Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Özet

Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) tarafından salgılanan eksozomlar, kıkırdak yaralanmaları ve osteoartrit tedavisi için umut verici adaylar olarak önerilmiştir. Klinik uygulama için eksozomlar büyük ölçekli üretim gerektirir. Bu amaçla, insan sinovyal sıvı MSC'leri (hSF-MSC'ler) mikro taşıyıcı boncuklar üzerinde yetiştirildi ve daha sonra dinamik üç boyutlu (3D) bir kültür sisteminde kültürlendi. 3D dinamik kültürü kullanarak, bu protokol SF-MSC kültür süpernatantlarından büyük ölçekli eksozomları başarıyla elde etti. Eksozomlar ultrasantrifüjleme ile toplandı ve bir iletim elektron mikroskobu, nanopartikül iletim testi ve batı lekelenmesi ile doğrulandı. Ayrıca, eksozomların mikrobiyolojik güvenliği tespit edildi. Eksozom tespitinin sonuçları, bu yaklaşımın çok sayıda iyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı eksozom üretebileceğini düşündürmektedir. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik osteoartrit tedavisinde kullanılabilir.

Giriş

Eklem kıkırdağı ve altta yatan kemik parçalanmasından kaynaklanan osteoartrit (OA), sakatlığa yol açan ciddi bir zorluk olmaya devam etmektedir ^1,2. Kan ve sinir kaynağı olmadan, kıkırdak kendi kendini iyileştirme yeteneği bir kez yaralandığında minimumdur ^3,4. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonuna (ACI) dayalı tedaviler OA tedavisinde bazı ilerlemeler kaydetmiştir⁵. Kondrosit izolasyonu ve genişlemesi için, OA ekleminin ağırlık taşımayan alanından küçük kıkırdak toplanması gereklidir ve bu da kıkırdakta yaralanmalara n....

Protokol

Bu çalışma Shenzhen İkinci Halk Hastanesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. hSF-MSC'lerden izole edilen eksozomların şematik diyagramı in vitro protokolde Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. İnsan SF-MSC'lerinin kültürü ve tanımlanması

1. Klinik OA hastalarından bir şırınga ve iğne kullanarak 20 mL SF hasat edin.
   1. OA hastasının diz eklemini dezenfekte edin. Kuadriseps femoris tendonundan patellanın dışından 7 # iğne ile eklem boşluğuna delinme.
   2. Eklem sıvısının 10 mL'sini çıkarın. Delinme bölgesini transfüzyon çubuğu ile örtün ve 5 dakika boyunca bastırın.<....

Sonuçlar

SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akım sitometrisi, Uluslararası Hücresel Terapi Derneği^14,15 tarafından önerilen insan MSC'lerini tanımlamak için minimum kriterlere göre kullanılmıştır. Akım sitometri analizi, bu çalışmada kültüre alınan SF-MSC'lerin MSC'lerin tanımlama kriterlerini karşıladığını ortaya koymuştur. CD34, CD45 ve HLA-DR (%3'ün altında) için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 (%95'in üzerinde) için p.......

Tartışmalar

Mezenkimal kök hücreler, kendini yenilemeleri, özel fonksiyonlara sahip doku hücrelerine farklılaşmaları ve parakrin etkileri nedeniyle rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır^16,17. Özellikle, eksozomlar tarafından uygulanan parakrin etkiler çok dikkat çekmiştir¹⁸. Eksozomlar, MSC'lerin biyo-bilgilerini taşır ve biyolojik işlevlerini yerine getirir ve zahmetli depolama ve sevkiyat gibi MSC eksikliklerinin üstes.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge