Updegraff法による植物バイオマスの結晶セルロース含有量の推定

要約

Updegraff法はセルロース推定に最も広く用いられている方法です。本デモの主な目的は、植物バイオマスサンプル中のセルロース含有量を推定するための詳細なUpdegraffプロトコルを提供することです。

要約

セルロースは、光合成によって生成される地球上で最も豊富なポリマーであり、細胞壁の主な耐荷重成分です。細胞壁は、強さ、剛性、細胞増殖の速度と方向、細胞形状維持、および生物および無生物性ストレッサーからの保護を提供することにより、植物の成長と開発に重要な役割を果たしています。細胞壁は主にセルロース、リグニン、ヘミセルロースおよびペクチンで構成される。近年、植物細胞壁は第二世代バイオ燃料とバイオエネルギー生産を目標としている。具体的には、植物細胞壁のセルロース成分がセルロース系エタノールの製造に用いられる。バイオマスのセルロース含量の推定は、基本的な応用細胞壁の研究に不可欠です。Updegraff法は、植物バイオマスの結晶セルロース含有量の推定に、シンプルで堅牢で最も広く使用されている方法です。Updegraff試薬による処理時のアルコール不溶性粗細胞壁分率は、ヘミセルロースおよびリグニン画分を排除する。その後、Updegraff試薬耐性セルロース画分を硫酸処理を施し、セルロースホモポリマーを単量グルコース単位に加水分解する。回帰直線は、ブドウ糖の様々な濃度を使用して開発され、実験サンプル中のセルロース加水分解時に放出されるグルコースの量を推定するために使用されます。最後に、セルロース含有量は、色分け制即位アッセイによるグルコースモノマーの量に基づいて推定される。

概要

セルロースは、セルウォールの一次耐荷重成分で、一次セル壁と第二次セル壁の両方に存在します。細胞壁は植物細胞を取り囲む細胞外マトリックスであり、主にセルロース、リグニン、ヘミセルロース、ペクチン、マトリックスタンパク質で構成されています。植物バイオマスの約3分の1はセルロース¹であり、強さ、剛性、細胞増殖の速度と方向、細胞形状維持、生物および無生物的ストレッサーからの保護を提供することにより、植物の成長と開発において重要な役割を果たしています。綿繊維は95%セルロース²含み、一方、樹木は植物種および臓器タイプ³に応じてセルロースの40%〜50%を含む。セルロースは、セロビオースの反復単位から構成され、β-1,4グリコシド結合により接続されたグルコース残基の二糖体^4。セルロース系エタノールは、植物細胞壁⁵に存在するセルロースに由来するグルコースから製造される。セルロース繊維は、各マイクロフィブリルが500-15000グルコースモノマー^1,6を有するコアユニットとして作用するいくつかのマイクロフィブリルから構成される。セルロースホモポリマーは、セルロース合成錯体(CSC)1,7の細胞膜埋め込みセルロース合成錯体によって合成される。個々のセルロース合成酵素A(CESA)タンパク質は、グルカン鎖と隣接するグルカン鎖を合成し、水素結合により結合して結晶セルロース^1,8を形成する。セルロースは、2つの主要な形態を有する数種類の結晶形で存在する、セルロースIα及びセルロースIβを天然型9として挙^げる。高等植物では、セルロースIβ型にセルロースが存在し、一方、低い植物のセルロースはIα形態^10,11に存在する。全体的に、セルロースは、植物細胞壁に強度と剛性を付与する上で重要な役割を果たしています。

第一世代のバイオ燃料は、主に食料源であるトウモロコシデンプン、サトウキビ糖、ビート糖から製造され、第二世代のバイオ燃料は非食品植物バイオマス電池壁材料¹²からのバイオ燃料生産に焦点を当てている。結晶セルロース含有量の正確な推定は、セルロース生合成や細胞壁ダイナミクスの基礎研究だけでなく、応用バイオ燃料やバイオ製品の研究にも重要です。植物バイオマスにおけるセルロースの推定に向けて様々な方法が開発され、最適化されており、セルロース推定法として最も広く使用されているUpdegraff法です。セルロース推定の最初の報告された方法は、1908年¹³年にクロスとベバンによってであった。この方法は、硫酸ナトリウムによる代替塩素化および抽出の原理に基づいていた。しかしながら、CrossおよびBevan法の原本および改変プロトコルによって得られたセルロースは、かなりの量のキシランおよびマンナン¹⁴に加えて、リグニンの小さい分画の汚染を示した。セルロース分画からリグニンとヘミセルロースを除去するためにいくつかの変更にもかかわらず、クロスベバン法はセルロースと一緒にマンナンのかなりの量を保持しました。後に、クルシュナーの方法は、セルロース¹⁵を抽出するために硝酸とエタノールを採用することによって開発された。この方法では、総リグニンとペントサンの75%が除去されたが、真のセルロースの結果は、クロスとベバンの塩素化方法によって推定されたものと同じであると述べた。別の方法(ノーマンとジェンキンス)は、メタノールベンゼン、硫酸ナトリウム、および次亜塩素酸ナトリウムを使用してセルロース¹⁶を抽出することによって開発された。この方法はまた、リグニンの一部を保持しました (3%)セルロースの正確な推定につながるペントサンのかなりの量。その後、KieselとSemiganowskyは、80%の濃硫酸を用いてセルロースを加水分解する別のアプローチを用い、加水分解還元糖をベルトランの方法¹⁷によって推定した。2つの方法は、キーゼルとセミガノフスキーの方法に基づいて開発されたワクスマンとスティーブンス¹⁸とサロ^14、19、また、以前の方法²⁰と比較して4〜5%少ないセルロース含有量を生み出した。

Updegraff法は、結晶セルロース含有量の推定に最も広く使用されている方法です。この方法は、1969^年21年にセルロースの測定のためにUpdegraffによって最初に説明された。Updegraff法は、クルシュナー法(硝酸の使用)、キーゼル法およびセミノフスキー法(硫酸を用いたグルコースモノマーへのセルロースの加水分解)をいくつかの改変と統合し、グルコースおよび結晶セルロース含有量^の単純な着色推定のためのVilesとシルバーマンの即位アッセイを統合する。この方法の原理は、酢酸および硝酸(Updegraff試薬)を使用して、ヘミセルロースおよびリグニンを均質化した植物組織から排除し、さらに処理および推定のために酢酸/硝酸耐性セルロースを残^す。酢酸/硝酸耐性セルロースは、セルロースをグルコースモノマーに分解するために67%の硫酸で処理され、放出されたグルコースモノマーは、即位アッセイ^21、23によって推定される。元のUpdegraff法のいくつかの変更は、即位アッセイ²⁴による手順およびセルロース推定を簡素化するために使用された。大まかに言えば、この方法は5つのフェーズに分けることができる。第1段階では、植物材料が調製される。第2段階では、セルロースが植物細胞壁の重要な構成要素であるため、粗細胞壁はバイオマス全体から分離される。後に、第3段階において、セルロースはUpdegraff試薬で処理することにより非セルロース細胞壁成分から分離される。第4段階では、酢酸/硝酸耐性セルロースは硫酸処理によりグルコース単量体に分解される。セルロースの硫酸処理は、グルコースモノマーと硫酸の反応から5-ヒドロキシメチルフルフラール化合物の生成をもたらす。最後に、最後の段階では、即位は、前のフェーズ²⁵で生成されたフルフラール化合物で沸騰することによって緑がかった青い複合体を生成する。この即位の色測定法は、1942年にドレイウッドによって初めて使用されました。アントロンは、5-ヒドロキシメチルフルフラールなどの脱水物、酸性条件下でペントースおよびヘキソーゼのフルフラール化合物を識別する色素です。ヘキソスとの反応は、ペントース²⁵と比較して強烈な色と良い応答を生成します。結合グルコースの量は、620nmの分光光度計の吸光度で測定され、緑がかった青色錯体の強度は、試料中の糖の量に直接比例する。測定された吸光度値をグルコース標準曲線回帰線と比較し、試料のグルコース濃度を算出した。測定したグルコース含有量を使用して、植物バイオマスのセルロース含有量を推定した。

プロトコル

1. 実験準備

1. 乾燥した植物材料を細かい粉末に粉砕します。
2. タンパク質可溶化バッファー (PSB): 1 M トリス (pH 8.8)、0.5 M エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA) (pH 8.0) のストック溶液を準備し、それらをオートクレーブします。50 mMトリス、0.5 mM EDTA、10%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を滅菌水中で最終的な濃度で、これらのストック溶液から新鮮なPSBバッファーを作ります。
3. 70%エタノール(v/v)の100 mLを調製:70 mLの100%エタノールと30mLの無菌水を調製します。
4. 100 mLのメタノールを調製:クロロホルムを1:1比(50 mL メタノールと50 mLクロロホルム)で調製します。
5. 82.5 mLのアップデグラフ試薬を調製します。水の最終的な比率になるように硝酸の7.5 mLに80%酢酸の75 mLを加える:酢酸:硝酸は2:8:1(v/v)にあります。80%酢酸を調製するには、80mLの氷酢酸を20mLの滅菌水(v/v)に溶解します。
6. 1 mg/mLのグルコース溶液の新鮮なストックを準備します。10mLの水(w/v)に10mgのグルコースを溶かします。
7. 67%の硫酸(v/v)の100 mLを調製し、33mLの水に67mLの濃縮硫酸を加える。常にガラス瓶を使用し、ゆっくりと水に酸を加えます。このステップは発熱性である(熱を放出する)。したがって、氷の上にこの溶液を準備し、使用前に少なくとも2時間冷蔵庫で冷却します。
8. 実験サンプルの各バッチに対して、0.2%の新しい即位(w/v)を準備します。0.2gの玉座を秤量し、アルミニウム箔で包んだガラス瓶に冷蔵濃縮硫酸100mLに溶解します。冷蔵庫で1~2時間お使いください。
   注:実験当日に冷蔵庫に濃縮硫酸を事前に冷却し、新たな即位の調製は、グルコース含有量の正確な推定のために強くお勧めします。

植物バイオマス材料の製造

1. 同じ成長条件、同じ開発段階、植物の同じ位置と同じタイプの組織(葉/茎/根)と温室で栽培された2ヶ月の古い綿実験ラインから植物バイオマスサンプルを収集します。
   注:各サンプルに対して最低 3 つの生物学的複製を収集します。水で十分に洗い流し、根組織から汚れを取り除きます。
2. 空気乾燥根組織は、水分を除去するために室温でペーパータオルに2日間(図1)を除去する。
   注:任意の真菌汚染を防ぐためにセルロース推定のための空気乾燥所望の組織。
3. ルート サンプルを個々のコンテナーに配置します。その後、49°Cのインキュベーターで10日間ラベルを付けて乾燥させます(材料表)。
   注:あるいは、凍結乾燥機は、植物バイオマス材料に化学変化を起こすことなく、より短時間(1日または2日)で植物組織を乾燥させるために使用することができる。
4. 乾燥したサンプルを小さく切り、液体窒素で凍結し、乳鉢と害虫、冷凍工場、またはバイオマスグラインダーを使用して均一な微粉末に粉砕する(図1)。
   注:冷凍工場は3サイクルで10cpsの速度で使用されました。
5. 接地された組織(図2)を収集し、細胞壁の抽出を進めます。
   注: この時点で、サンプルを室温で気密容器に保管することで、プロセスを一時停止できます。

植物バイオマスからの粗細胞壁の抽出

注:植物細胞壁には、セルロース、リグニン、非セルロース成分、ペクチン、マトリックスタンパク質、フェノール化合物、および水²⁶が含まれています。セルロースは細胞壁に存在するので、第一のステップは、植物バイオマス²⁶の非細胞壁成分から細胞壁成分を分離するものである。

1. 細胞壁抽出プロセスを開始する前に、個々のブランク2 mLチューブにラベルを付け、重量を量ります。
2. さらに進む前に、ラボ ノートブックに空のチューブウェイトを書き留めます。
3. ステップ2.5から粉末状組織の20mgを秤量し、あらかじめ計量した2mLチューブに移し、ラベルを付けます。
4. タンパク質可溶化バッファー (PSB) (50 mM 塩酸塩 (HCl) バッファー pH 8.8、0.5 mM EDTA、および 10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を加え、タンパク質を可溶化します。室温(RT)で5分間25,200 x gで渦と遠心分離機。遠心後、上清を捨ててペレットを保存します。
   注:タンパク質成分を分析する必要がある場合は、上清を保存することができます。
5. ステップ 3.4 をさらに 2 回繰り返します。
6. 保持されたペレットに、蒸留水と渦の1 mLを加えます。室温(RT)で5分間25,200xgの遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。
7. ステップ 3.6 をさらに 2 回繰り返します。
8. 保存したペレットに70%エタノールの1 mLを加え、渦を加え、水浴/熱ブロックで70°Cで1時間加熱し、サンプルから可溶性成分とデンプンを除去します。RTで5分間25,200 x gの渦と遠心分離機を捨て、ペレットを保存します。
9. ステップ 3.8 をもう一度繰り返します。
10. ペレットに100%メタノールおよび渦の1mLを加える。室温(RT)で5分間25,200xgの遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。
11. ペレットと渦に1mLのクロロホルム/メタノール(クロロホルムとメタノールを1:1比で)加えます。25,200 x gでRTで5分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。メタノールおよびクロロホルム溶媒を添加すると、バイオマス²⁷から脂質分画を可溶化除去する。
12. ペレットに、100%アセトンと渦の1mLを加えます。室温で5分間インキュベートします。25,200 x gでRTで5分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。アセトンは、バイオマス^28,29からクロロフィルや遊離脂肪酸などの顔料を除去する。
13. ペレットを一晩37°Cで乾燥するか、真空乾燥によりさらに進行する。
    注:乾燥ペレットは、結晶セルロース推定に使用される粗細胞壁です。この時点でプロセスを一時停止するか、サンプルを乾燥するための真空乾燥機を使用してさらに進むことができます。

4. 非セルロース成分を除去するためのUpdegraff試薬(酢酸および硝酸)による治療

注:プロトコルは、酸やその他の化学物質の使用を含みます。プロセス全体を通して、個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. 乾燥した粗細胞壁ペレットの5mgを新鮮な2mLねじキャップチューブに測定します。正確な重み (図 3)³⁰に注意してください。
2. この時点で正のコントロールを含めます。80%セルロース含量を得る正のコントロールとして、2mgの濾紙(材料表)を使用してください。
3. 重量を量った5mgの細胞壁抽出物および陽性対照にUpdegraff試薬の1.5 mLを加える。渦を混ぜます。
   注: 正のコントロールは、このステップ以降の実験サンプルと同じ方法で処理する必要があります。このステップは、適切な個人用保護具(PPE)とヒュームフードで行われるべきです。
   注意:このステップは、サンプルの飛び散りやチューブの飛び出しを防ぐためにスクリューキャップチューブで行う必要があります。各サンプルの3つの生物学的複製と、陽性制御のための3つの複製を含めるべきである。
4. 沸騰水槽で30分間100°Cで懸濁液を熱し、ベンチで10分間冷やします。25,200 x gで10分間の遠心分離器を10分間で、遠心分離によって上清を除去し、ペレットを保存します。
   注:生成された廃棄物は、有機溶剤、硫酸、およびUpdegraff試薬(酢酸および硝酸)のために別々に収集する必要があります。酢酸と硝酸の廃棄物は、換気キャップで涼しい温度で保管し、爆発を防ぐために他の有機溶媒および他の酸と混合しないでください。
5. ペレットに1mLの水を加えます。25,200 x gでRTで10分間遠心分離機を取り出し、チューブにアセトンを1 mL加えます。
6. 25,200 x gで5分間の遠心分離機 RT. 上清の 1 mL を除去し、チューブにアセトン 1 mL を加え、25,200 x g で遠心分離機を 25,200 x g で RT で 5 分間追加します。
7. 遠心分離後、上清をすべて取り除き、1mLのアセトンにペレットを懸濁します。室温で5分間チューブをインキュベートし、RTで5分間25,200 x gでスピンします。
8. 上清を捨ててペレットを保存します。ペレットを一晩37°Cで乾燥させます(図3)。
   注: この時点でプロセスを一時停止するか、さらに乾燥のための真空乾燥機を使用して続行し、次のステップに進むことができます。

5. グルコースモノマー単位を生成する酸によるセルロースの加水分解

1. 乾燥ペレットに67%の硫酸1mLを加えます。ボルテックスは、酸中にペレットを完全に混合する。
2. セルロースペレットを67%硫酸に溶解させるために1時間室温でチューブを振る。
   注:代替として、67%硫酸中のセルロースペレットの可溶化は、シェーカーで30分のインキュベーションの後10分間、各サンプルの超音波処理によって改善することができます。超音波処理の後、サンプルはRTでシェーカーで再インキュベートすることができます。しかし、5mgの粗細胞壁抽出物から始めると、超音波処理を行わないセルロースペレットの完全な溶解性を観察した(図3)。この手順は、様々な植物バイオマスサンプル³に対してうまく機能しました。

6. セルロース含有率の測定と評価によるグルコース含有量の測定

1. この段階では、セルロースは遊離グルコースモノマーの形態である。分光光度法により試料中に存在するグルコース量を測定することによりセルロースの量を決定する。
2. ステップ5からサンプル10μLを取り、490μLの滅菌蒸留水に加え、各サンプルを500 μLに希釈します。
3. 各チューブに0.2%の新たに調製した即位試薬の1 mLを加え、ボルテックスですぐに混合します。
4. サンプルを100°Cで10分間沸騰させ、氷上で5分間冷却します。各サンプルの200 μLを96ウェルプレートの3つのウェルに移します。96ウェルプレートを分光光度計に積み込み、620nmで吸光度を測定します。
   注:高温で沸騰する場合は、有害な化学物質の飛散を防ぎ、サンプルの損失を避けるために、ねじ込みチューブを使用してください。

7. グルコース標準曲線の調製

1. グルコース標準を調製するには、10ミリグラムの無菌蒸留水に10mgのグルコースを溶解して1mg/mLグルコースの新鮮なストックを作ります。このストック溶液を20μL単位で20μL(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180 μL)に加えて、無菌蒸留水(総体積1mL)に添加し、0μgから180μg/mL濃度のグルコース基準を調製します(図3)。無菌水を添加した後の各グルコース標準をボルテックス。
2. これらの10の異なる濃度から、各グルコース濃度のアリコート500μLは、新鮮な2mLスクリューキャップチューブに。
3. 各チューブに作りたての0.2%の玉座の1 mLを追加し、渦によってすぐに混ぜます。氷の上でインキュベートし、100°Cで10分間沸騰し、その後氷の上で5分間²³分間インキュベーションを行います。
4. 各規格の200 μLを3つの技術的複製のための96ウェルマイクロ力価板の3つの井戸に移し、620 nmで吸光度を測定する(図3)。
5. 620 nmで正規化された吸光度値に対して異なるグルコース濃度(0〜180 μg/mL)をプロットすることにより、標準グルコース曲線を開発する(図7)。吸光度値から生成された回帰直線 Y= mx+c を使用して、準備されたサンプルのセルロース含量を計算します。
   注:グルコース基準は、実験の各セットに対して新たに準備する必要があります。OD値が高すぎる/低い場合、これらの値が標準曲線吸光度値の範囲内に収まるようにグルコースの濃度を増加する必要があります。回帰直線は、サンプルの各バッチに使用されるグルコース基準に基づいて異なるmとc値を生成します。即位²³の追加直後にチューブをミックス。この反応の発熱性のために、即位、希釈されたサンプルおよび調製された標準は、即位アッセイが行われるまで常に冷たく保たれていた。

結果

緑の家で栽培された綿の植物がこの研究のために選ばれました。セルロース含量の比較分析のために、2種類の実験用コットンを選択した。各実験ラインについて、3つの生物学的複製物から根組織を採取した。合計500mgの組織を均質化し、20mgの粗細胞壁抽出に使用した。その後、5mgの粗細胞壁抽出物を、セルロースからヘミセルロースおよびリグニンを除去するUpdegraff試薬処理に使用した。?...

ディスカッション

綿繊維は綿実から生み出される天然繊維です。綿繊維は、繊維工業³¹における広範な用途を有する高結晶セルロース含有量を有するセルロース含有量2〜95%のセルロースを有する単一細胞である。綿繊維は、約95%のセルロースを含み、結晶セルロース含有量の推定の実証に綿根組織を用いた。綿根組織は、結晶セルロース含有量が適度に豊富であり、一般的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol