Estimation de la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale à l’aide de la méthode Updegraff

Résumé

La méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. L’objectif principal de cette démonstration est de fournir un protocole updegraff détaillé pour l’estimation de la teneur en cellulose dans les échantillons de biomasse végétale.

Résumé

La cellulose est le polymère le plus abondant sur Terre généré par la photosynthèse et le principal composant porteur des parois cellulaires. La paroi cellulaire joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La paroi cellulaire est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose et pectine. Récemment, les parois cellulaires végétales ont été ciblées pour la production de biocarburants et de bioénergie de deuxième génération. Plus précisément, la composante cellulose de la paroi cellulaire végétale est utilisée pour la production d’éthanol cellulosique. L’estimation de la teneur en cellulose de biomasse est essentielle pour la recherche fondamentale et appliquée sur les paroi cellulaires. La méthode Updegraff est simple, robuste et la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale. La fraction insoluble de mur brut d’alcool de cellules au traitement avec le réagent d’Updegraff élimine les fractions d’hémicellulose et de lignine. Plus tard, la fraction résistante à la cellulose réaccétique Updegraff est soumise à un traitement à l’acide sulfurique pour hydrolyser l’homopolymère de cellulose en unités de glucose monomères. Une ligne de régression est développée en utilisant diverses concentrations de glucose et utilisée pour estimer la quantité de glucose libérée sur l’hydrolyse de cellulose dans les échantillons expérimentaux. Enfin, la teneur en cellulose est estimée en fonction de la quantité de monomères de glucose par essai colorimétrique anthrone.

Introduction

La cellulose est le principal composant porteur de charges des parois cellulaires, qui est présent dans les parois cellulaires primaires et secondaires. La paroi cellulaire est une matrice extracellulaire qui entoure les cellules végétales et est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose, pectine et protéines matricielles. Environ un tiers de la biomasse végétale est la cellulose^{1 et elle} joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La fibre de coton contient 95% de cellulose² contenu, tandis que les arbres contiennent 40% à 50% de cellulose selon les espèces végétales et les types^{d’organes 3}. La cellulose est composée d’unités répétées de cellobiose, un disaccharide de résidus de glucose reliés par β-1,4 liaisons glycosidiques⁴. L’éthanol cellulosique est produit à partir du glucose dérivé de la cellulose présente dans les parois cellulaires^{végétales 5}. La fibre cellulosique est composée de plusieurs micro fibrilles dans lesquelles chaque micro fibril agit comme unité centrale avec 500-15000 monomères de glucose^1,6. L’homopolymère de cellulose est synthétisé par des complexes de synthase de cellulose embarqués par membrane plasmatique (CSC)^1,7. Les protéines individuelles de synthase de cellulose A (CESA) synthétisent des chaînes de glucane et les chaînes de glucanes adjacentes sont reliées par des liaisons hydrogène pour former la cellulose cristalline^1,8. La cellulose existe sous plusieurs formes cristallines avec deux formes prédominantes, la cellulose Iα et la cellulose Iβ sous forme de formes indigènes⁹. Dans les plantes supérieures, la cellulose existe sous forme de cellulose Iβ tandis que la cellulose végétale inférieure existe sous forme Iα^10,11. Dans l’ensemble, la cellulose joue un rôle important en donnant de la force et de la rigidité aux parois des cellules végétales.

Les biocarburants de première génération sont principalement produits à partir de amidon de maïs, de sucres de canne et de sucres de betterave, qui sont des sources alimentaires, tandis que les biocarburants de deuxième génération se concentrent sur la production de biocarburants à partir de matériaux non alimentaires de paroi cellulaire à base de cellules de^{biomasse végétale 12}. L’estimation précise de la teneur en cellulose cristalline est non seulement importante pour la recherche fondamentale sur la biosynthèse de la cellulose et la dynamique des paroi cellulaires, mais aussi pour la recherche appliquée sur les biocarburants et les bioprodits. Diverses méthodes ont été développées et optimisées pour l’estimation de la cellulose dans la biomasse végétale, et la méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. La première méthode rapportée pour l’estimation de cellulose était par Croix et Bevan en 1908¹³. La méthode était basée sur le principe de la chloration et de l’extraction alternatives par sulfate de sodium. Cependant, la cellulose obtenue par les protocoles originaux et modifiés de la méthode Cross et Bevan a montré la contamination de petites fractions de lignine en plus d’une quantité substantielle de xylans et mannans¹⁴. En dépit de plusieurs modifications pour enlever la lignine et les hémicelluloses de la fraction de cellulose, la méthode de Cross-Bevan a conservé une quantité considérable de mannans avec la cellulose. Plus tard, la méthode de Kurschner a été développée en employant l’acide nitrique et l’éthanol pour extraire la cellulose^15. Cette méthode a déclaré que la lignine totale et 75% des pentosans ont été enlevés, mais les résultats réels de cellulose étaient les mêmes que ceux estimés par la méthode de chloration de Cross et Bevan. Une autre méthode (Norman et Jenkins) a été développée en employant le méthanol-benzène, le sulfate de sodium, et l’hypochlorite de sodium pour extraire la cellulose^16. Cette méthode a également conservé une fraction de lignine (3%) et des quantités importantes de pentosans conduisant à une estimation précise de la cellulose. Plus tard, Kiesel et Semiganowsky ont utilisé une approche différente pour hydrolyser la cellulose en utilisant 80% d’acide sulfurique concentré, et les sucres réduits hydrolysés ont été estimés par la méthode de Bertrand¹⁷. Les deux méthodes, Waksman et Stevens^{18 et} Salo¹⁴,^{19 qui}ont été développées sur la base de la méthode de Kiesel et Semiganowsky, ont également donné 4-5% moins de contenu en cellulose par rapport aux méthodes antérieures²⁰.

La méthode Updegraff est la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Cette méthode a été décrite pour la première fois par Updegraff pour la mesure de la cellulose en 1969²¹. La méthode Updegraff intègre la méthode Kurschner (utilisation d’acide nitrique), les méthodes Kiesel et Seminowsky (hydrolyse de cellulose dans les monomères de glucose utilisant de l’acide sulfurique) avec quelques modifications, et l’essai anthrone de Viles et Silverman pour une estimation colorimétrique simple du glucose et de la teneur en cellulose cristalline²². Le principe de cette méthode est l’utilisation de l’acide acétique et de l’acide nitrique (réagent updegraff) pour éliminer l’hémicellulose et la lignine des tissus végétaux homogénéisés, qui laisse la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique pour un traitement et une estimation^{ultérieurs 15}. La cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est traitée avec 67% d’acide sulfurique pour casser la cellulose en monomères de glucose et les monomères de glucose libérés sont estimés par essai anthrone^21,23. Plusieurs modifications de la méthode originale d’Updegraff ont été employées pour simplifier la procédure et l’estimation de cellulose par l’essai anthrone^24. Dans l’ensemble, cette méthode peut être divisée en cinq phases. Dans la première phase, le matériel végétal est préparé. Dans la deuxième phase, la paroi cellulaire brute est séparée de la biomasse totale, car la cellulose est le composant clé des parois cellulaires végétales. Plus tard, dans la troisième phase, la cellulose est séparée des composants non cellulosiques de la paroi cellulaire en traitant avec le réaccente Updegraff. Dans la quatrième phase, la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est divisée en monomères de glucose par traitement à l’acide sulfurique. Le traitement acide sulfurique de la cellulose entraîne la formation de composés 5 hydroxyméthylfurfural de la réaction des monomères de glucose avec de l’acide sulfurique. Enfin, dans la dernière phase, l’anthrone génère un complexe bleu verdâtre en bouillant avec le composé furfural généré dans la phase^{précédente 25}. Cette méthode colorimétrique à base d’anthrone a été utilisée pour la première fois en 1942 par Dreywood. Anthrone est un colorant qui identifie les composés furfural de pentose et de produits déshydratés à l’hexose tels que les produits déshydratés 5 hydroxyméthylfurfural, dans des conditions acides. La réaction avec l’hexose produit une couleur intense et une meilleure réponse comparée aux pentoses^25. La quantité de glucose lié est mesurée par absorption du spectrophotomètre à 620 nm et l’intensité du complexe bleu verdâtre est directement proportionnelle à la quantité de sucre dans l’échantillon. Les valeurs d’absorption mesurées ont été comparées à une ligne standard de régression de courbe de glucose pour calculer la concentration de glucose de l’échantillon. La teneur mesurée en glucose a été utilisée pour estimer la teneur en cellulose de la biomasse végétale.

Protocole

1. Préparation expérimentale

1. Moudre le matériel végétal séché en poudre fine.
2. Tampon de solubilisation protéique (PSB) : Préparez des solutions de stock de 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M d’acide éthylèneediaminetétraacetic (EDTA) (pH 8.0) et autoclavez-les. Faites tampon PSB frais de ces solutions de stock avec des concentrations finales de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA et 10% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) dans l’eau stérile.
3. Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % (v/v) : 70 mL d’éthanol à 100 % et 30 mL d’eau stérile.
4. Préparer 100 mL de méthanol : chloroforme dans un rapport de 1:1 (50 mL de méthanol et 50 mL de chloroforme).
5. Préparer 82,5 mL de réagencé Updegraff. Ajouter 75 mL d’acide acétique à 80% d’acide acétique à 7,5 mL d’acide nitrique de sorte que le rapport ultime de l’eau: acide acétique: acide nitrique est en 2:8:1 (v/ v). Pour préparer 80% d’acide acétique, dissoudre 80 mL d’acide acétique glaciaire dans 20 mL d’eau stérile (v/v).
6. Préparer un bouillon frais de 1 mg/mL de solution de glucose. Dissoudre 10 mg de glucose dans 10 mL d’eau (w/v).
7. Pour préparer 100 mL d’acide sulfurique à 67 % (v/v), ajouter 67 mL d’acide sulfurique concentré à 33 mL d’eau. Toujours utiliser une bouteille en verre et ajouter de l’acide lentement à l’eau. Cette étape est exothermique (libère de la chaleur). Par conséquent, préparer cette solution sur la glace et laisser refroidir au réfrigérateur pendant au moins 2 heures avant utilisation.
8. Préparer de l’anthrone frais de 0,2 % (w/v) pour chaque lot d’échantillons expérimentaux. Peser 0,2 g d’anthrone et dissoudre dans 100 mL d’acide sulfurique concentré pré-réfrigéré dans une bouteille en verre enveloppée de papier d’aluminium. Conserver au réfrigérateur de 1 à 2 heures avant utilisation.
   REMARQUE : L’acide sulfurique concentré pré-refroidissement dans le réfrigérateur le jour de l’expérience, et la préparation fraîche de l’anthrone est fortement recommandé pour l’estimation précise de la teneur en glucose.

2. Préparation de biomasse végétale

1. Recueillir des échantillons de biomasse végétale à partir de lignées expérimentales de coton de 2 mois cultivées en serre avec les mêmes conditions de croissance, le même stade de développement, la même position des plantes et le même type de tissu (feuilles/tige/racine).
   REMARQUE : Recueillir un minimum de trois répliques biologiques pour chaque échantillon. Lavez-les soigneusement avec de l’eau pour enlever toute la saleté du tissu racinaire.
2. Tissu racinaire sec à l’air pendant 2 jours sur du papier absorbant à température ambiante pour éliminer la teneur en humidité (Figure 1).
   REMARQUE : Tissu désiré à sec à l’air pour l’estimation de la cellulose afin d’éviter toute contamination fongique.
3. Placez les échantillons de racines dans des contenants individuels. Puis les étiqueter et les sécher dans l’incubateur à 49 °C pendant 10 jours (Table des matériaux).
   REMARQUE : Alternativement, un séchoir à congélation peut être utilisé pour sécher le tissu végétal en moins de temps (1 ou 2 jours) sans causer de changements chimiques au matériau de biomasse végétale.
4. Couper les échantillons séchés en petits morceaux, les congeler dans de l’azote liquide et moudre en poudre fine uniforme à l’aide d’un mortier et d’un pilon, d’un moulin à congélateur ou d’un broyeur à biomasse (figure 1).
   REMARQUE : L’usine de congélation a été utilisée à raison de 10 cps pendant 3 cycles.
5. Recueillir le tissu anoché (figure 2) et procéder à l’extraction de la paroi cellulaire.
   REMARQUE : Le processus peut être interrompu à ce stade en stockant les échantillons dans des contenants hermétiques à température ambiante.

3. Extraction de parois cellulaires brutes à partir de biomasse végétale

REMARQUE : Les parois cellulaires végétales contiennent de la cellulose, de la lignine, des composants autres que la cellulose, de la pectine, des protéines matricielles, des composés phénoliques et de^{l’eau 26}. Puisque la cellulose est présente dans les parois cellulaires, la première étape consiste à séparer le composant de la paroi cellulaire des composants muraux non cellulaires de la biomasse^{végétale 26}.

1. Étiquetez et pesez les tubes blancs individuels de 2 mL avant de commencer le processus d’extraction de la paroi cellulaire.
2. Notez les poids des tubes vides dans un cahier de laboratoire avant d’aller plus loin.
3. Pesez 20 mg de tissu en poudre à partir de l’étape 2.5 et transférez-le dans des tubes pré-pesés de 2 mL et étiquetez-les.
4. Ajouter 1 mL de tampon de solubilisation protéique (PSB) (50 mM tris hydrochlorure (HCl) tampon pH 8,8, 0,5 mM EDTA, et 10% de sulfate de dodédecyl de sodium (SDS) pour solubiliser les protéines. Vortex et centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Après centrifugation, jeter le supernatant et enregistrer la pastille.
   REMARQUE : Le supernatant peut être sauvé si le composant protéique doit être analysé.
5. Répétez l’étape 3.4 deux fois de plus.
6. À la pastille retenue, ajouter 1 mL d’eau distillée et de vortex. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et retirer le supernatant.
7. Répétez l’étape 3.6 deux fois de plus.
8. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % d’éthanol à la pastille, au vortex économisé et chauffer à 70 °C pendant 1 h dans un bain d’eau/bloc thermique pour éliminer les composants solubles et l’amidon des échantillons. Vortex et centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT. Jetez le supernatant et économisez la pastille.
9. Répétez l’étape 3.8 une fois de plus.
10. À la pastille ajouter 1 mL de 100% de méthanol et vortex. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et retirer le supernatant.
11. Ajouter 1 mL de chloroforme/méthanol (chloroforme et méthanol en 1:1 ratio) à la pastille et au vortex. Centrifugeuse à 25.200 x g pendant 5 min à RT et enlever le supernatant. L’ajout de solubilise et de solubilise le solvant de méthanol et de chloroforme et élimine la fraction lipidique de la^{biomasse 27}.
12. À la pastille, ajouter 1 mL d’acétone et de vortex à 100 %. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 25.200 x g pendant 5 min à RT et enlever le supernatant. L’acétone élimine les pigments tels que la chlorophylle et les acides gras libres de la^{biomasse 28,29}.
13. Séchez la pastille à 37 °C pendant la nuit ou procédez plus loin en séchant sous vide.
    REMARQUE : La pastille séchée est la paroi cellulaire brute utilisée pour l’estimation cristalline de la cellulose. Le processus peut être interrompu à ce stade ou aller plus loin en utilisant le séchoir à vide pour sécher les échantillons.

4. Traitement par réaccente Updegraff (acide acétique et nitrique) pour enlever les composants non cellulosiques

REMARQUE : Le protocole implique l’utilisation d’acides et d’autres produits chimiques. Portez de l’équipement de protection individuelle (EPI) tout au long du processus.

1. Mesurer 5 mg de granulés bruts séchés de mur de cellules dans un tube plafonné frais de vis de 2 mL. Notez le poids exact (Figure 3)³⁰.
2. Incluez un contrôle positif à ce stade. Utilisez 2 mg de papier filtre (Tableau des matériaux) comme un contrôle positif qui donne 80% de contenu en cellulose.
3. Ajouter 1,5 mL du réagencé Updegraff à la pesée 5 mg d’extrait de paroi cellulaire et un contrôle positif. Mélanger par vortex.
   REMARQUE : Le contrôle positif doit être traité de la même manière que les échantillons expérimentaux à partir de cette étape. Cette étape doit être effectuée dans le capot de fumée avec l’équipement de protection individuelle approprié (PPE).
   ATTENTION : Cette étape doit être effectuée dans des tubes à bouchon à vis pour éviter les éclaboussures d’échantillon et le popping des tubes. Trois répliques biologiques de chaque échantillon ainsi que trois répliques pour un contrôle positif devraient être incluses.
4. Chauffer la suspension à 100 °C pendant 30 min dans un bain d’eau bouillante et laisser refroidir sur un banc pendant 10 min. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 10 min à RT. Retirer le supernatant par centrifugation et économiser la pastille.
   REMARQUE : Les déchets produits doivent être collectés séparément pour les solvants organiques, l’acide sulfurique et le réaccente Updegraff (acide acétique et acide nitrique). Les déchets avec de l’acide acétique et de l’acide nitrique doivent être conservés à des températures fraîches avec des bouchons ventilés et jamais mélangés avec d’autres solvants organiques et d’autres acides pour prévenir toute explosion.
5. Ajouter 1 mL d’eau à la pastille. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 10 min à RT. Retirer 500 μL du surnatant et ajouter 1 mL d’acétone au tube.
6. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT. Retirer 1 mL de supernatant et ajouter 1 mL d’acétone au tube et à la centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT.
7. Après centrifugation, retirer tout le supernatant et suspendre la pastille dans 1 mL d’acétone. Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min et tourner à 25 200 x g pendant 5 min à RT.
8. Jeter le supernatant et enregistrer la pastille. Séchez la pastille à 37 °C pendant la nuit( figure 3).
   REMARQUE : Le processus peut être interrompu à ce stade ou continuer à utiliser le séchoir à vide pour le séchage et passer à l’étape suivante.

5. Hydrolyse de cellulose par acide pour produire des unités de monomère de glucose

1. Ajouter 1 mL d’acide sulfurique à 67 % à la pastille séchée. Vortex pour mélanger la pastille complètement dans l’acide.
2. Agiter les tubes à température ambiante pendant 1 h pour dissoudre la pastille de cellulose dans 67% d’acide sulfurique.
   REMARQUE : Comme alternative, la solubilisation de la pastille de cellulose dans l’acide sulfurique de 67% peut être améliorée par la sonication de chaque échantillon pendant 10 min après 30 min d’incubation dans le shaker. Après la sonication, les échantillons peuvent être réincubés dans le shaker à RT. Cependant, nous avons observé la solubilité complète de la pastille de cellulose sans sonication quand nous commençons avec 5 mg d’extrait brut de paroi cellulaire (figure 3). Cette procédure a bien fonctionné pour divers échantillons de biomasse végétale³.

6. Mesure de la teneur en glucose par l’analyse anthrone et l’estimation de la teneur en cellulose

1. À ce stade, la cellulose est sous forme de monomères de glucose libres. Déterminer la quantité de cellulose en mesurant la quantité de glucose présente dans l’échantillon par spectrophotométrie.
2. Prenez 10 μL de l’échantillon de l’étape 5 et ajoutez-le à 490 μL d’eau distillée stérile pour faire une dilution de chaque échantillon à 500 μL. Vortex le mélange dilué d’échantillon et d’eau pendant 10 secondes.
3. Ajouter 1 mL de 0,2 % de réagenène fraîchement préparé à chaque tube et mélanger immédiatement par vortex.
4. Faire bouillir les échantillons à 100 °C pendant 10 min et refroidir les tubes sur la glace pendant 5 min. Transférer 200 μL de chaque échantillon dans trois puits d’une plaque de puits de 96 puits. Chargez la plaque de puits 96 dans un spectrophotomètre pour mesurer l’absorption à 620 nm.
   REMARQUE : Pour faire bouillir à haute température, utilisez des tubes à vis pour éviter les éclaboussures de produits chimiques nocifs et pour éviter la perte d’échantillons.

7. Préparation de la courbe standard de glucose

1. Pour préparer la norme de glucose, faire un stock frais de 1 mg/mL de glucose en dissolvant 10 mg de glucose dans 10 mL d’eau distillée stérile. Ajouter cette solution de stock de 1 mg/mL en incréments de 20 μL (0, 20, 40, 60, 80 100 120 140, 160, 180 μL) à l’eau distillée stérile (volume total de 1 mL) pour préparer des normes de glucose allant de 0 μg à 180 concentrations de μg/mL(figure 3). Vortex chaque norme de glucose après l’ajout d’eau stérile.
2. De ces 10 concentrations différentes, aliquot 500 μL de chaque concentration de glucose dans un tube frais de 2 mL à vis plafonné.
3. Ajouter 1 mL d’anthrone fraîchement préparé à chaque tube et mélanger immédiatement par vortex. Incuber sur la glace et faire bouillir à 100 °C pendant 10 min, puis incubation sur glace pendant 5 min²³.
4. Transférer 200 μL de chaque norme à trois puits dans une plaque de micro-litre de 96 puits pour trois répliques techniques et mesurer l’absorption à 620 nm (figure 3).
5. Développer une courbe de glucose standard en traçant différentes concentrations de glucose (0 à 180 μg/mL) par rapport aux valeurs normalisées d’absorption à 620 nm (figure 7). Utilisez la ligne de régression Y= mx+c générée à partir des valeurs d’absorption pour calculer la teneur en cellulose dans les échantillons préparés.
   REMARQUE : Les normes de glucose doivent être fraîchement préparées pour chaque ensemble d’expériences. La concentration du glucose doit être augmentée si les valeurs d’OD sont trop élevées/basses de sorte que ces valeurs entrent dans la gamme des valeurs standard d’absorption de courbe. La ligne de régression génère différentes valeurs m et c basées sur les normes de glucose utilisées pour chaque lot d’échantillons. Mélanger les tubes immédiatement après l’ajout d’anthrone²³. Anthrone, échantillons dilués et normes préparées ont toujours été maintenus au froid jusqu’à ce que l’essai anthrone a été effectué en raison de la nature exothermique de cette réaction.

Résultats

Les plants de coton cultivés dans la maison verte ont été sélectionnés pour cette étude. Deux lignées expérimentales différentes de coton ont été sélectionnées pour l’analyse comparative de la teneur en cellulose. Pour chaque lignée expérimentale, le tissu racinaire a été prélevé à partir de trois répliques biologiques. Un total de 500 mg de tissu a été homogénéisé et 20 mg de celui-ci a été utilisé pour l’extraction de la paroi cellulaire brute. Plus tard, 5 mg d’extrait brut de paroi ...

Discussion

Les fibres de coton sont des fibres naturelles produites à partir des oléagineux. La fibre de coton est une cellule unique avec la teneur en cellulose ~95%^{2 avec} la teneur élevée en cellulose cristalline avec des applications étendues dans l’industrie textile^31. Comme, fibre de coton contient ~ 95% cellulose, nous avons utilisé des tissus de racine de coton pour la démonstration de l’estimation de la teneur en cellulose cristalline. Les tissus racinaires de coton...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol