3D生物反应器培养大规模制备滑液间充质干细胞来源外泌体

摘要

在这里，我们提出了一种使用3D生物反应器从滑液间充质干细胞产生大量GMP级外泌体的方案。

摘要

间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体已被建议作为软骨损伤和骨关节炎治疗的有希望的候选者。临床应用的外泌体需要大规模生产。为此，在微载体珠上生长人滑液MSC（hSF-MSCs），然后在动态三维（3D）培养系统中培养。通过利用3D动态培养，该方案成功地从SF-MSC培养上清液中获得了大规模的外泌体。通过超速离心收获外泌体，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒透射测定和蛋白质印迹法进行验证。此外，还检测了外泌体的微生物安全性。外泌体检测结果表明，该方法可以产生大量良好生产规范（GMP）级外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究和临床骨关节炎治疗。

引言

由关节软骨和潜在骨分解引起的骨关节炎（OA）仍然是导致残疾的严峻挑战^1，2。没有血液和神经供应，软骨一旦受伤，自愈能力极小^3，4。在过去的几十年中，基于自体软骨细胞植入（ACI）的疗法在OA治疗中取得了一些进展⁵。对于软骨细胞的分离和扩增，必须从OA关节的非承重区域收集小软骨，从而导致软骨损伤。此外，该程序将需要第二次手术来植入扩增的软骨细胞⁶。因此，无软骨损伤的OA治疗的一步疗法正在广泛探索中。

间充质干细胞（MSCs）被认为是OA治疗的有希望的替代品^7，8。MSCs起源于多个组织，可以在特异性刺激下分化成软骨细胞。重要的是，间充质干细胞可以通过抗炎 调节 免疫反应⁹。因此，间充质干细胞通过修复软骨缺陷和调节免疫反应，特别是在炎症环境中，在OA治疗中具有显着优势。对于OA治疗，滑液MSCs（SF-MSCs）因其比其他MSC来源更强的软骨细胞分化能力而最近引起了广泛关注^10，11。值得注意的是，在骨科诊所，从关节腔中提取炎性SF是缓解OA患者疼痛症状的常规疗法。提取的炎性SF通常作为医疗废物处理。患者和医生都准备考虑从炎症性SF中分离的自体MSCs作为OA治疗，几乎没有伦理冲突。然而，SF-MSC治疗由于致瘤风险，长期储存和远距离运输障碍而受到损害。

由许多细胞类型（包括MSC）分泌的外泌体携带大部分亲本细胞生物信息。它已被深入研究为无细胞疗法^12，13。根据临床试验政府（ClinicalTrials.gov）网站上提供的最新资源，在癌症，高血压和神经退行性疾病的研究领域启动并进行了更广泛的外泌体临床研究。SF-MSC外泌体治疗可能是一项令人兴奋和具有挑战性的应对OA的试验。良好生产规范（GMP）级和大规模外泌体生产对于临床转化至关重要。基于二维（2D）细胞培养的小规模外泌体分离已被广泛使用。然而，大规模外泌体生产策略需要优化。本研究开发了一种基于无异种条件下大量SF-MSC培养的大规模外泌体制造方法。从细胞培养上清液超速离心后，验证了外泌体的安全性和功能。

研究方案

本研究获得深圳市第二人民医院人类伦理委员会批准。从hSF-MSCs体外方案分离的外泌体示意图如图1所示。

1. 人类SF-MSCs培养与鉴定

1. 使用注射器和针头从临床OA患者中收获20 mL SF。
   1. 对OA患者的膝关节进行消毒。用7#针从髌骨外股四头肌股四头肌肌腱穿刺入关节腔。
   2. 提取 10 mL 关节液。用输血棒覆盖穿刺部位并按压5分钟。
2. 在4°C下以1，500× g 离心10分钟后弃去SF上清液。
3. 用10mL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬细胞沉淀，在4°C下以1，500× g 离心10分钟，并弃去PBS。
4. 用10 mL人MSC培养基以5 x 10^4个细胞 / mL的细胞密度重悬沉淀（参见 材料表），然后将悬浮液接种在100 mm培养皿中。
5. 将培养皿在37°C下在含有5%CO₂的气氛中孵育。
6. 48小时后，通过更换培养基去除非贴壁细胞并用1x PBS洗涤。每 3 天更换一次培养基，持续 2 周。
7. 收集细胞培养上清液。
8. 使用流式细胞术鉴定SF-MSC。
   1. 消化第三代（P3）SF-MSC，在4°C下以1，000× g 离心5分钟。 弃去上清液并收集细胞沉淀。
      注意:传代被识别为细胞到另一个培养皿的传代培养物。从SF分离并接种在培养皿上的原代细胞被标记为零传代（P0）。在大约75%的汇合处，细胞被消化并从培养皿中分离，接种在其他培养皿上，并标记为P1。
   2. 向细胞沉淀（5 x 10⁴）中加入 400 μL 封闭缓冲液（1x PBS 中的 1% BSA），并在室温 （RT） 下静置 15 分钟。
   3. 在4°C下以1，000× g 离心5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于100μL的1x PBS中。
   4. 每管加入 1 μL CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLA-DR 单克隆荧光抗体（稀释比例 1:100）（参见 材料表），并在室温下孵育 30 分钟。
   5. 用1x PBS洗涤两次并弃去上清液。收集细胞沉淀并重悬于 100 μL 的 1x PBS 中。
   6. 使用525/50和585/40滤光片在流式细胞仪上检测多达10，000个细胞，以检测荧光团。

2.3D生物反应器细胞培养

1. 微载体制备
   1. 将干燥的 0.75 g 微载体（参见 材料表）膨胀并在 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）（50 mL/g 微载体）中水合，在室温下至少 3 小时。
   2. 倒出上清液并在新鲜DPBS（50mL / g微载体）中洗涤微载体5分钟。丢弃 PBS，用新鲜的 1x DPBS（50 mL/g 微载体）替换它。
   3. 通过高压灭菌（121°C，15分钟，15psi）对微载体进行灭菌。让灭菌的微载体沉降，倒出上清液。
   4. 在室温下在培养基（50mL / g微载体）中短暂冲洗微载体。 让微载体沉降，弃去上清液。
2. 灌注生物反应器
   1. 通过高压灭菌（121°C，15分钟，15psi）对生物反应器进行灭菌。
   2. 计算 SF-MSC 的数量，并将 2.5 x 10⁷ SF-MSC 和微载体分配给灌注有 GMP 级 MSC 培养基 （250 mL） 的生物反应器。
   3. 将生物反应器置于37°C下具有5%CO₂ 的培养箱中。 以 15 rpm 的速度旋转生物反应器。每6天更换一次培养基。
   4. 收集细胞培养上清液和微载体，以便在培养14天后进一步分析。

3. 外泌体鉴定与安全检测

1. 超速离心
   1. 将细胞培养上清液在4°C下以300× g 离心10分钟并收集上清液;丢弃细胞碎片。
   2. 将上清液在4°C下以2，000× g 离心10分钟并收集上清液;丢弃较大的囊泡（凋亡小体和一些较大的微囊泡）。
   3. 在4°C下再次以10，000× g 离心上清液30分钟以除去较大的囊泡;收集沉淀并重悬于 40 mL 的 1x PBS 中。
   4. 在4°C下以120，000× g 离心重悬沉淀70分钟，弃去上清液，并将含有外泌体的沉淀重悬于500μL的1x PBS中。
2. 纳米颗粒跟踪分析
   注意:每次运行，以30μL/min的流速将500μL样品注入腔室。在24.4°C-24.5°C下进行分析。
   1. 用无菌 1x PBS 将新鲜分离的外泌体样品稀释至 1 mL，其中包含 10^{7-10 9} /mL 颗粒，并将它们注入纳米颗粒跟踪分析系统（参见 材料表）。
   2. 根据制造商的协议手动设置捕获和分析系统。通过激光散射可视化粒子，并在数字视频上捕获它们的布朗运动。
   3. 使用软件（参见 材料表）分析录制的录像带，基于每次运行至少跟踪 200 个单个粒子。
3. 透射电子显微镜
   1. 将外泌体固定在4%多聚甲醛（在冷1x DPBS中）中5分钟。
   2. 将 5 μL 外泌体安装在铜网格上。在该实验中，外泌体的浓度为1mg / mL，通过蛋白质测定试剂盒定量（参见 材料表）。
   3. 将外泌体嵌入3%磷钨酸中在冰上10分钟。除去多余的酸并在室温下干燥样品。
   4. 在100 kV的加速电压下通过TEM对外泌体样品进行成像。
4. 蛋白质印迹
   1. 向外泌体中加入 300 μL 裂解缓冲液（1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1 M Tris HCl、pH 7）和蛋白酶抑制剂混合物（参见 材料表）。
   2. 通过上下移液混合裂解缓冲液中的外泌体，使其在冰上静置20分钟。
   3. 将混合物在4°C下以9，391× g 离心10分钟并收集上清液。使用蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度（参见 材料表）。
   4. 加入 100 μL 4x 蛋白质上样缓冲液，并在 100 °C 下加热 10 分钟。
   5. 以10 mg/mL的浓度上样15μL蛋白质，并通过凝胶电泳（120 V，70分钟）和100 V电印迹，4°C电印迹60分钟运行。
   6. 通过荧光蛋白质印迹检测非外泌体特异性标志物（calnexin）和外泌体生物标志物（CD9、CD63 和 CD81）（参见 材料表）。
5. 安全测试
   1. 对于细菌、真菌和 结核分枝杆菌 的检测，请遵循步骤3.5.2-3.5.5。
   2. 在血琼脂培养板上接种100μL外泌体溶液（1mg / mL）（参见 材料表），并将培养板在37°C孵育24小时。
   3. 在萨布罗琼脂培养基平板上接种100μL外泌体溶液（1mg / mL）（参见 材料表），并在35°C下孵育48小时。
   4. 在Lowenstein-Jensen培养基板上接种100μL外泌体溶液（1mg / mL）（参见 材料表），并在37°C下孵育3周。
   5. 通过宏观观察检测细菌、真菌和 结核分枝杆菌 菌落的外观。
      注意:评估外泌体安全性的标准是培养板上没有微生物。
   6. 对于支原体检测，请遵循步骤 3.5.7-3.5.9。
   7. 将外泌体重悬于试剂盒中包含的50μL缓冲溶液中，并在95°C下加热3分钟。
   8. 使用PCR支原体检测试剂盒扩增外泌体溶液中的支原体（参见 材料表）。
   9. 在1.5%琼脂糖凝胶电泳（30分钟，120V）上检测PCR产物。

4. 体外外 泌体功能检测

1. 外泌体标记
   1. 用 1 mM Dil （1000x）（参见 材料表）标记 100 μL 外泌体 （1 mg/mL），并在室温下孵育 30 分钟。
   2. 通过以100，000× g 超速离心70分钟来回收外泌体。将沉淀重悬于 500 μL 1x PBS 中。
2. Cy3-miR-140 模拟物加载到外泌体中
   1. 将 1 μg/μL 外泌体蛋白和 5 μmol/mL Cy3-miR-140 混合在 400 μL 电穿孔缓冲液（1.15 mM 磷酸钾 （pH 7.2）、25 mM 氯化钾和 21% （v/v） 的最终体积中（参见 材料表）。
   2. 将混合物转移到冷的0.4cm电穿孔比色皿中，并使用基因转染系统以300 V / 100μF电容电穿孔（参见 材料表）。
   3. 电穿孔后立即将混合物保持在室温下30分钟，以确保外泌体膜完全恢复。
   4. 用一个单位的RNase A（参见 材料表）处理混合物20分钟，以消除外泌体外的miRNA模拟物。
   5. 将外泌体混合物以120，000× g 超速离心90分钟，弃去上清液并将外泌体重悬于500μL的1x PBS中。
3. 外泌体摄取测定
   1. 将软骨细胞 （1 x 10⁷） 接种在 35 mm 共聚焦培养皿中，加入 1 mL 含有 10% FBS 的 DMEM/F12。
   2. 24小时后，用DiI标记的外泌体（100ng / mL）或cy3-miR-140负载的外泌体（100ng / mL）处理软骨细胞1小时。
   3. 用 1x PBS 洗涤三次，然后在室温下用 DAPI （10 ng/mL） 标记 10 分钟。
   4. 使用适当的滤光片在共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）中记录荧光信号（参见 材料表）。

5. 统计分析

1. 使用适当的统计软件执行统计分析。
   注:每个图中的代表性数据表示为SD±平均值。学生t检验用于使用统计软件比较两组。在多个组之间比较的情况下，执行单因素方差分析，然后是Tukey的倍数。P 值 <0.05 （*）、<0.01 （**） 或 <0.001 （_***）。

结果

流式细胞术用于鉴定SF-MSC的表面标志物，根据国际细胞治疗学会推荐的定义人类MSC的最低标准^14，15。流式细胞术分析表明，本研究培养的SF-MSCs符合MSCs的鉴定标准。CD34、CD45和HLA-DR呈阴性（低于3%），CD73、CD90和CD105呈阳性（95%以上）（图2）。

在倒置显微镜下，注意到SF-MSCs在微载体上增殖（图3A...

讨论

间充质干细胞因其自我更新、分化为具有特殊功能的组织细胞和旁分泌效应而广泛应用于再生医学^16，17。值得注意的是，外泌体施加的旁分泌效应引起了人们的广泛关注¹⁸。外泌体携带MSCs的生物信息，发挥其生物学功能，克服MSC储存和运输麻烦等缺点。因此，来源于间充质干细胞的外泌体已被用于治疗干预，这在OA治疗中引起了最多?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge