Estimativa do Teor de Celulose Cristalina de Biomassa Vegetal utilizando o Método Updegraff

Resumo

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O principal objetivo desta demonstração é fornecer um protocolo updegraff detalhado para estimativa de conteúdo de celulose em amostras de biomassa vegetal.

Resumo

A celulose é o polímero mais abundante na Terra gerado pela fotossíntese e o principal componente de suporte de carga das paredes celulares. A parede celular desempenha um papel significativo no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A parede celular é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose e pectina. Recentemente, as paredes celulares das plantas foram alvo da produção de biocombustível e bioenergia de segunda geração. Especificamente, o componente de celulose da parede celular da planta é usado para a produção de etanol celulósico. A estimativa do teor de celulose de biomassa é fundamental para pesquisas fundamentais e aplicadas na parede celular. O método Updegraff é simples, robusto e o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina da biomassa vegetal. A fração de parede celular bruta insolúvel de álcool após o tratamento com reagente Updegraff elimina as frações de hemicellulose e lignina. Mais tarde, a fração de celulose resistente ao reagente Updegraff é submetida ao tratamento de ácido sulfúrico para hidrolisar o homopolímero de celulose em unidades de glicose monomérica. Uma linha de regressão é desenvolvida utilizando várias concentrações de glicose e usada para estimar a quantidade de glicose liberada sobre a hidrólise da celulose nas amostras experimentais. Finalmente, o teor de celulose é estimado com base na quantidade de monômeros de glicose por ensaio de antrona colorimétrico.

Introdução

A celulose é o componente primário de suporte de carga das paredes celulares, que está presente tanto nas paredes celulares primárias quanto secundárias. A parede celular é uma matriz extracelular que envolve células vegetais e é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose, pectina e proteínas matriciais. Aproximadamente um terço da biomassa das plantas é a^{celulose 1} e desempenha papéis significativos no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A fibra de algodão contém 95% de teor de^{celulose 2,} enquanto as árvores contêm de 40% a 50% de celulose, dependendo das espécies vegetais e dos tipos de órgãos³. A celulose é composta por unidades repetitivas de celobiose, um disscarido de resíduos de glicose conectados por β-1,4 ligações glicossídicas⁴. O etanol celulósico é produzido a partir da glicose derivada da celulose presente nas paredes^{celulares da}planta 5 . A fibra celulósica é composta por várias micro fibrilas nas quais cada micro fibril atua como unidade central com 500-15000 monômeros de glicose^1,6. O homopolímero de celulose é sintetizado por complexos de sinthase de celulose incorporados de membrana plasmática (CSC's)^1,7. Proteínas de celulose individual synthase A (CESA) sintetizam cadeias glucanas e as cadeias glucan adjacentes são conectadas por ligações de hidrogênio para formar celulose cristalina^1,8. A celulose existe em várias formas cristalinas com duas formas predominantes, celulose Iα e celulose Iβ como formas nativas⁹. Em plantas mais altas, a celulose existe na forma de celulose Iβ, enquanto a celulose vegetal inferior existe na forma Iα^10,11. No geral, a celulose desempenha um papel significativo na distribuição de força e rigidez para as paredes celulares da planta.

Os biocombustíveis de primeira geração são produzidos principalmente a partir de amido de milho, açúcares de cana e açúcares de beterraba, que são fontes de alimento, enquanto os biocombustíveis de segunda geração estão focando na produção de biocombustíveis a partir de material de parede celular de biomassa vegetal não-alimentar¹². A estimativa precisa do conteúdo de celulose cristalina não é apenas importante para pesquisas fundamentais sobre biosíntese de celulose e dinâmica da parede celular, mas também para pesquisa aplicada de biocombustíveis e produtos biológicos. Vários métodos foram desenvolvidos e otimizados para estimativa de celulose na biomassa vegetal, e o método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O primeiro método relatado para estimativa de celulose foi por Cross e Bevan em 1908¹³. O método baseou-se no princípio da cloração alternativa e extração por sulfato de sódio. No entanto, a celulose obtida pelos protocolos originais e modificados do método Cross e Bevan mostrou contaminação de pequenas frações de lignina, além de uma quantidade substancial de xilanas e mannans¹⁴. Apesar de várias modificações para remover lignina e hemicelluloses da fração de celulose, o método Cross-Bevan manteve uma quantidade considerável de mannans junto com celulose. Posteriormente, o método de Kurschner foi desenvolvido empregando ácido nítrico e etanol para extrair^{celulose 15}. Este método afirmava que o total de lignina e 75% dos pentosanos foram removidos, mas os resultados verdadeiros da celulose foram os mesmos estimados pelo método de cloração de Cross e Bevan. Outro método (Norman e Jenkins) foi desenvolvido empregando metanol-benzeno, sulfato de sódio e hipoclorito de sódio para extrair^{celulose 16}. Este método também reteve alguma fração de lignina (3%) e quantidades significativas de pentosanos levando a uma estimativa precisa da celulose. Mais tarde, Kiesel e Semiganowsky utilizaram uma abordagem diferente para hidrolisar a celulose usando ácido sulfúrico concentrado de 80%, e os açúcares reduzidos hidrolisados foram estimados pelo método de Bertrand¹⁷. Os dois métodos, Waksman e Stevens¹⁸ e Salo^14,19 que foram desenvolvidos com base no método de Kiesel e Semiganowsky, também renderam 4-5% menos teor de celulose em comparação com os métodos anteriores²⁰.

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina. Este método foi descrito pela primeira vez pela Updegraff para a medição da celulose em 1969²¹. O método Updegraff integra o método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel e Seminowsky (hidrólise da celulose em monômeros de glicose usando ácido sulfúrico) com algumas modificações, e o ensaio anthrone de Viles e Silverman para simples estimativa colorimétrica de glicose e teor de celulose cristalina²². O princípio deste método é o uso de ácido acético e ácido nítrico (reagente updeenxf) para eliminar hemicellulose e lignina dos tecidos vegetais homogeneizados, o que deixa celulose resistente a ácido acético/nítrico para posterior processamento e estimativa¹⁵. A celulose resistente a ácido actic/nítrico é tratada com ácido sulfúrico de 67% para quebrar a celulose em monômeros de glicose e os monômeros de glicose liberados são estimados pelo ensaio de anthrone^21,23. Várias modificações do método updegraff original foram utilizadas para simplificar o procedimento e a estimativa de celulose pelo ensaio de anthrone²⁴. Em linhas gerais, este método pode ser dividido em cinco fases. Na primeira fase, o material da planta é preparado. Na segunda fase, a parede celular bruta é separada da biomassa total, já que a celulose é o componente-chave das paredes celulares das plantas. Mais tarde, na terceira fase, a celulose é separada dos componentes da parede celular não celulósica, tratando com reagente Updegraff. Na quarta fase, a celulose resistente a ácido acético/nítrico é dividida em monômeros de glicose por tratamento de ácido sulfúrico. O tratamento de ácido sulfúrico da celulose resulta na formação de compostos 5-hidroximetilfurfurfural a partir da reação de monômeros de glicose com ácido sulfúrico. Finalmente, na última fase, o anthrone gera um complexo azul esverdeado fervendo com o composto furfural gerado na fase anterior²⁵. Este método colorimétrico baseado em anthrone foi usado pela primeira vez em 1942 por Dreywood. Anthrone é um corante que identifica compostos furfurais de pentose e hexose produtos desidratados como 5-hidroximetilfurfural, em condições ácidas. A reação com hexose produz uma cor intensa e melhor resposta em comparação com as pentoses²⁵. A quantidade de glicose encadernada é medida pela absorvância espectrofotômetro a 620 nm e a intensidade do complexo azul esverdeado é diretamente proporcional à quantidade de açúcar na amostra. Os valores medidos de absorvência foram comparados com uma linha de regressão padrão de glicose para calcular a concentração de glicose da amostra. O teor de glicose medido foi utilizado para estimar o teor de celulose da biomassa vegetal.

Protocolo

1. Preparação experimental

1. Triture material vegetal seco em um pó fino.
2. Tampão de Solubilização de Proteínas (PSB): Preparar soluções de estoque de 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) (pH 8.0) e autoclave-os. Faça tampão PSB fresco a partir dessas soluções de estoque com concentrações finais de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA e 10% sulfato de dodecil de sódio (SDS) em água estéril.
3. Prepare 100 mL de 70% de etanol (v/v): 70 mL de 100% etanol e 30 mL de água estéril.
4. Prepare 100 mL de metanol: clorofórmio em uma proporção de 1:1 (50 mL de metanol e clorofórmio de 50 mL).
5. Prepare 82,5 mL de reagente Updegraff. Adicione 75 mL de ácido acético de 80% a 7,5 mL de ácido nítrico de modo que a razão final da água: ácido acético: ácido nítrico esteja em 2:8:1 (v/v). Para preparar 80% de ácido acético, dissolva 80 mL de ácido acético glacial em 20 mL de água estéril (v/v).
6. Prepare um estoque fresco de 1 mg/mL de solução de glicose. Dissolva 10 mg de glicose em 10 mL de água (c/v).
7. Para preparar 100 mL de ácido sulfúrico de 67% (v/v), adicione 67 mL de ácido sulfúrico concentrado a 33 mL de água. Use sempre uma garrafa de vidro e adicione ácido lentamente à água. Esta etapa é exotérmica (libera calor). Por isso, prepare esta solução no gelo e esfrie na geladeira por pelo menos 2 horas antes do uso.
8. Prepare anthrone fresco de 0,2% (w/v) para cada lote de amostras experimentais. Pesar 0,2 g de anthrone e dissolver em 100 mL de ácido sulfúrico concentrado pré-refrigerado em uma garrafa de vidro embrulhada com papel alumínio. Mantenha na geladeira por 1-2 horas antes de usar.
   NOTA: O ácido sulfúrico concentrado pré-frio na geladeira no dia do experimento, e a preparação fresca de anthrone é altamente recomendada para uma estimativa precisa do teor de glicose.

2. Preparação de material de biomassa vegetal

1. Coletar amostras de biomassa vegetal de linhas experimentais de algodão de 2 meses cultivadas na estufa com as mesmas condições de crescimento, o mesmo estágio de desenvolvimento, a mesma posição das plantas e o mesmo tipo de tecido (folha/tronco/raiz).
   NOTA: Colete um mínimo de três réplicas biológicas para cada amostra. Lave-os bem com água para remover toda a sujeira do tecido radicular.
2. Tecido radicular seco ao ar por 2 dias em toalhas de papel à temperatura ambiente para remover o teor de umidade(Figura 1).
   NOTA: Tecido desejado a seco para a estimativa de celulose para evitar qualquer contaminação fúngica.
3. Coloque as amostras de raiz em recipientes individuais. Em seguida, rotule-os e seque-os na incubadora a 49 °C durante 10 dias (Tabela de Materiais).
   NOTA: Alternativamente, um secador congelado pode ser usado para secar o tecido vegetal em menos tempo (1 ou 2 dias) sem causar qualquer alteração química no material de biomassa vegetal.
4. Corte as amostras secas em pequenos pedaços, congele-as em nitrogênio líquido e triture em pó fino uniforme usando uma argamassa e pilão, um moinho de congelador ou um moedor de biomassa(Figura 1).
   NOTA: A fábrica de congeladores foi utilizada a uma taxa de 10 cps para 3 ciclos.
5. Recolher o tecido aterrado(Figura 2) e proceder com a extração da parede celular.
   NOTA: O processo pode ser pausado neste momento armazenando as amostras em recipientes herméticos à temperatura ambiente.

3. Extração de paredes celulares brutas da biomassa vegetal

NOTA: As paredes celulares da planta contêm celulose, lignina, componentes não celulose, pectina, proteínas matricial, compostos fenólicos e água²⁶. Como a celulose está presente nas paredes celulares, o primeiro passo é separar o componente da parede celular dos componentes da parede não celular da biomassa vegetal²⁶.

1. Rotule e pese tubos individuais em branco de 2 mL antes de iniciar o processo de extração da parede celular.
2. Anote os pesos vazios do tubo em um caderno de laboratório antes de prosseguir.
3. Pese 20 mg de tecido em pó a partir da etapa 2.5 e transfira-o para tubos pré-pesados de 2 mL e rotule-os.
4. Adicione 1 mL de tampão de solubilização de proteína (PSB) (50 mM Tris hydrochloride (HCl) tampão pH 8,8, 0,5 mM EDTA e 10% sulfato de dodecyl de sódio (SDS) para solubilizar proteínas. Vórtice e centrífuga a 25.200 x g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Após a centrifugação, descarte o supernasce e salve a pelota.
   NOTA: O supernante pode ser salvo se o componente proteico precisar ser analisado.
5. Repita o passo 3.4 mais duas vezes.
6. À pelota retida, adicione 1 mL de água destilada e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) e remover o supernatante.
7. Repita o passo 3.6 mais duas vezes.
8. Adicione 1 mL de 70% de etanol à pelota salva, vórtice e aqueça-o a 70 °C por 1h em um banho de água/bloco de calor para remover componentes solúveis e amido das amostras. Vórtice e centrífuga a 25.200 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante e salve a pelota.
9. Repita o passo 3.8 mais uma vez.
10. À pelota adicione 1 mL de 100% de metanol e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) e remover o supernatante.
11. Adicione 1 mL de clorofórmio/metanol (clorofórmio e metanol na proporção 1:1) à pelota e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min no RT e remover o supernaspeso. A adição de metanol e solvente de clorofórmio solubiliza e remove a fração lipídica da biomassa²⁷.
12. À pelota, adicione 1 mL de 100% de acetona e vórtice. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min no RT e remover o supernaspeso. A acetona remove pigmentos como clorofila e ácidos graxos livres da biomassa^28,29.
13. Seque a pelota a 37 °C durante a noite ou prossiga ainda mais pela secagem a vácuo.
    NOTA: A pelota seca é a parede de células brutas usada para a estimativa de celulose cristalina. O processo pode ser pausado neste momento ou continuar usando o secador de vácuo para secagem de amostras.

4. Tratamento com reagente updegraff (ácido acético e nítrico) para remover componentes não celulósicos

NOTA: O protocolo envolve o uso de ácidos e outros produtos químicos. Use equipamentos de proteção individual (EPI) durante todo o processo.

1. Meça 5 mg da pelota de parede de célula bruta seca em um tubo fresco de 2 mL tampado. Observe o peso exato(Figura 3)³⁰.
2. Inclua um controle positivo neste momento. Use 2 mg de papel filtro(Tabela de Materiais)como um controle positivo que produz 80% de teor de celulose.
3. Adicione 1,5 mL do reagente Updegraff ao extrato de parede celular pesado de 5 mg e controle positivo. Misture por vórtice.
   NOTA: O controle positivo deve ser processado da mesma forma que as amostras experimentais a partir desta etapa. Esta etapa deve ser realizada no capô da fumaça com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados.
   ATENÇÃO: Esta etapa deve ser realizada em tubos de tampa de parafuso para evitar respingos de amostra e estalo dos tubos. Três réplicas biológicas de cada amostra, juntamente com três réplicas para controle positivo, devem ser incluídas.
4. Aqueça a suspensão a 100 °C por 30 minutos em um banho de água fervente e esfrie em um banco por 10 minutos. Centrifugar a 25.200 x g por 10 min na RT. Remova o supernatante por centrifugação e salve a pelota.
   NOTA: Os resíduos gerados devem ser coletados separadamente para solventes orgânicos, ácido sulfúrico e reagente updeenx (ácido acético e ácido nítrico). Resíduos com ácido acético e ácido nítrico devem ser mantidos a temperaturas frias com tampas ventiladas e nunca misturados com outros solventes orgânicos e outros ácidos para evitar qualquer explosão.
5. Adicione 1 mL de água à pelota. Centrífuga a 25.200 x g por 10 min na RT. Remova 500 μL do supernasal e adicione 1 mL de acetona ao tubo.
6. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min na RT. Remova 1 mL de supernadante, e adicione 1 mL de acetona ao tubo e centrífuga a 25.200 x g por 5 min na RT.
7. Após a centrifugação, remova todo o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de acetona. Incubar os tubos em temperatura ambiente por 5 minutos e girar a 25.200 x g por 5 min no RT.
8. Descarte o supernatante e salve a pelota. Seque a pelota a 37 °C durante a noite(Figura 3).
   NOTA: O processo pode ser pausado neste momento ou continuar usando o secador de vácuo para secar e seguir para a próxima etapa.

5. Hidrólise de celulose por ácido para produzir unidades monômeros de glicose

1. Adicione 1 mL de ácido sulfúrico de 67% à pelota seca. Vórtice para misturar a pelota completamente no ácido.
2. Agite tubos à temperatura ambiente por 1h para dissolver a pelota de celulose em 67% de ácido sulfúrico.
   NOTA: Como alternativa, a solubilização da pelota de celulose em 67% de ácido sulfúrico pode ser melhorada por sônica de cada amostra por 10 minutos após 30 minutos de incubação no shaker. Após a sônicação, as amostras podem ser re incubadas no shaker em RT. No entanto, observamos a solubilidade completa da pelota de celulose sem sônica quando começamos com 5 mg de extrato de parede celular bruta(Figura 3). Este procedimento funcionou bem para várias amostras de biomassa vegetal³.

6. Medir o teor de glicose pelo ensaio anthrone e estimativa do teor de celulose

1. Nesta fase, a celulose é na forma de monômeros de glicose livres. Determine a quantidade de celulose medindo a quantidade de glicose presente na amostra por espectrofotometria.
2. Pegue 10 μL da amostra da etapa 5 e adicione-a a 490 μL de água destilada estéril para fazer uma diluição de cada amostra para 500 μL. Vortex a mistura diluída de amostra e água por 10 segundos.
3. Adicione 1 mL de 0,2% reagente de anthrone recém-preparado a cada tubo e misture imediatamente por vórtice.
4. Ferva amostras a 100 °C por 10 minutos e esfrie os tubos no gelo por 5 minutos. Transfira 200 μL de cada amostra em três poços de uma placa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em um espectotômetro para medir a absorvância a 620 nm.
   NOTA: Para ferver em alta temperatura, use tubos tampados para evitar respingos de produtos químicos nocivos e para evitar a perda de amostras.

7. Preparação da curva padrão de glicose

1. Para preparar o padrão de glicose, faça um estoque fresco de 1 mg/mL de glicose dissolvendo 10 mg de glicose em 10 mL de água destilada estéril. Adicione esta solução de estoque de 1 mg/mL em incrementos de 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) à água destilada estéril (volume total de 1 mL) para preparar padrões de glicose que variam de 0 μg a 180 concentrações de μg/mL(Figura 3). Vórtice cada padrão de glicose depois de adicionar água estéril.
2. A partir dessas 10 concentrações diferentes, alíquota de 500 μL de cada concentração de glicose em um tubo fresco de 2 mL tampado.
3. Adicione 1 mL de anthrone recém-preparado 0,2% a cada tubo e misture imediatamente por vórtice. Incubar no gelo e ferver a 100 °C por 10 minutos seguido de incubação no gelo por 5 min²³.
4. Transfira 200 μL de cada padrão para três poços em uma placa de 96 poços micro titer para três réplicas técnicas e meça a absorvância em 620 nm(Figura 3).
5. Desenvolva uma curva de glicose padrão, traçando diferentes concentrações de glicose (0 a 180 μg/mL) contra valores de absorção normalizados a 620 nm(Figura 7). Utilize a linha de regressão Y= mx+c gerada a partir dos valores de absorção para calcular o teor de celulose nas amostras preparadas.
   NOTA: As normas de glicose devem ser preparadas recentemente para cada conjunto de experimentos. A concentração da glicose deve ser aumentada se os valores de OD forem muito altos/ baixos para que esses valores se enlouqueçam dentro da faixa dos valores de absorção da curva padrão. A linha de regressão gera diferentes valores m e c com base nos padrões de glicose utilizados para cada lote de amostras. Misture os tubos imediatamente após a adição de anthrone²³. Anthrone, amostras diluídas e padrões preparados sempre foram mantidos frios até que o ensaio de anthrone foi realizado devido à natureza extermímica dessa reação.

Resultados

Foram selecionadas plantas de algodão cultivadas na casa verde para este estudo. Duas diferentes linhas experimentais de algodão foram selecionadas para análise comparativa do teor de celulose. Para cada linha experimental, o tecido radicular foi coletado a partir de três réplicas biológicas. Um total de 500 mg de tecido foi homogeneizado e 20 mg dele foi utilizado para extração de parede celular bruta. Mais tarde, 5 mg de extrato de parede de célula bruta foi usado para o tratamento de reagente updegraff para r...

Discussão

As fibras de algodão são fibras naturais produzidas a partir da semente de algodão. A fibra de algodão é uma única célula com ~95% de teor de celulose² com alto teor de celulose cristalina com aplicações extensas na indústria têxtil³¹. Como, a fibra de algodão contém ~95% de celulose, temos usado tecidos radiculares de algodão para demonstração da estimativa do teor de celulose cristalina. Os tecidos radiculares de algodão são moderadamente ricos em teor d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol