声学悬浮系统中非球形气泡振荡诱导微流

摘要

提出了一种快速可靠的技术来控制单个捕获声气泡的形状振荡，该技术基于两个气泡之间的聚结技术。稳态、对称控制的气泡形状振荡允许分析气泡界面附近产生的流体流动。

摘要

当位于生物屏障附近时，振荡微泡可能会增加细胞膜通透性，从而实现药物和基因内化。实验观察表明，这些屏障的暂时透化可能是由于空化微流对细胞组织施加的剪切应力。空化微流是在振荡的超声波微泡周围产生的涡流的产生。为了产生这样的液体流动，气泡振荡必须偏离纯粹的球形振荡，并包括平移不稳定性或形状模式。由于难以以稳定可控的方式捕获微气泡的形状变形，因此对附近表面的气泡诱导流动和剪切应力的实验研究范围通常受到限制。我们描述了用于研究对称控制非球形振荡的声学悬浮室的设计。这种控制是通过在足够强烈的超声场中使用两个接近的气泡之间的聚结技术来执行的。对非球形振荡的控制为自由表面振荡微气泡的受控空化微流开辟了道路。高帧率相机允许在声学时间尺度上准同时研究非球形气泡动力学和在较低时间尺度上的液体流动。结果表明，可以获得多种流体模式，并且它们与气泡界面的模态内容相关。我们证明，如果界面动力学包含多种模式，即使是高阶形状模式也可以创建大距离流体模式，突出了非球形振荡在靶向和局部药物递送方面的潜力。

引言

在医学上，给药的药物必须穿透生命系统中的许多障碍才能达到预期目标。然而，大多数药物会迅速从血液中清除。靶向效率低，不易穿过细胞膜，导致药物递送无效。目前，微泡与超声结合使用已被提出为一种将药物和基因无创、精确和靶向递送到病理组织和细胞的创新方法¹。在这种方法中，微气泡可以作为载体发挥作用，其中游离药物要么与气泡悬浮液共同注射，要么加载在其表面上。微泡还可以作为局部载体，重新聚焦超声能量，以便与细胞相互作用。基本上，在超声波照射下，气泡稳定地压缩和膨胀，这种状态称为稳定空化，产生液体流动，从而对附近的物体产生剪切应力。在惯性空化状态下，微气泡也可能非线性振荡并膨胀直到坍塌，产生从坍塌部位^径向传播的冲击波2。已经表明，空化，无论是稳定的还是惯性的，都会增强细胞膜的透化，从而增强药物内化到细胞^中3。

在治疗应用中，了解气泡细胞相互作用的机制非常重要，但是从科学和技术方面来看，存在一些障碍，阻碍了我们的知识进步。首先，捕获细胞响应气泡诱导的机械刺激的动力学是非常困难^的4。在声学时间尺度上，一阶微气泡振荡可以导致膜通道的激活，促进分子通过生物界面。这是通过细胞膜的直接振荡发生的，也称为"细胞按摩"⁵。使用膜片钳技术证明了直接机械应力后的通道激活，该技术测量了超声暴露期间和之后细胞膜的电生理特性⁶。在声学时间尺度上测量气泡诱导的细胞动力学（意味着细胞膜的完整变形场），还将提供诱导孔进入细胞膜^{所需的膜面积}扩展阈值Δ A/ A的见解7。第二个屏障是控制破裂的气泡状态，以避免微气泡诱导的细胞裂解。气泡坍塌和诱导微射流已被确定为发生膜穿孔的机制^8，9。一旦透化，细胞膜通过脂质双层的钙自密封和细胞内囊泡的融合进行^修复9。气泡坍塌的发生也可能对细胞造成致命的损害，并在周围细胞中引起不必要的副作用。在超声波介导的血脑屏障打开等敏感应用中，人们普遍认为应避免惯性气泡坍塌¹⁰。

因此，目前在超声发射序列的设计上投入了巨大的精力，再加上被动空化监测和控制，以确保微气泡的稳定振荡¹¹。在这种稳定的状态下，假设稳定振荡的气泡通过促进细胞膜上的空间靶向剪切应力^在膜透化的触发中起着重要作用7。剪切应力是由振荡气泡附近产生的液体流动引起的。这些液体流动被称为空化微流，如上所述，它们是负责增强细胞外分子摄取的几种可能机制之一。当处理气泡或细胞悬浮液（例如体外生物转染测定¹²）时，通过微流透化可能比通过气泡塌陷进行透化更有效。这可以通过简单的几何考虑来证明。在细胞悬液中，如果大多数悬浮细胞受到足够大的机械效应（导致膜透化），则超声处理将是有效的。众所周知，气泡坍塌是沿着各向同性对称性破坏的方向定向的，例如气泡壁轴¹³ 或气泡-气泡和气泡细胞线连接其质心¹⁴。因此，产生的微射流是一种空间定位现象，沿着连接细胞和气泡中心的有限数量的线。根据细胞和气泡浓度以及气泡-细胞距离，这种效应可能不是渗透整个悬浮细胞数量的最有效效果。相比之下，空化微流是一种在缓慢的时间尺度上发生的现象，与气泡半径相比，空间膨胀很大。此外，液体流动分布在气泡周围，因此可能会在很远的范围内影响更多的细胞。因此，了解振荡气泡周围产生的空化微流是控制和量化施加到细胞的气泡诱导剪切应力的先决条件。

为此，初步步骤包括控制超声波驱动气泡的球形和非球形振荡，因为产生的液体流动是由气泡^{界面15，16}的运动引起的。特别是，必须触发微气泡的形状振荡并保持稳定。此外，必须控制气泡形状振荡的方向，以正确分析气泡界面动力学与诱导微流模式之间的相关性。在总结现有文献时，很明显，空化诱导微流的详细实验结果仅适用于附着在表面上的气泡。壁挂式微气泡通常用于在超快显微镜系统下评估微米级的精确界面动力学和细胞相互作用。当考虑位于细胞膜上的振动微泡时，这种配置具有治疗相关性¹⁷，^18，19。然而，对基板附着气泡的研究可能会使气泡动力学的分析更加复杂，部分原因是接触线动力学²⁰的复杂性，以及不对称形状模式²¹的触发。在医疗和生物应用中，未附着在壁上的气泡通常存在于受限几何形状中，例如小容器。这显著影响气泡动力学和形状不稳定性。特别是，附近壁的存在将形状模式触发的压力阈值转移到较低的压力值，具体取决于形状模式数和气泡大小²²。壁还影响气泡诱导的微流，对于产生的流动²³，其强度可能更高。

在微气泡可能经历的所有可能情况（自由或附着，靠近墙壁，坍塌或稳定振荡）中，我们建议研究远离任何边界的单个气泡的非球形动力学。实验设置基于声学悬浮系统²⁴，其中使用驻留超声波来捕获气泡。这种情况与医疗应用一致，例如，在超声转染室中，一组悬浮气泡和细胞共存。只要气泡和细胞不太接近，假设细胞的存在不会影响气泡界面动力学。当细胞遵循空化诱导的微流的环状轨迹时，它们周期性地接近并从气泡位置排斥，我们可以假设细胞的存在既不影响流动模式，也不会影响其平均速度。此外，从理论角度来看，非球形动力学和来自远离边界的单个气泡的诱导微流是众所周知的。为了将气泡诱导的液体流动与气泡轮廓动力学联系起来，需要准确表征气泡界面动力学。为此，最好在实验研究中调整与治疗中使用的时空尺度，以便通过使用以较低频率激发的大气泡来使用普通高速相机（低于100万帧/秒）进行采集。当考虑未涂层的气泡时，给定模式n的特征频率ω_n与气泡大小相关，为²⁵。当考虑带壳气泡²⁶时，这种半径-特征频率关系略有修改，但特征频率ω_n的数量级保持不变。因此，在30kHz超声场中研究平衡半径~50μm的气泡类似于研究1.7 MHz场中半径~3μm的涂层气泡，正如Dollet等人提出的²⁷。因此，预计会出现相似的形状模式编号和微流模式。

为了触发气泡界面的非球形振荡，必须超过与半径相关的特定压力阈值，如图 1所示。现有的实验技术依赖于声压的增加来触发表面模式（如图1中的路径（ 1）所示），要么通过逐步增加压力²⁸ 或通过负责表面模式²⁹周期性开始和消退的调制幅度激励。这些技术的主要缺点是（i）表面振荡对称轴的随机取向，无法控制在成像平面中，（ii）气泡形状振荡的寿命短，使得在更大的时间尺度上难以分析感应液体流动，以及（iii）频繁触发不稳定的形状模式。我们提出了一种替代技术，可以在半径/压力图中以恒定的声压跨越压力阈值，如图 1中的路径（2）所示。为此，需要增加气泡尺寸，使其处于不稳定区域。这种增加是通过气泡聚结技术进行的。利用两个最初是球形振荡的微气泡的聚结来产生一个变形的气泡。如果聚结气泡的声压和气泡尺寸处于不稳定区，则会触发表面模式。我们还证明，聚结技术在稳态状态下诱导稳定的形状振荡，以及由两个接近的气泡的直线运动定义的受控对称轴。由于在几分钟内确保稳定的形状振荡，因此可以通过在液体介质中注入荧光微粒来分析气泡引起的流体流动，并由薄激光片照射。记录固体微粒在气泡界面附近的运动允许识别诱导流体流动的模式³⁰。触发气泡形状振荡的总体原理，导致时间稳定的流体流动，如图 2所示。

在下面的协议中，我们概述了通过聚结技术创建稳定的气泡形状振荡所需的步骤，并描述了流体流动的测量。这包括声学悬浮系统的设计、声学校准、气泡成核和聚结技术、气泡界面动力学和周围流体流动的测量以及图像处理。

研究方案

1. 声学悬浮室的设计

1. 使用多物理场仿真软件（材料表）的几何模块设计一个光学透明（类似PMMA）的立方体储罐（每个面8厘米边缘和2.8毫米厚度）。
2. 在水箱底部的中心插入一个圆柱形表面（Ø = 35 mm），以模拟超声换能器。
3. 将每壁的边界条件设置为零压力，探头表面的振幅正常位移为1 μm。
4. 使用频域模块，在三个任意位置 loc1 = （0.01375， 0.01375， 0.04125）、loc2 = （0， 0， 0.0088） 和 loc3 = （0.021725， 0.023375， 0.00935） 处，在频率范围 [10 - 40] kHz 中仿真储罐的频率响应函数 （FRF）。
5. 调整油箱尺寸，使腔体的声学模式之一对应于换能器的标称频率（此处为31.2 kHz）。因此，FRF包含一个接近该频率的谐振峰，如图 3所示。
6. 绘制储罐内的压力场图，如图 4所示。选择的共振模式必须在容器内部至少包含一个压力反节点，声学气泡将被困在该反节点上。
7. 设计储罐时，设计一个可移动的顶面，每个边缘都有一个导向槽，以紧紧关闭储罐面。在顶面钻一个小孔，以便用液体介质填充罐。
8. 将水箱放在包含超声换能器的自制框架上（Langevin型，标称频率31.2 kHz）。使用超声凝胶将探头耦合到储罐底壁。
9. 将储罐和框架系统放在带有测微螺钉的三向位移台上。
10. 用微滤、软化和水（未脱气，体积~500mL，氧饱和度约为8mg·^L-1）。
    注意:使用非脱气水代替脱气水可以在实验期间保持稳定的气泡。使用脱气水会加速由于气体扩散而导致的气泡收缩，即使通过整流（超声介导的）扩散略微平衡。

2. 气泡产生和声学校准

1. 准备用于激光诱导气泡成核，声学激发和高速记录的实验装置（图5a，b，c）。实验装置包括（A）声学悬浮系统，（B）激光电源和（C）激光头，（D）一个球面凹透镜，（E）一个平凹透镜和一个非球面透镜，（F）高速相机，（G）连续发光二极管。稍后，为了测量液体流量（图5d）（H）一个连续波激光源，（I）一个圆柱形平凹透镜，然后插入第一个透镜后面并朝向正交轴的圆柱形平凹透镜。
2. 将超声换能器插入函数发生器。将激励信号设置为:正弦波形，连续波，频率31.2 kHz。振幅是唯一的可变参数。
3. 将镜头 （D） 放置在激光头 （C） 前方约 6 cm 处。
4. 将镜头 （E） 放置在镜头 （D） 前方约 12 厘米处。
5. 放置水箱（A），使激光的聚焦点位于水箱内，导致每个激光脉冲（5 -10 mJ）产生火花。激光火花应位于目标压力反节点下方约 3 厘米处。
   注意:如果没有超声波（美国），激光成核气泡将由于浮力而上升到顶面。
6. 打开超声换能器。增加施加的电压，直到气泡不再垂直上升，而是偏离压力反节点，并且在足够的高压下被捕获。
7. 设置背光照明（连续发光二极管）和高速摄像机，以观察被困的气泡。
   注意:当用激光火花对新气泡进行成核时，很容易捕获气泡接近其捕获位置的轨迹。
8. 在水箱内移动激光火花的位置，使气泡轨迹保持在相机的焦平面内。
9. 捕获一个气泡并使用以下参数捕获其径向振荡:帧尺寸 128 x 128 像素，采集速率 180 kHz。 图6提供了两个声学周期内大振幅径向振荡的示例。典型的气泡尺寸范围为 30 至 80 μm。
10. 记录 3 到 30 毫秒内的气泡径向振荡，以捕获数百到数千个气泡振荡。重复此记录以增加传感器的施加电压。典型施加电压在 0 - 8 V 范围内。
    注意:修改施加的电压时，捕获气泡的平衡位置略微垂直移动。要在不移动背光照明和相机的情况下跟踪振荡，请将系统（传感器和水箱）以微米精度放置在三向可移动工作台上。
11. 打开超声换能器并捕获背景图像以进行后期分析。
12. 按照以下过程对视频系列进行后处理:
    1. 运行可执行文件电压压力.exe。 图 7 中所示的界面应打开。
       注意:该脚本可作为补充文档提供。
    2. 在左栏中指定物理和实验参数（图7A）。
    3. 在右下角的表格中指定一系列记录的施加电压值（图7B）。
    4. 在 气泡半径分析 面板中，单击 加载参数 （图 7C），然后选择包含视频系列所有文件的文件夹，然后选择背景图像（必填）。
    5. 允许选择一次分析所有视频，单击自动，或单击逐步分析。
    6. 对于每个视频文件，将绘制一个声学周期内气泡半径的演变，并叠加数值拟合。红色曲线对应于线性化的瑞利-普莱塞特建模。显示平衡气泡半径（图7D）。
    7. 根据数值拟合，该电压的施加压力显示在 压力（电压） 图面板中（图7E）。施加的压力值也显示在右下角的表格中（图7B）。对应于 0 - 8 V 电压动态的典型施加压力为 0 - 25 kPa。
    8. 处理完所有视频后，单击"线性 回归 "按钮以执行压力/电压曲线的线性拟合。数据（电压和压力值）保存到位于当前目录中的.txt文件中。提供了拟合的斜率。

3. 聚结技术

1. 打开超声换能器。根据失稳区的数值压力/半径图，将施加的电压设置得足够高，以使相应的声压可能导致表面不稳定的触发，如图 8所示。
2. 成核气泡，然后迁移到其捕获位置。如果被捕获的气泡仅表现出球形振荡，请继续下一步。如果出现非球面振荡:
   1. 关闭超声波电源，让气泡上升到顶部表面。
   2. 修改激光能量（通过微调几mJ）或降低换能器电压。
   3. 打开超声波电源。
   4. 成核一个新的气泡。
   5. 重复此过程，直到气泡尺寸导致纯球形振荡。
3. 当被捕获的气泡仅表现出球形振荡时，产生新的激光火花。当新气泡到达捕获位置时，会发生聚结。
4. 如果聚结的气泡仅表现出球形振荡，则生成一个新气泡。可能需要多次聚结才能达到发生非球形变形的气泡半径。气泡聚结导致非球形振荡的示例如图 9所示。
5. 一旦聚结气泡表现出非球形振荡，记录气泡振荡的持续时间约为 3 到 30 毫秒。
6. 通过参考 图10确定形状振荡的模式数。

4. 流体流量测量

1. 在空化微流测量的情况下，必须在气泡成核之前将荧光示踪剂颗粒添加到水中。在这项研究中，使用了0.71μm颗粒（材料表）。它们足够小，可以达到声学透明（不受声辐射力的影响）并精确地跟随流动，并且足够大以散射激光。使用三滴水箱的容积，对应于大约 2.10⁴ 个颗粒/mm³。
2. 在进行测量之前，请设置以下参数以捕获（快速时间尺度）气泡动力学和（低时间尺度）流体流动:
   1. 创建摄像机记录盘的分区。
   2. 或者，将记录参数定义为:
      1. 帧速率 180 kHz，帧尺寸 128 x 128 像素，曝光时间 1 μs，一次气泡界面动态记录
      2. 帧速率 600 Hz，帧大小 1024 x 768 像素，曝光时间 1 毫秒，记录一次染料示踪剂的运动。
3. 使用连续激光。
4. 通过连续让激光束通过圆柱形平凹透镜和沿正交轴定向的圆柱形平凸透镜来创建薄激光片。可以获得约160μm的光束宽度。
5. 设置激光片以对应于成像平面:
   1. 将激光放在可移动设备上，以便激光片可以平行于成像平面移动。
   2. 调整位置，使相机可以看到被照亮的粒子。
   3. 成核并捕获气泡。
   4. 进一步调整激光片的位置，使气泡后面可见阴影。气泡现在位于激光片内，如图 11所示。
6. 诱导气泡聚结，直到出现稳定振荡的形状模式。
7. 在气泡动力学和微流之间来回切换进行多次录制。
   注意:不需要时关闭连续激光。加热会产生不需要的对流。此外，在执行流的测量时关闭发光二极管。

5. 图像处理以可视化空化微流模式

1. 安装可视化软件ImageJ，用于Java中的图像处理和分析。还要安装插件CINE文件阅读器，以打开高速相机文件。
2. 点击 "文件"|"进口 |CineFile 并选择包含粒子运动捕获的视频 *.cine。
3. 在新窗口中选择 使用虚拟堆栈 ，视频现已加载。
4. 要在不显示流模式的情况下观察粒子运动，请单击 "图像 |调整 |亮度/对比度 |自动。深色背景现在被自动优化的图像所取代。
5. 要显示结果图案，请单击"图像 |堆栈 |Z 投影，然后选择图像投影的最大强度选项。将显示一个输出图像，其像素包含堆栈中所有图像的最大值。如有必要，请按照步骤 5.4 中所述调整图像对比度。
   注意:获得如图 12b 和 图 12d 所示的流模式。

结果

图9显示了导致时间稳定、对称控制的非球形振荡的完整气泡聚结序列。当两个气泡之间的薄液膜破裂时，两个球形振荡气泡的接近阶段结束。值得注意的是，在聚结前的最后阶段，气泡界面偏离了球形度。两个气泡沿直线运动的路径以椭圆形拉长。在聚结的瞬间之后，单个气泡仍然存在，并在几个声学周期内表现出具有复杂形状的非球形振荡。这对...

讨论

所提出的程序包括使用气泡聚结来触发稳态，对称控制的气泡形状振荡，从而可以研究由这些振荡引起的长期流体流动。该技术的主要挑战是控制气泡被捕获的非球形振荡，远离任何边界。

文献中提出的大多数现有技术都集中在基板附着的气泡⁷，¹⁶上^，因为气泡中心的无运动使得在声学时间尺度（高达数百kHz）下捕获其界面变得更...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspherical lens	Thorlabs	AL4050	Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source	CNI	MLL6FN	DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LJ1277L1-A	lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LK1900L1	lens of focus 250 mm
Fluorescent particles	Duke Scientific	R700	Red polymer fluorescent microspheres
Function generator	Agilent	HP33120	Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera	Vision Research	Phantom v12.0	High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium	Carlo Erba	Water for analysis	Demineralized, undegassed water
Multiphysics software	Comsol	None	Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser	New Wave Research	Solo III-15	5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens	Thorlabs	N-BK7	lens of focus 125 mm
Spherical concave lens	Thorlabs	N-SF11	Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer	SinapTec	Custom-made	Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software	NIH	ImageJ	Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage	Newport	M-406	Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage	Edmund Optics	62-299	Vertical displacement stage with micrometric screw