкозы (от 0 до 180 мкг/мл) против нормализованных значений поглощения на уровне 620 нм(рисунок 7). Для расчета содержания целлюлозы в подготовленных образцах используйте регрессивную линию Y'mx'c, генерируемую из значений абсорбции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глюкоза стандарты должны быть свежеприготовлены для каждого набора эксперимента. Концентрация глюкозы должна быть увеличена, если значения OD слишком высоки/низки, так что эти значения подпадают под диапазон стандартных значений абсорбции кривой. Линия регрессии генерирует различные значения m и c на основе стандартов глюкозы, используемых для каждой партии образцов. Смешайте трубки сразу после добавления антрона²³. Антрон, разбавленные образцы и подготовленные стандарты всегда были холодными до тех пор, пока анализ антрона не был выполнен из-за экзотермического характера этой реакции.

Результаты

Хлопковые растения, выращенные в зеленом доме, были отобраны для этого исследования. Для сравнительного анализа содержания целлюлозы были отобраны две различные экспериментальные линии хлопка. Для каждой экспериментальной линии корневая ткань была собрана из трех биологических репл...

Обсуждение

Хлопковые волокна являются натуральными волокнами, произведенными из хлопчатобумажного семе. Хлопковое волокно является одной клеткой с содержанием целлюлозы 95%^{2 с} высоким содержанием кристаллической целлюлозы с обширным применением в текстильной^{промышленно?...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol