Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse nach der Updegraff-Methode

Zusammenfassung

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung. Der Hauptzweck dieser Demonstration besteht darin, ein detailliertes Updegraff-Protokoll zur Schätzung des Zellulosegehalts in pflanzlichen Biomasseproben bereitzustellen.

Zusammenfassung

Cellulose ist das am häufigsten vorkommende Polymer auf der Erde, das durch Photosynthese erzeugt wird, und die Haupttragende Komponente von Zellwänden. Die Zellwand spielt eine wichtige Rolle für das Pflanzenwachstum und die Entwicklung, indem sie Kraft, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Die Zellwand besteht hauptsächlich aus Cellulose, Lignin, Hemicellulose und Pektin. Kürzlich wurden Pflanzenzellwände für die Biokraftstoff- und Bioenergieproduktion der zweiten Generation ins Visier genommen. Insbesondere wird die Zellulosekomponente der Pflanzenzellwand zur Herstellung von Celluloseethanol verwendet. Die Abschätzung des Zellulosegehalts von Biomasse ist für die grundlagende und angewandte Zellwandforschung von entscheidender Bedeutung. Die Updegraff-Methode ist einfach, robust und die am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse. Die alkoholunlösliche rohzellige Wandfraktion bei behandlung mit Updegraff-Reagenz eliminiert die Hemicellulose- und Ligninfraktionen. Später wird die Updegraff Reagenz-resistente Cellulosefraktion einer Schwefelsäurebehandlung unterzogen, um das Cellulose-Homopolymer in monomere Glukoseeinheiten zu hydrolysieren. Eine Regressionslinie wird mit verschiedenen Glukosekonzentrationen entwickelt und verwendet, um die Menge der Glukose zu schätzen, die bei der Zellulosehydrolyse in den Versuchsproben freigesetzt wird. Schließlich wird der Cellulosegehalt anhand der Menge an Glukosemonomeren durch farbmetrischen Anthronassay geschätzt.

Einleitung

Cellulose ist die primäre tragende Komponente von Zellwänden, die sowohl in primären als auch in sekundären Zellwänden vorhanden ist. Die Zellwand ist eine extrazelluläre Matrix, die Pflanzenzellen umgibt und hauptsächlich aus Zellulose, Lignin, Hemicellulose, Pektin und Matrixproteinen besteht. Ungefähr ein Drittel der Pflanzenbiomasse ist Cellulose¹ und sie spielt eine wichtige Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung, indem sie Stärke, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Baumwollfasern enthalten 95%^{Cellulose-2-Gehalt,} während Bäume 40% bis 50% Zellulose je nach Pflanzenart und Organtypen³enthalten. Die Cellulose besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Cellobiose, einem Disaccharid von Glukoserückständen, die durch β-1,4 glykosidische Bindungen⁴verbunden sind. Cellulose-Ethanol wird aus der Glukose hergestellt, die aus der in den Pflanzenzellwänden vorhandenen Zellulose gewonnen wird⁵. Cellulose Faser besteht aus mehreren Mikrofibrillen, in denen jedes Mikrofibril als Kerneinheit mit 500-15000 Glukosemonomeren^1,6fungiert. Das Cellulose-Homopolymer wird durch Plasmamembran-eingebettete Cellulose-Synthase-Komplexe (CSC's)^1,7synthetisiert. Individuelle Cellulosesynthase A (CESA) Proteine synthetisieren Glucanketten und die angrenzenden Glucanketten sind durch Wasserstoffbindungen zu kristalliner Cellulose^1,8verbunden. Cellulose existiert in mehreren kristallinen Formen mit zwei vorherrschenden Formen, Cellulose I und Cellulose I als native Formen⁹. In höheren Pflanzen existiert Cellulose in Zellulose-I-Form, während untere Pflanzenzellulose in I-Form^10,11existiert. Insgesamt spielt die Zellulose eine wichtige Rolle bei der Stärkung und Steifigkeit der Pflanzenzellwände.

Biokraftstoffe der ersten Generation werden hauptsächlich aus Maisstärke, Rohrzucker und Rübenzucker hergestellt, die Nahrungsquellen sind, während Biokraftstoffe der zweiten Generation sich auf die Biokraftstoffproduktion aus Biomasse-Zellwandmaterial von Non-Food-Pflanzen konzentrieren¹². Die genaue Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts ist nicht nur für die Grundlagenforschung zur Zellulosebiosynthese und Zellwanddynamik wichtig, sondern auch für die Forschung über angewandte Biokraftstoffe und Bioprodukte. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und optimiert für die Abschätzung von Zellulose in der pflanzlichen Biomasse, und die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Zelluloseschätzung. Die erste gemeldete Methode zur Zelluloseschätzung wurde von Cross und Bevan 1908¹³gemeldet. Das Verfahren beruhte auf dem Prinzip der alternativen Chlorierung und Extraktion durch Natriumsulfat. Die durch die ursprüngliche sowie modifizierte Protokolle der Cross- und Bevan-Methode erhaltene Cellulose zeigte jedoch eine Kontamination kleiner Ligninfraktionen zusätzlich zu einer erheblichen Menge an Xylanen und Mannanen¹⁴. Trotz mehrerer Modifikationen zur Entfernung von Lignin und Hemicellulosen aus der Zellulosefraktion behielt die Cross-Bevan-Methode zusammen mit Cellulose eine beträchtliche Menge an Mannanen bei. Später wurde Kurschners Methode unter Verwendung von Salpetersäure und Ethanol zur Extraktion von Cellulose¹⁵entwickelt. Diese Methode besagte, dass die gesamte Lignin und 75% der Pentosane entfernt wurden, aber die wahren Cellulose-Ergebnisse waren die gleichen wie die durch Chlorierungsmethode von Cross und Bevan geschätzt. Eine andere Methode (Norman und Jenkins) wurde unter Verwendung von Methanol-Benzol, Natriumsulfat und Natriumhypochlorit zur Extraktion von Cellulose¹⁶entwickelt. Diese Methode behielt auch einen Bruchteil von Lignin (3%) und signifikante Mengen an Pentosanen, die zu einer genauen Schätzung der Zellulose führen. Später verwendeten Kiesel und Semiganowsky einen anderen Ansatz, um Cellulose mit 80% konzentrierter Schwefelsäure zu hydrolysieren, und die hydrolysierten reduzierten Zucker wurden nach Bertrands Methode¹⁷geschätzt. Die beiden Methoden, Waksman es und Stevens¹⁸ und Salo^14,19, die auf der Grundlage der Kiesel- und Semiganowsky-Methode entwickelt wurden, ergaben ebenfalls 4-5% weniger Zellulosegehalt im Vergleich zu früheren Methoden²⁰.

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Diese Methode wurde erstmals von Updegraff für die Messung von Zellulose im Jahr 1969^{beschrieben 21}. Die Updegraff-Methode integriert die Kurschner-Methode (Verwendung von Salpetersäure), Kiesel- und Seminowsky-Methoden (Hydrolyse von Cellulose in Glukosemonomere mit Schwefelsäure) mit einigen Modifikationen und den Anthron-Assay von Viles und Silverman zur einfachen kolorimetrischen Abschätzung des Glukose- und kristallinen Cellulosegehalts²². Das Prinzip dieser Methode ist die Verwendung von Essigsäure und Salpetersäure (Updegraff Reagenz), um Hemicellulose und Lignin aus den homogenisierten Pflanzengeweben zu entfernen, die essig/Salpetersäure-resistente Cellulose zur Weiterverarbeitung und Schätzung¹⁵zurücklassen. Die essigsäure-/salpetersäureresistente Cellulose wird mit 67% Schwefelsäure behandelt, um die Cellulose in Glukosemonomere zu brechen und die freigesetzten Glukosemonomere werden durch Anthron-Assay^21,23geschätzt. Mehrere Modifikationen der ursprünglichen Updegraff-Methode wurden verwendet, um das Verfahren und die Zelluloseabschätzung durch Anthron-Assay²⁴zu vereinfachen. Im Großen und Ganzen kann diese Methode in fünf Phasen unterteilt werden. In der ersten Phase wird das Pflanzenmaterial vorbereitet. In der zweiten Phase wird die Rohzellwand von der gesamten Biomasse getrennt, da Zellulose der Schlüsselbestandteil von Pflanzenzellwänden ist. Später, in der dritten Phase, wird die Zellulose durch Behandlung mit Updegraff-Reagenz von den nicht-zelluloseischen Zellwandkomponenten getrennt. In der vierten Phase wird die essigsäure-/stickstoffsäureresistente Cellulose durch Schwefelsäurebehandlung in Glukosemonomere gebrochen. Die Schwefelsäurebehandlung von Cellulose führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylfurfuralverbindungen aus der Reaktion von Glukosemonomeren mit Schwefelsäure. Schließlich erzeugt der Anthron in der letzten Phase einen grünlich-blauen Komplex durch Kochen mit der furfuralen Verbindung, die in der vorherigen Phase²⁵erzeugt wurde. Diese anthronbasierte kolorimetrische Methode wurde erstmals 1942 von Dreywood verwendet. Anthrone ist ein Farbstoff, der Furfuralverbindungen von Pentose und Hexose dehydrierte Produkte wie 5-Hydroxymethylfurfural identifiziert, unter sauren Bedingungen. Reaktion mit Hexose produziert eine intensive Farbe und bessere Reaktion im Vergleich zu Pentoses²⁵. Die Menge der gebundenen Glukose wird durch Spektralphotometer-Absorption bei 620 nm gemessen und die Intensität des grünlich-blauen Komplexes ist direkt proportional zur Zuckermenge in der Probe. Die gemessenen Absorptionswerte wurden mit einer Regressionslinie der Glukose-Standardkurve verglichen, um die Glukosekonzentration der Probe zu berechnen. Der gemessene Glukosegehalt wurde verwendet, um den Zellulosegehalt der pflanzenden Biomasse zu schätzen.

Protokoll

1. Experimentelle Zubereitung

1. Getrocknetes Pflanzenmaterial zu einem feinen Pulver mahlen.
2. Protein-Solubilisationspuffer (PSB): Bereiten Sie Lagerlösungen von 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 8.0) vor und autoklavn Sie sie. Machen Sie aus diesen Lagerlösungen einen frischen PSB-Puffer mit Endkonzentrationen von 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) in sterilem Wasser.
3. 100 ml 70% Ethanol (v/v): 70 ml 100% Ethanol und 30 ml steriles Wasser vorbereiten.
4. 100 ml Methanol vorbereiten: Chloroform im Verhältnis 1:1 (50 ml Methanol und 50 ml Chloroform).
5. 82,5 ml Updegraff-Reagenz vorbereiten. 75 ml 80% Essigsäure zu 7,5 ml Salpetersäure hinzufügen, so dass das endgültige Verhältnis von Wasser: Essigsäure: Salpetersäure in 2:8:1 (v/v) ist. Um 80% Essigsäure zuzubereiten, 80 ml Eisessigsäure in 20 ml sterilem Wasser (v/v) auflösen.
6. Bereiten Sie einen frischen Vorrat von 1 mg/ml Glukoselösung vor. 10 mg Glukose in 10 ml Wasser (w/v) auflösen.
7. Zur Zubereitung von 100 ml 67% Schwefelsäure (v/v) 67 ml konzentrierte Schwefelsäure zu 33 ml Wasser hinzufügen. Verwenden Sie immer eine Glasflasche und fügen Sie Säure langsam ins Wasser. Dieser Schritt ist exotherm (gibt Wärme ab). Daher bereiten Sie diese Lösung auf Eis vor und kühlen Sie im Kühlschrank für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch.
8. Bereiten Sie frische 0,2% Anthronung (w/v) für jede Charge von experimentellen Proben vor. 0,2 g Anthronung wiegen und in 100 ml vorgekühlter konzentrierter Schwefelsäure in einer mit Aluminiumfolie umwickelten Glasflasche auflösen. Vor Gebrauch 1-2 Stunden im Kühlschrank aufbewahren.
   HINWEIS: Vorkühlung konzentrierte Schwefelsäure im Kühlschrank am Tag des Experiments, und frische Vorbereitung von Anthronung ist sehr empfehlenswert für eine genaue Abschätzung des Glukosegehalts.

2. Aufbereitung von pflanzlichem Biomassematerial

1. Sammeln Sie pflanzenbasierte Biomasseproben aus 2 Monate alten Baumwoll-Experimentallinien, die im Gewächshaus mit den gleichen Wachstumsbedingungen, der gleichen Entwicklungsstufe, der gleichen Position der Pflanzen und der gleichen Art von Gewebe (Blatt/Stamm/Wurzel) angebaut werden.
   HINWEIS: Sammeln Sie mindestens drei biologische Replikationen für jede Probe. Waschen Sie sie gründlich mit Wasser, um den ganzen Schmutz aus dem Wurzelgewebe zu entfernen.
2. Lufttrockenes Wurzelgewebe für 2 Tage auf Papiertüchern bei Raumtemperatur, um den Feuchtigkeitsgehalt zu entfernen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Lufttrockenes Wunschgewebe zur Zelluloseschätzung, um pilzveruneite.
3. Platzieren Sie die Stammproben in einzelnen Containern. Dann beschriften und trocknen Sie sie im Inkubator bei 49 °C für 10 Tage (Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Alternativ kann ein Gefriertrockner verwendet werden, um das Pflanzengewebe in weniger Zeit (1 oder 2 Tage) zu trocknen, ohne chemische Veränderungen am Pflanzenbiomassematerial zu verursachen.
4. Die getrockneten Proben in kleine Stücke schneiden, in flüssigem Stickstoff einfrieren und mit einem Mörtel und Stößel, einer Gefriermühle oder einem Biomasseschleifer zu gleichmäßigem Feinpulver mahlen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Gefriermühle wurde mit einer Rate von 10 cps für 3 Zyklen verwendet.
5. Sammeln Sie das geerdete Gewebe (Abbildung 2) und fahren Sie mit der Zellwandextraktion fort.
   HINWEIS: Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden, indem die Proben in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. Gewinnung von Rohzellwänden aus pflanzlicher Biomasse

HINWEIS: Die Pflanzenzellwände enthalten Cellulose, Lignin, Nicht-Zellulose-Komponenten, Pektin, Matrixproteine, Phenolverbindungen und Wasser²⁶. Da Cellulose in Zellwänden vorhanden ist, besteht der erste Schritt darin, Zellwandkomponenten von nicht-zelligen Wandkomponenten der pflanzlichen Biomasse zu trennen²⁶.

1. Beschriften und wiegen Sie einzelne leere 2 ml-Rohre, bevor Sie mit dem Extraktionsprozess der Zellwand beginnen.
2. Notieren Sie sich die leerstehenden Rohrgewichte in einem Labornotizbuch, bevor Sie fortfahren.
3. Wiegen Sie 20 mg pulverisiertes Gewebe ab Schritt 2.5 und übertragen Sie es in vorgewogene 2 ml-Rohre und beschriften Sie sie.
4. Fügen Sie 1 ml Protein-Solubilisationspuffer (PSB) (50 mM Tris Hydrochlorid (HCl) Puffer pH 8,8, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzu, um Proteine zu slubilisieren. Vortex und Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet speichern.
   HINWEIS: Der Überstand kann gespeichert werden, wenn die Proteinkomponente analysiert werden muss.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 zwei weitere Male.
6. Zum zurückgehaltenen Pellet 1 ml destilliertes Wasser und Wirbel hinzufügen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie den Überstand.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 zwei weitere Male.
8. Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol in das gespeicherte Pellet, Wirbel und erhitzen Sie es bei 70 °C für 1 h in einem Wasserbad / Wärmeblock, um lösliche Komponenten und Stärke aus den Proben zu entfernen. Vortex und Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet.
9. Wiederholen Sie Schritt 3.8 noch einmal.
10. Zum Pellet 1 ml 100% Methanol und Wirbel hinzufügen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie den Überstand.
11. 1 ml Chloroform/Methanol (Chloroform und Methanol im Verhältnis 1:1) in das Pellet und den Wirbel geben. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand. Die Zugabe von Methanol und Chloroform-Lösungsmittel löst und entfernt die Lipidfraktion aus der Biomasse²⁷.
12. Zum Pellet 1 ml 100% Aceton und Wirbel hinzufügen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand. Aceton entfernt Pigmente wie Chlorophyll und freie Fettsäuren aus der Biomasse^28,29.
13. Das Pellet über Nacht bei 37 °C trocknen oder durch Vakuumtrocknung weiterführen.
    HINWEIS: Das getrocknete Pellet ist die rohe Zellwand, die für die Kristalline Zelluloseschätzung verwendet wird. Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden oder weiter mit Vakuumtrockner zum Trocknen von Proben fortfahren.

4. Behandlung mit Updegraff-Reagenz (Essig- und Salpetersäure) zur Entfernung nicht-zellulosehaltiger Komponenten

HINWEIS: Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Säuren und anderen Chemikalien. Tragen Sie während des gesamten Prozesses persönliche Schutzausrüstung (PSA).

1. Messen Sie 5 mg des getrockneten Rohzellwandpellets in ein frisches 2 ml Schraubrohr. Beachten Sie das genaue Gewicht (Abbildung 3)³⁰.
2. Fügen Sie an dieser Stelle eine positive Steuerung ein. Verwenden Sie 2 mg Filterpapier (Materialtabelle) als positiv zu kontrollieren, der einen Zellulosegehalt von 80 % liefert.
3. 1,5 ml des Updegraff-Reagenzes zu den gewogenen 5 mg Zellwandextrakt und positiver Kontrolle hinzufügen. Mix durch Wirbel.
   ANMERKUNG: Die Positivkontrolle sollte ab diesem Schritt auf die gleiche Weise wie die Versuchsproben verarbeitet werden. Dieser Schritt sollte in der Dunstabzugshaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt werden.
   VORSICHT: Dieser Schritt sollte in Schraubverschlussrohren durchgeführt werden, um das Spritzen von Proben und das Knallen der Rohre zu verhindern. Drei biologische Wiederholungen jeder Probe sowie drei Wiederholungen zur positiven Kontrolle sollten einbezogen werden.
4. Die Aufhängung bei 100 °C 30 min in einem kochenden Wasserbad erhitzen und auf einer Bank 10 min abkühlen lassen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand durch Zentrifugation und speichern Sie das Pellet.
   HINWEIS: Die erzeugten Abfälle sollten getrennt für organische Lösungsmittel, Schwefelsäure und Updegraff-Reagenz (Essigsäure und Salpetersäure) gesammelt werden. Abfälle mit Essigsäure und Salpetersäure sollten bei kühlen Temperaturen mit belüfteten Kappen aufbewahrt und niemals mit anderen organischen Lösungsmitteln und anderen Säuren vermischt werden, um eine Explosion zu verhindern.
5. 1 ml Wasser in das Pellet geben. Zentrifuge bei 25.200 x g für 10 min bei RT. 500 l des Überstandes entfernen und 1 ml Aceton in das Rohr geben.
6. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT. 1 ml Überstand entfernen und 1 ml Aceton in das Rohr und die Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT geben.
7. Nach der Zentrifugation den gesamten Überstand entfernen und das Pellet in 1 ml Aceton aussetzen. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 5 min und drehen Sie bei 25.200 x g für 5 min bei RT.
8. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet. Das Pellet über Nacht bei 37 °C trocknen (Abbildung 3).
   HINWEIS: Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden oder weiter vakuumtrockner zum Trocknen verwenden und mit dem nächsten Schritt fortfahren.

5. Hydrolyse von Cellulose durch Säure zur Herstellung von Glukosemonomereinheiten

1. 1 ml 67% Schwefelsäure in das getrocknete Pellet geben. Wirbel, um das Pellet vollständig in der Säure zu mischen.
2. Schütteln Sie Rohre bei Raumtemperatur für 1 h, um das Cellulosepellet in 67% Schwefelsäure aufzulösen.
   HINWEIS: Alternativ kann die Löslichkeit des Cellulosepellets in 67% Schwefelsäure durch Beschallung jeder Probe für 10 min nach 30 min Inkubation im Shaker verbessert werden. Nach der Beschallung können Proben im Shaker bei RT erneut inkubiert werden. Jedoch, Wir beobachteten vollständige Löslichkeit von Cellulose-Pellet ohne Beschallung, wenn wir mit 5 mg rohen Zellwandextrakt beginnen (Abbildung 3). Dieses Verfahren funktionierte gut für verschiedene pflanzliche Biomasseproben³.

6. Messung des Glukosegehalts durch anthronenasund Abschätzung des Zellulosegehalts

1. In diesem Stadium ist die Zellulose in Form von freien Glukosemonomeren. Bestimmen Sie die Cellulosemenge, indem Sie die in der Probe vorhandene Glukosemenge mittels Spektrophotometrie messen.
2. Nehmen Sie 10 l der Probe aus dem Schritt 5 und fügen Sie sie zu 490 l sterilem destilliertem Wasser hinzu, um eine Verdünnung jeder Probe auf 500 l zu machen. Wirbel das verdünnte Gemisch aus Probe und Wasser für 10 Sekunden.
3. 1 ml 0,2% frisch zubereitetes Anthronreagenz in jedes Rohr geben und sofort durch Wirbeln mischen.
4. Proben bei 100 °C 10 min kochen und die Schläuche auf Eis 5 min abkühlen. Übertragen Sie 200 l jeder Probe in drei Brunnen einer 96-Well-Platte. Laden Sie die 96-Well-Platte in ein Spektralphotometer, um die Absorption bei 620 nm zu messen.
   HINWEIS: Zum Kochen bei hohen Temperaturen verwenden Sie schraubkappende Rohre, um das Spritzen schädlicher Chemikalien zu verhindern und den Verlust von Proben zu vermeiden.

7. Vorbereitung der Glukose-Standardkurve

1. Um den Glukosestandard vorzubereiten, machen Sie einen frischen Vorrat von 1 mg/ml Glukose, indem Sie 10 mg Glukose in 10 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Fügen Sie diese Stammlösung von 1 mg/ml in 20 L-Schritten (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 l) in steriles destilliertes Wasser (Gesamtvolumen 1 ml) hinzu, um Glukosestandards zwischen 0 g und 180 g/ml -Konzentrationen zu erstellen (Abbildung 3). Wirbel jeden Glukose-Standard nach Zugabe von sterilem Wasser.
2. Aus diesen 10 verschiedenen Konzentrationen werden 500 l jeder Glukosekonzentration in ein frisches 2 ml Schraubrohr umgewandelt.
3. 1 ml frisch zubereitete 0,2% Anthronung in jedes Rohr geben und sofort durch Wirbeln mischen. Auf Eis bebrüten und bei 100 °C 10 min kochen, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für 5 min²³.
4. Übertragen Sie 200 l jeder Norm auf drei Bohrungen in einer 96-Well-Mikrotiterplatte für drei technische Replikationen und messen Sie die Absorption bei 620 nm (Abbildung 3).
5. Entwickeln Sie eine Standard-Glukosekurve, indem Sie verschiedene Glukosekonzentrationen (0 bis 180 g/ml) gegen normalisierte Absorptionswerte bei 620 nm(Abbildung 7) nachzeichnen. Verwenden Sie die Regressionslinie Y= mx+c, die aus den Absorptionswerten generiert wird, um den Cellulosegehalt in den vorbereiteten Proben zu berechnen.
   HINWEIS: Glukosestandards müssen für jeden Versuchssatz frisch vorbereitet werden. Die Konzentration der Glukose sollte erhöht werden, wenn die OD-Werte zu hoch/niedrig sind, so dass diese Werte in den Bereich der Standardkurvenabsorptionswerte fallen. Die Regressionslinie erzeugt unterschiedliche m- und c-Werte basierend auf den Glukosestandards, die für jede Probencharge verwendet werden. Mischen Sie Rohre unmittelbar nach dem Hinzufügen von anthrone²³. Anthronung, verdünnte Proben und vorbereitete Standards wurden immer kalt gehalten, bis der Anthron-Assay wegen der exothermen Natur dieser Reaktion durchgeführt wurde.

Ergebnisse

Für diese Studie wurden Baumwollpflanzen ausgewählt, die im grünen Haus angebaut wurden. Für die vergleichende Analyse des Zellulosegehalts wurden zwei verschiedene Versuchslinien aus Baumwolle ausgewählt. Für jede versuchsweise Linie wurde das Wurzelgewebe aus drei biologischen Repliken entnommen. Insgesamt 500 mg Gewebe wurde homogenisiert und 20 mg davon wurde für die Rohzellwandextraktion verwendet. Später wurden 5 mg Rohzell-Wandextrakt zur Behandlung von Updegraff-Reagenzien verwendet, um Hemicellulose und ...

Diskussion

Baumwollfasern sind Naturfasern, die aus dem Baumwollsaat hergestellt werden. Baumwollfaser ist eine Einzelzelle mit einem Cellulosegehalt von⁹⁵ % 2 mit hohem kristallinem Zellulosegehalt mit umfangreichen Anwendungen in der Textilindustrie³¹. Da Baumwollfasern 95 % Cellulose enthalten, haben wir Baumwollwurzelgewebe verwendet, um die Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts zu demonstrieren. Baumwollwurzelgewebe sind mäßig reich an kristallinem Zellulosegehalt und st...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol