3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製

要約

ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。

要約

間葉系幹細胞(MSC)によって分泌されるエクソソームは、軟骨損傷および変形性関節症治療の有望な候補として示唆されている。臨床応用のためのエキソソームは、大規模な生産を必要とします。この目的のために、ヒト滑液MSC(hSF-MSC)をマイクロキャリアビーズ上で成長させ、動的3次元(3D)培養システムで培養しました。3D動的培養を利用することにより、SF-MSC培養上清から大規模なエクソソームを得ることに成功した。エキソソームを超遠心により回収し、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子透過アッセイ、およびウェスタンブロッティングによって検証しました。また、エクソソームの微生物学的安全性も検出されました。エキソソーム検出の結果は、このアプローチが多数の適正製造基準(GMP)グレードのエキソソームを生成できることを示唆しています。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床変形性関節症治療に利用することができる。

概要

関節軟骨とその根底にある骨の破壊に起因する変形性関節症(OA)は、障害につながる深刻な課題であり続けています^1,2。血液と神経の供給がなければ、軟骨の自己治癒能力は一度損傷すると最小限になります^3,4。過去数十年で、自家軟骨細胞移植(ACI)に基づく治療法は、OA治療においてある程度の進歩を遂げました⁵。軟骨細胞の単離と拡張のためには、OA関節の非体重支持領域から小さな軟骨を採取する必要があり、軟骨に損傷を与えます。また、この手順は、拡張した軟骨細胞⁶を移植するための第2の操作を必要とするであろう。したがって、軟骨損傷のないOA治療のためのワンステップ療法が広範囲に検討されています。

間葉系幹細胞(MSC)は、OA治療の有望な代替手段として示唆されています^7,8。複数の組織に由来するMSCは、特定の刺激で軟骨細胞に分化することができます。重要なことに、間葉系幹細胞は抗炎症を介して免疫応答を調節することができます⁹。したがって、間葉系幹細胞は、軟骨欠損を修復し、特に炎症環境において免疫応答を調節することにより、OA治療において大きな利点を有する。OA治療では、滑液由来のMSC(SF-MSC)は、他のMSCソースよりも軟骨細胞分化能が強いため、最近注目を集めています^10,11。特に整形外科クリニックでは、関節腔からの炎症性SFの抽出は、OA患者の疼痛症状を緩和するための日常的な治療法です。抽出された炎症性SFは、通常、医療廃棄物として処分される。患者と医師の両方が、炎症性SFから分離された自家間葉系幹細胞を、倫理的葛藤がほとんどないOA治療と見なす準備ができています。ただし、SF-MSC療法は、腫瘍形成のリスク、長期保存、および遠隔輸送の障壁のために損なわれます。

MSCを含む多くの細胞タイプによって分泌されるエキソソームは、親細胞の生体情報の大部分を運びます。無細胞療法として詳細に検討されている^12、13。臨床試験政府(ClinicalTrials.gov)のウェブサイトで入手可能な最新のリソースによると、癌、高血圧、および神経変性疾患の研究分野で、より広範なエキソソーム臨床試験が開始され、実施されています。SF-MSCエキソソーム治療は、OAに対処するための刺激的で挑戦的な試験になる可能性があります。適正製造基準(GMP)グレードの大規模なエキソソーム生産は、臨床翻訳に不可欠です。小規模なエキソソーム単離は、2次元(2D)細胞培養に基づいて広く行われています。しかし、大規模なエクソソーム生産戦略には最適化が必要です。本研究では、ゼノフリー条件下での大量のSF-MSC培養に基づいて、大規模なエキソソーム製造方法を開発しました。細胞培養上清からの超遠心分離後、エキソソームの安全性と機能が検証されました。

プロトコル

この研究は、深セン第二人民病院の人間倫理委員会によって承認されました。 インビトロ プロトコルでhSF-MSCから単離されたエキソソームの概略図を 図1に示します。

1. ヒトSF-MSCの培養と同定

1. 臨床OA患者から注射器と針を使用して20mLのSFを採取します。
   1. OA患者の膝関節を消毒します。膝蓋骨の外側の大腿四頭筋腱から7#針で関節腔に穿刺します。
   2. 関節液10mLを抽出します。輸血スティックで穿刺部位を覆い、5分間押します。
2. SF上清を1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、廃棄する。
3. 細胞ペレットを10 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁し、1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、PBSを廃棄します。
4. ペレットを10 mLのヒトMSC培地で細胞密度5 x 10⁴ cells/mLで再懸濁し( 材料表を参照)、懸濁液を100 mmディッシュにプレートします。
5. 5%_CO2を含む雰囲気下で37°Cでディッシュをインキュベートする。
6. 48時間後、培地を交換して非接着細胞を除去し、1x PBSで洗浄します。3日ごとに2週間培地を交換してください。
7. 細胞培養上清を採取する。
8. フローサイトメトリーを用いてSF-MSCを同定します。
   1. 第3世代(P3)のSF-MSCを消化し、1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを回収する。
      注:継代は、別の培養皿への細胞の継代培養として認識されます。SFから単離され、ディッシュに播種された初代細胞は、継代ゼロ(P0)としてラベル付けされます。約75%のコンフルエントで、細胞は消化され、ディッシュから切り離され、他のディッシュに播種され、P1として標識されます。
   2. 400 μLのブロッキングバッファー(1x PBS中の1%BSA)をセルペレット(5 x 10⁴)に加え、室温(RT)で15分間静置します。
   3. 1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁します。
   4. チューブあたり1 μLのCD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLA-DRモノクローナル蛍光抗体(希釈比1:100)( 材料の表を参照)を加え、RTで30分間インキュベートします。
   5. 1x PBSで2回洗浄し、上清を廃棄します。細胞ペレットを回収し、100 μLの1x PBSに再懸濁します。
   6. 525/50および585/40のフィルターを使用して最大10,000個の細胞をフローサイトメーターで検出し、蛍光色素を検出します。

2.3Dバイオリアクター細胞培養

1. マイクロキャリアの調製
   1. 乾燥した0.75 gのマイクロキャリア( 材料の表を参照)を膨潤させ、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(50 mL / gのマイクロキャリア)でRTで少なくとも3時間水和します。
   2. 上清をデカントし、新鮮なDPBS(50 mL/gのマイクロキャリア)でマイクロキャリアを5分間洗浄します。PBSを廃棄し、新しい1x DPBS(50 mL / gのマイクロキャリア)と交換します。
   3. マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌(121°C、15分、15psi)します。滅菌したマイクロキャリアを沈降させ、上清をデカントします。
   4. 培養液中のマイクロキャリア(50 mL/gのマイクロキャリア)をRTで短時間すすぎ、マイクロキャリアを沈降させ、上清を廃棄します。
2. 灌流バイオリアクター
   1. オートクレーブ(121°C、15分、15psi)によってバイオリアクターを滅菌します。
   2. SF-MSCの数を数え、GMPグレードのMSC培養液(250 mL)を灌流したバイオリアクターに2.5 x 10^{7 SF-MSC} とマイクロキャリアを割り当てます。
   3. バイオリアクターを37°Cで5%_CO2 の入ったインキュベーターに入れる。 バイオリアクターを15rpmの速度で回転させます。6日ごとに培地を交換してください。
   4. 14日間の培養後、さらなる分析のために細胞培養上清とマイクロキャリアを収集します。

3. エクソソーム同定と安全性検出

1. 超遠心
   1. 細胞培養上清を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。細胞の破片を捨てます。
   2. 上清を2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。より大きな小胞(アポトーシス小体といくつかの大きな微小小胞)を捨てます。
   3. 上清を10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、より大きな小胞を除去します。ペレットを収集し、40 mLの1x PBSに再懸濁します。
   4. 再懸濁したペレットを120,000 x g で4°Cで70分間遠心分離し、上清を廃棄し、エキソソームを含むペレットを500 μLの1x PBSに再懸濁します。
2. ナノ粒子追跡分析(NTA)
   注:各実行について、500 μLのサンプルを30 μL/分の流速でチャンバーに注入しました。24.4°C〜24.5°Cで分析を実行します。
   1. 新たに単離したエキソソームサンプルを滅菌1x PBSで10^{7-10 9} / mLの粒子を含む1 mLに希釈し、ナノ粒子追跡分析システムに注入します( 材料の表を参照)。
   2. メーカーのプロトコルに従って、キャプチャおよび分析システムを手動で設定します。レーザー光散乱によって粒子を視覚化し、デジタルビデオでブラウン運動をキャプチャします。
   3. 実行ごとに少なくとも200個の個々の粒子を追跡することに基づいて、ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して記録されたビデオテープを分析します。
3. 透過型電子顕微鏡
   1. エキソソームを4%パラホルムアルデヒド(冷たい1x DPBS)で5分間固定します。
   2. 5 μLのエキソソームを銅グリッドにマウントします。この実験では、エクソソームの濃度はタンパク質アッセイキットによって1 mg / mL定量されます( 材料の表を参照)。
   3. エキソソームを3%リンタングステン酸に氷上で10分間埋め込みます。余分な酸を取り除き、RTでサンプルを乾燥させます。
   4. エキソソームサンプルをTEMにより加速電圧100kVでイメージングします。
4. ウェスタンブロッティング
   1. 300 μLの溶解バッファー(1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1 M Tris HCl、pH 7)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル( 材料の表を参照)をエキソソームに加えます。
   2. エキソソームを溶解バッファー中で上下にピペッティングして混合し、氷上に20分間静置します。
   3. 混合物を9,391 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
   4. 100 μLの4xタンパク質ローディングバッファーを加え、100°Cで10分間加熱します。
   5. 15 μLのタンパク質を10 mg/mLの濃度でロードし、ゲル電気泳動(120 V、70分)および100 V、4°Cで60分のエレクトロブロッティングで実行します。
   6. 非エキソソーム特異的マーカー(カルネキシン)およびエキソソームバイオマーカー(CD9、CD63、およびCD81)を蛍光ウェスタンブロッティングで検出します( 材料の表を参照)。
5. 安全性試験
   1. 細菌、真菌、結核 菌 を検出するには、手順3.5.2〜3.5.5に従います。
   2. 100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)を血液寒天培養プレート( 材料表参照)に播種し、培養プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
   3. 100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)をサブロー寒天培地プレート( 材料の表を参照)に播種し、35°Cで48時間インキュベートします。
   4. 100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)をローウェンスタイン・ジェンセン培養培地プレート( 材料の表を参照)に播種し、37°Cで3週間インキュベートします。
   5. 細菌、真菌、 結核菌 群のコロニーの出現を巨視観察により検出します。
      注:エクソソームの安全性を評価するための基準は、培養プレート上に微生物が存在しないことです。
   6. マイコプラズマを検出するには、手順3.5.7〜3.5.9に従います。
   7. キットに含まれている50 μLの緩衝液にエキソソームを再懸濁し、95°Cで3分間加熱します。
   8. PCRマイコプラズマ検出キットを使用して、エキソソーム溶液中のマイコプラズマを増幅します(材料の表を参照)。
   9. 1.5% アガロースゲル電気泳動 (30 分、120 V) で PCR 産物を検出します。

4. インビトロ エクソソーム機能検出

1. エキソソーム標識
   1. 100 μLのエキソソーム(1 mg/mL)を1 mM Dil(1000x)で標識し( 材料の表を参照)、RTで30分間インキュベートします。
   2. 100,000 x g で70分間の超遠心によりエキソソームを回収します。ペレットを500 μLの1x PBSに再懸濁します。
2. Cy3-miR-140模倣体のエキソソームへの装填
   1. 1 μg/μLのエキソソームタンパク質と5 μmol/mLのCy3-miR-140を最終容量400 μLのエレクトロポレーションバッファー(1.15 mMリン酸カリウム(pH 7.2)、25 mM塩化カリウム、21%(v/v))に混合します( 材料の表を参照)。
   2. 混合物を冷たい0.4 cmエレクトロポレーションキュベットに移し、遺伝子トランスフェクションシステムを使用して300 V/100 μFの容量でエレクトロポレーションします(材料の表を参照)。
   3. エレクトロポレーションの直後に、混合物をRTで30分間維持して、エキソソーム膜が完全に回復することを確認します。
   4. 混合物を1単位のRNase A( 材料の表を参照)で20分間処理して、エクソソーム外のmiRNA模倣物を除去します。
   5. エキソソーム混合物を120,000 x g で90分間超遠心し、上清を廃棄して、500 μLの1x PBSにエキソソームを再懸濁します。
3. エキソソーム取り込みアッセイ
   1. 軟骨細胞(1 x 10⁷)を35 mmの共焦点ディッシュに、10%FBSを含む1 mLのDMEM/F12で播種します。
   2. 24時間後、軟骨細胞をDiI標識エキソソーム(100 ng / mL)またはcy3-miR-140ロードエキソソーム(100 ng / mL)で1時間処理します。
   3. 1x PBSで3回洗浄した後、DAPI(10 ng / mL)でRTで10分間ラベルを付けます。
   4. 適切なフィルターを使用して、共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(CLSM)で蛍光信号を記録します(材料表を参照)。

5.統計分析

1. 適切な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
   注:各図の代表データは、SD±平均値として表した。スチューデントのt検定は、統計ソフトウェアを使用して2つのグループを比較するために使用されました。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重分布は、複数のグループ間の比較の場合に実行されました。P 値は <0.05 (*)、<0.01 (**)、または <0.001 (_***) です。

結果

フローサイトメトリーは、国際細胞療法学会が推奨するヒトMSCを定義するための最小限の基準に従って、SF-MSCの表面マーカーを同定するために使用されました^14,15。フローサイトメトリー解析の結果、本研究で培養したSF-MSCsがMSCの同定基準を満たしていることが明らかになりました。CD34、CD45、およびHLA-DRは陰性(3%未満)、CD73、CD90、およびCD105(95%以...

ディスカッション

間葉系幹細胞は、その自己複製、特殊な機能を有する組織細胞への分化、およびパラクリン効果により、再生医療において広く利用されてきた^16,17。特に、エクソソームが及ぼすパラクリン効果が大きな注目を集めている¹⁸。エクソソームは間葉系幹細胞の生体情報を運び、その生物学的機能を果たし、面倒な保管や出荷などのMSC?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge