3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

요약

여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

중간엽 줄기세포(MSC)에서 분비되는 엑소좀은 연골 손상 및 골관절염 치료의 유망한 후보로 제안되었습니다. 임상 적용을 위한 엑소좀은 대규모 생산이 필요합니다. 이를 위해 인간 활액 MSC(hSF-MSC)를 마이크로캐리어 비드에서 성장시킨 다음 동적 3차원(3D) 배양 시스템에서 배양했습니다. 이 프로토콜은 3D 동적 배양을 활용하여 SF-MSC 배양 상청액에서 대규모 엑소좀을 성공적으로 획득했습니다. 엑소좀을 초원심분리로 수확하고 투과전자현미경, 나노입자 투과분석법 및 웨스턴 블로팅으로 검증하였다. 또한 엑소 좀의 미생물 학적 안전성이 검출되었습니다. 엑소좀 검출 결과는 이 접근법이 우수제조관리기준(GMP) 등급 엑소좀을 많이 생산할 수 있음을 시사합니다. 이러한 엑소좀은 엑소좀 생물학 연구 및 임상 골관절염 치료에 활용될 수 있습니다.

서문

관절 연골과 기저 뼈 파괴로 인한 골관절염(OA)은 장애 ^1,2로 이어지는 심각한 문제로 남아 있습니다. 혈액과 신경 공급이 없으면 연골자가 치유 능력은 일단 손상되면 최소화됩니다 ^3,4. 지난 수십 년 동안 자가 연골세포 이식(ACI)에 기초한 치료법은^{OA 치료에서} 약간의 진전을 이루었습니다5. 연골 세포 분리 및 확장을 위해서는 OA 관절의 비 중량 부위에서 작은 연골을 채취하여 연골에 손상을 입힐 필요가 있습니다. 또한, 절차는 확장 된 연골 세포⁽⁶)를 이식하기위한 두 번째 수술을 요구할 것이다. 따라서 연골 손상없이 OA 치료를위한 1 단계 요법이 광범위하게 연구되고 있습니다.

중간엽 줄기세포(MSC)는 OA 치료 ^7,8을 위한 유망한 대안으로 제안되었습니다. 여러 조직에서 유래 한 MSC는 특정 자극으로 연골 세포로 분화 할 수 있습니다. 중요하게도, MSC는 항염증⁹을 통해 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서 MSC는 연골 결함을 복구하고 특히 염증 환경에서 면역 반응을 조절함으로써 OA 치료에서 상당한 이점을 가지고 있습니다. OA 치료의 경우, 활액(SF-MSC)의 MSC는 다른 MSC 공급원보다 더 강한 연골세포 분화 능력으로 인해 최근 많은 관심을 받고 있습니다^10,11. 특히, 정형 외과 클리닉에서 관절강에서 염증성 SF를 추출하는 것은 OA 환자의 통증 증상을 완화하기위한 일상적인 치료법입니다. 추출 된 염증성 SF는 일반적으로 의료 폐기물로 처리됩니다. 환자와 의사 모두 염증성 SF에서 분리 된자가 MSC를 윤리적 갈등이 거의없는 OA 치료제로 고려할 준비가되어 있습니다. 그러나 SF-MSC 요법은 종양 발생 위험, 장기간 보관 및 먼 선적 장벽으로 인해 손상됩니다.

MSC를 포함한 많은 세포 유형에서 분비되는 엑소좀은 대부분의 모 세포 생체 정보를 전달합니다. 무세포 요법^12,13으로 심층적으로 조사되었습니다. 임상 시험 정부 (ClinicalTrials.gov) 웹 사이트에서 제공되는 업데이트 된 리소스에 따르면 암, 고혈압 및 신경 퇴행성 질환의 연구 분야에서보다 광범위한 엑소 좀 임상 연구가 시작되고 수행됩니다. SF-MSC 엑소좀 치료는 OA에 대처하기 위한 흥미롭고 도전적인 시험이 될 수 있습니다. 우수제조관리기준(GMP) 등급 및 대규모 엑소좀 생산은 임상 번역에 필수적입니다. 소규모 엑소좀 분리는 2차원(2D) 세포 배양을 기반으로 널리 수행되었습니다. 그러나 대규모 엑소좀 생산 전략은 최적화가 필요합니다. 본 연구에서는 이물질이 없는 조건에서 대규모 SF-MSC 배양을 기반으로 대규모 엑소좀 제조 방법이 개발되었습니다. 세포 배양 상청액에서 초원심분리 후, 엑소좀의 안전성과 기능을 검증하였다.

프로토콜

이 연구는 심천 제 2 인민 병원의 인간 윤리위원회의 승인을 받았습니다. hSF-MSCs in vitro 프로토콜에서 분리된 엑소좀의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.

1. 인간 SF-MSC 배양 및 식별

1. 임상 OA 환자로부터 주사기와 바늘을 사용하여 SF 20mL를 수확합니다.
   1. OA 환자의 무릎 관절을 소독하십시오. 슬개골 외부의 대퇴사 두근 힘줄에서 7 # 바늘로 관절강으로 구멍을 뚫습니다.
   2. 관절액 10mL를 추출합니다. 수혈 스틱으로 천자 부위를 덮고 5 분 동안 누릅니다.
2. 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 에서 원심분리 후 SF 상청액을 폐기한다.
3. 세포 펠릿을 10mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 재현탁하고, 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 로 원심분리하고, PBS를 버립니다.
4. 펠릿을 5 x 10⁴ cells/mL의 세포 밀도로 인간 MSC 배양 배지 10mL로 재현탁한 다음( 재료 표 참조) 현탁액을 100mm 접시에 플레이트화합니다.
5. 접시를 5%_CO2를 함유하는 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다.
6. 48시간 후, 배지를 변경하여 부착되지 않은 세포를 제거하고 1x PBS로 세척한다. 2 주 동안 3 일마다 배지를 교체하십시오.
7. 세포 배양 상청액을 수집한다.
8. 유세포분석을 사용하여 SF-MSC를 식별합니다.
   1. SF-MSC의 3세대(P3)를 분해하고 1,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 수집하십시오.
      참고: 계대는 다른 배양 접시에 대한 세포의 계대 배양으로 인식됩니다. SF로부터 분리되고 접시에 파종 된 1 차 세포는 통로 0 (P0)으로 표지된다. 약 75 %의 합류에서 세포는 소화되어 접시에서 분리되고 다른 접시에 뿌려지고 P1으로 표시됩니다.
   2. 400μL의 블로킹 완충액(1x PBS 중 1% BSA)을 셀 펠릿(5 x 10⁴)에 추가하고 실온(RT)에서 15분 동안 방치합니다.
   3. 4°C에서 5분 동안 1,000 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠렛을 100μL의 1x PBS에 재현탁시킨다.
   4. 튜브당 1μL의 CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR 단일클론 형광 항체(희석비 1:100)( 재료 표 참조)를 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 1x PBS로 두 번 세척하고 상청액을 버립니다. 세포 펠렛을 수집하고 100 μL의 1x PBS에 재현탁시킨다.
   6. 형광단을 검출하기 위해 525/50 및 585/40의 필터를 사용하여 최대 10,000개의 세포를 유세포분석기에서 검출합니다.

2.3D 생물 반응기 세포 배양

1. 마이크로캐리어 준비
   1. 건조 된 0.75g의 마이크로 캐리어 ( 재료 표 참조)를 팽창시키고 RT에서 최소 3 시간 동안 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) (마이크로 캐리어 50mL / g)에서 수화합니다.
   2. 상청액을 따라 내고 새로운 DPBS (50mL / g의 마이크로 캐리어)에서 5 분 동안 마이크로 캐리어를 세척합니다. PBS를 폐기하고 새로운 1x DPBS(50mL/g의 마이크로캐리어)로 교체합니다.
   3. 오토클레이빙(121°C, 15분, 15psi)으로 마이크로캐리어를 멸균합니다. 멸균 된 마이크로 캐리어가 침전되도록하고, 상청액을 따라 내십시오.
   4. RT에서 배양 배지(마이크로캐리어 50mL/g)의 마이크로캐리어를 간단히 헹구고 마이크로캐리어가 침전되도록 하고 상청액을 버립니다.
2. 관류 생물 반응기
   1. 오토클레이빙(121°C, 15분, 15psi)으로 바이오리액터를 멸균합니다.
   2. SF-MSC의 수를 세고 2.5 x 10⁷ 개의 SF-MSC 및 마이크로캐리어를 GMP 등급 MSC 배양 배지(250mL)로 관류된 바이오리액터에 할당합니다.
   3. 바이오리액터를 37°C에서 5%_CO2 로 배양기에 넣었다. 생물 반응기를 15 rpm의 속도로 회전시킨다. 6일마다 배양액을 교체한다.
   4. 14일 동안 배양한 후 추가 분석을 위해 세포 배양 상청액 및 마이크로캐리어를 수집한다.

3. 엑소좀 식별 및 안전 감지

1. 초원심분리
   1. 세포 배양 상청액을 4°C에서 10분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 상청액을 수집하는 단계; 세포 파편을 폐기하십시오.
   2. 상청액을 4°C에서 10분 동안 2,000 x g 에서 원심분리하고 상청액을 수집하고; 더 큰 소포 (세포 사멸체 및 일부 더 큰 미세 소포)를 버립니다.
   3. 상청액을 다시 10,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 더 큰 소포를 제거하고; 펠릿을 수집하고 40mL의 1x PBS에 재현탁합니다.
   4. 재현탁된 펠렛을 4°C에서 70분 동안 120,000 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버리고, 엑소좀이 포함된 펠렛을 500μL의 1x PBS에 재현탁시킨다.
2. 나노 입자 추적 분석 (NTA)
   참고: 각 실행에 대해 500μL의 샘플을 30μL/min의 유속으로 챔버에 주입했습니다. 24.4°C-24.5°C에서 분석을 수행한다.
   1. 새로 분리된 엑소좀 샘플을 멸균 1x PBS로 희석하여 10개의 7-10⁹/mL의 입자를 포함하는 1mL로 희석하고 나노입자 추적 분석 시스템에 주입합니다(재료 표 참조).
   2. 제조업체의 프로토콜에 따라 캡처 및 분석 시스템을 수동으로 설정합니다. 레이저 광 산란으로 입자를 시각화하고 디지털 비디오에서 브라운 운동을 캡처합니다.
   3. 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 녹화된 비디오 테이프를 분석하려면 실행당 최소 200개의 개별 파티클을 추적합니다.
3. 투과 전자 현미경
   1. 엑소좀을 4% 파라포름알데히드(차가운 1x DPBS에서)에 5분 동안 고정합니다.
   2. 5 μL의 엑소좀을 구리 그리드에 장착합니다. 이 실험에서 엑소좀의 농도는 단백질 분석 키트로 정량한 1mg/mL입니다( 재료 표 참조).
   3. 엑소좀을 3% 포스포텅스텐산에 얼음 위에서 10분 동안 묻힙니다. 과량의 산을 제거하고 RT에서 샘플을 건조시킨다.
   4. 100kV의 가속 전압에서 TEM으로 엑소좀 샘플을 이미지화합니다.
4. 웨스턴 블로팅
   1. 엑소좀에 용해 완충액 300μL(1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 0.1M 트리스 HCl, pH 7)와 프로테아제 억제제 칵테일( 재료 표 참조)을 추가합니다.
   2. 엑소좀을 위아래로 피펫팅하여 용해 완충액에 혼합하고 얼음 위에 20분 동안 그대로 둡니다.
   3. 혼합물을 4°C에서 10분 동안 9,391 x g 에서 원심분리하고 상청액을 수집한다. 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
   4. 100μL의 4x 단백질 로딩 버퍼를 추가하고 100°C에서 10분 동안 가열합니다.
   5. 10mg/mL 농도로 단백질 15μL를 로드하고 겔 전기영동(120V, 70분) 및 100V에서 전기블로팅, 4°C에서 60분으로 실행합니다.
   6. 비-엑소좀-특이적 마커 (칼넥신) 및 엑소솜 바이오마커 (CD9, CD63, 및 CD81)를 형광 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한다( 물질 표 참조).
5. 안전성 테스트
   1. 박테리아, 곰팡이 및 결핵균 검출의 경우 3.5.2-3.5.5단계를 따르십시오.
   2. 100μL의 엑소좀 용액(1mg/mL)을 혈액 한천 배양 접시( 재료 표 참조)에 파종하고 배양 접시를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   3. 100μL의 엑소좀 용액(1mg/mL)을 sabouraud 한천 배지 플레이트( 재료 표 참조)에 파종하고 35°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   4. 100 μL의 엑소좀 용액(1 mg/mL)을 Lowenstein-Jensen 배양 배지 플레이트( 재료 표 참조)에 시드하고 37°C에서 3주 동안 배양합니다.
   5. 거시적 관찰을 통해 박테리아, 곰팡이 및 결핵균 식민지의 모양을 감지합니다.
      참고: 엑소좀의 안전성을 평가하는 기준은 배양 접시에 미생물이 없다는 것입니다.
   6. 마이코플라즈마 검출의 경우 3.5.7-3.5.9단계를 따르십시오.
   7. 키트에 포함된 완충용액 50μL에 엑소좀을 재현탁하고 95°C에서 3분간 가열합니다.
   8. PCR 마이코플라즈마 검출 키트를 사용하여 엑소좀 용액에서 마이코플라즈마를 증폭합니다( 재료 표 참조).
   9. PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동(30분, 120V)에서 검출한다.

4. 체외 엑소좀 기능 검출

1. 엑소좀 라벨링
   1. 100μL의 엑소좀(1mg/mL)에 1mM 딜(1000x)( 재료 표 참조)을 라벨링하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 100,000 x g 에서 70분 동안 초원심분리하여 엑소좀을 회수합니다. 펠릿을 500μL의 1x PBS에 재현탁합니다.
2. Cy3-miR-140 모방체를 엑소좀에 로딩
   1. 1 μg/μL의 엑소솜 단백질과 5 μmol/mL의 Cy3-miR-140을 400 μL의 전기천공 완충액(1.15 mM 인산칼륨(pH 7.2), 25 mM 염화칼륨 및 21%(v/v)의 최종 부피에 혼합합니다( 재료 표 참조).
   2. 혼합물을 차가운 0.4cm 전기천공 큐벳으로 옮기고 유전자 형질주입 시스템을 사용하여 300V/100μF 정전용량에서 전기천공합니다( 재료 표 참조).
   3. 전기 천공 직후, 혼합물을 RT에서 30 분 동안 유지하여 엑소 좀 막이 완전히 회복되도록합니다.
   4. 혼합물을 1 유닛의 RNase A ( 물질 표 참조)로 20분 동안 처리하여 엑소좀 외부의 miRNA 모조물을 제거한다.
   5. 엑소좀 혼합물을 120,000 x g 에서 90분 동안 초원심분리하고, 상청액을 버리고, 엑소좀을 500μL의 1x PBS에 재현탁시킨다.
3. 엑소좀 흡수 분석
   1. 연골세포(1 x 10⁷)를 10% FBS를 함유한 DMEM/F12 1mL와 함께 35mm 컨포칼 접시에 씨를 뿌립니다.
   2. 24시간 후, 연골세포를 DiI 표지된 엑소좀(100ng/mL) 또는 cy3-miR-140 로딩된 엑소좀(100ng/mL)으로 1시간 동안 처리합니다.
   3. 1x PBS로 세 번 세척 한 다음 RT에서 10 분 동안 DAPI (10 ng / mL)로 라벨링합니다.
   4. 적절한 필터를 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경(CLSM)으로 형광 신호를 기록합니다( 재료 표 참조).

5. 통계 분석

1. 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
   참고: 각 그림의 대표 데이터는 SD± 평균으로 표현되었습니다. 스튜던트 t-검정은 통계 소프트웨어를 사용하여 두 그룹을 비교하는 데 사용되었습니다. 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 배수가 여러 그룹 간의 비교의 경우 수행되었습니다. P 값은 <0.05(_*), <0.01(_**) 또는 <0.001(_***)입니다.

결과

유세포 분석은 국제 세포 치료 학회^14,15에서 권장하는 인간 MSC를 정의하기위한 최소 기준에 따라 SF-MSC의 표면 마커를 확인하는 데 사용되었습니다. 유세포 분석 결과, 본 연구에서 배양된 SF-MSC는 MSC의 식별 기준을 충족했다. CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해서는 음성이었고(3% 미만), CD73, CD90 및 CD105(95% 이상)에서는 양성이었습니다(그림 2).<...

토론

중간엽 줄기세포는 자가 재생, 특수 기능을 가진 조직세포로 분화, 파라크린 효과로 인해 재생 의학에서 널리 사용되고 있습니다^16,17. 특히, 엑소좀이 발휘하는 파라크린 효과는 많은 관심을 끌었습니다¹⁸. 엑소좀은 MSC의 생체 정보를 전달하고 생물학적 기능을 수행하며 번거로운 보관 및 출하 등 MSC 단점을 극복합니다. 따라서 중간엽?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge