神经元发育过程中的 ROS 活细胞成像

摘要

该协议描述了在培养斑马鱼神经元和幼虫中使用基因编码的过氧化氢（H₂O_2）生物传感器，以评估H₂O₂ 在神经系统发育过程中的生理信号作用。它可以应用于不同的细胞类型，并修改与实验治疗研究活性氧物种（ROS）在一般发展。

摘要

活性氧物种（ROS）是成熟的信号分子，在正常发育、平衡和生理学中非常重要。在不同的ROS中，过氧化氢（H₂O_2）在细胞信号中的作用最为突出。H₂O₂在若干物种的开发过程中被牵连。例如，在受精后的头几天，斑马鱼胚胎中检测到H₂O₂的瞬时增加。此外，消耗一个重要的细胞H₂O₂源，NADPH氧化酶（NOX），损害神经系统的发展，如分化，轴向生长，和视网膜结节细胞（RGCs）在体内和体外指导。在这里，我们描述了一种在发育过程中使用基因编码的H 2 O_2-特异性生物传感器roGFP2-Orp1在培养斑马鱼神经元和整个幼虫中成像细胞内H ₂O₂水平的方法。这个探针可以在斑马鱼幼虫中短暂或稳定地表达。此外，由于基因表达或体积效应的差异，比例读数降低了检测伪证的可能性。首先，我们演示如何分离和培养从斑马鱼胚胎中衍生的RGC，这些胚胎暂时表达roGFP2-Orp1。然后，我们使用整个幼虫来监测H₂O₂水平在组织水平。传感器已通过添加 H₂O₂进行验证。此外，该方法还可用于通过产生具有组织特异性生物传感器表达的转基因动物来测量特定细胞类型和组织的 H₂O₂水平。由于斑马鱼促进遗传和发育操作，这里展示的方法可以作为测试H₂O₂在脊椎动物神经元和一般胚胎发育过程中的作用的管道。

引言

活性氧物种（ROS）信号调节神经系统的发展和功能^1。一个重要的细胞ROS来源是NADPH氧化酶（NOX），这是产生超氧化物和过氧化氢（H 2 O_2）2的跨膜蛋白。NOX酶存在于整个中枢神经系统（CNS）中，NOX衍生的ROS有助于神经元发育^{3、4、5、6。}神经干细胞的维持和分化，建立神经元极性，中性生长，突触可塑性已被证明需要足够的ROS 7，8，9，10，11水平。另一方面，NOXs不受控制地生产ROS会导致神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏症、多发性硬化症和创伤性脑损伤^{12、13、14。}

研究方案

所有动物实验均经过普渡动物护理和使用委员会 （PACUC） 的合乎道德的审查和批准，遵循 NIH 指南，协议2006002050 2020 年 7 月 24 日获得批准。

1. 准备解决方案

1. E2 介质 （1x）
   1. 通过将 表1 中显示的所有组件组合在一起，准备 100x E2A （500 mL）、500x E2B （100 mL） 和 500x E2C （100 mL） 解决方案。高压灭菌网、E2B 和 E2C 解决方案。存储在4°C。
   2. 对于 1x E2 介质：将 5 mL 的 100x E2A、1 mL 的 500x E2B 和 1 mL 的 500x E2C 组合在一起。将无菌水的体积达到 500 mL。将pH口调整为7.0-7.5。
   3. 在-20°C下准备50 mL的1x E2介质存储的单音节，用于长期存储。但是，解冻后可能会发生降水。使用库存解决方案之前，确保降水完全溶解。

溶液

元件

结果

养殖斑马鱼RGCs在1d内扩展轴突。图4A显示了H 2 O_2-生物传感器的具有代表性的405/480比例图像。细胞体、轴龙和生长锥体在单个神经元中清晰可见。随着时间的推移，这些神经元可以接受不同的治疗，以监测H₂O₂的变化。我们以前发现，在培养介质中添加 100 μM H₂O₂可增加比率值，表明可以通过此系统（图 4 ）24

讨论

有几个关键步骤需要在整个协议中引起注意。我们相信，考虑到这些点将改善实验流。对于初级 RGC 培养，ZFCM（-） 的不育性非常重要，因为这种培养介质不含抗生素，在成像之前或成像期间可能发生污染。为了避免这种情况，我们建议仅在生物安全柜内准备和使用 ZFCM（-），并定期制作新鲜的 ZFCM（-） 介质（步骤 1.5）。此外，层压素库存应保持在-80°C。 解冻的层蛋白应随时储存在 4 °C。不要?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C