Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Abstract

Gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati suggeriti come candidati promettenti per le lesioni della cartilagine e il trattamento dell'osteoartrite. Gli esosomi per applicazioni cliniche richiedono una produzione su larga scala. A tal fine, le MSC del liquido sinoviale umano (hSF-MSCs) sono state coltivate su perle di microcarrier e quindi coltivate in un sistema di coltura dinamico tridimensionale (3D). Attraverso l'utilizzo di colture dinamiche 3D, questo protocollo ha ottenuto con successo esosomi su larga scala da supernatanti di coltura SF-MSC. Gli esosomi sono stati raccolti mediante ultracentrifugazione e verificati da un microscopio elettronico a trasmissione, saggio di trasmissione di nanoparticelle e western blotting. Inoltre, è stata rilevata la sicurezza microbiologica degli esosomi. I risultati del rilevamento degli esosomi suggeriscono che questo approccio può produrre un gran numero di esosomi di grado GMP (Good Manufacturing Practices). Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'osteoartrite.

Introduzione

L'osteoartrite (OA), derivante dalla cartilagine articolare e dalla rottura ossea sottostante, rimane una grave sfida che porta alla disabilità ^1,2. Senza l'apporto di sangue e nervi, la capacità di auto-guarigione della cartilagine è minima una volta feriti ^3,4. Negli ultimi decenni, le terapie basate sull'impianto autologo di condrociti (ACI) hanno fatto alcuni progressi nel trattamento dell'OA⁵. Per l'isolamento e l'espansione dei condrociti, è necessario raccogliere una piccola cartilagine dall'area non portante dell'articolazione OA, causando lesioni alla cartilagine. Inoltre, la procedura richiederà una seconda operazione per impiantare i condrociti espansi⁶. Pertanto, le terapie in un'unica fase per il trattamento dell'OA senza lesioni della cartilagine sono in fase di ampia esplorazione.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state suggerite come alternative promettenti per il trattamento dell'OA ^7,8. Originate da più tessuti, le MSC possono differenziarsi in condrociti con una stimolazione specifica. È importante sottolineare che le MSC possono modulare le risposte immunitarie tramite l'anti-infiammazione⁹. Pertanto, le MSC hanno vantaggi significativi nel trattamento dell'OA riparando i difetti della cartilagine e modulando la risposta immunitaria, specialmente nell'ambiente infiammatorio. Per il trattamento dell'OA, le MSC da liquido sinoviale (SF-MSCs) hanno recentemente attirato molta attenzione a causa della loro più forte capacità di differenziazione dei condrociti rispetto ad altre fonti di MSC^10,11. In particolare, presso la clinica ortopedica, l'estrazione di SF infiammatoria dalla cavità articolare è una terapia di routine per alleviare il sintomo del dolore dei pazienti con OA. La SF infiammatoria estratta di solito viene smaltita come rifiuto medico. Sia i pazienti che i medici sono pronti a considerare le MSC autologhe isolate dalla SF infiammatoria come trattamento OA con pochissimi conflitti etici. Tuttavia, la terapia con SF-MSC è compromessa a causa dei rischi tumorigenici, della conservazione a lungo termine e delle barriere di spedizione distanti.

Gli esosomi, secreti da molti tipi di cellule, comprese le MSC, trasportano la maggior parte delle bio-informazioni della cellula madre. È stato studiato in modo approfondito come terapia cell-free^12,13. Secondo le risorse aggiornate disponibili sul sito web del governo della sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov), vengono avviati e intrapresi studi clinici sugli esosomi più ampi nei campi di ricerca del cancro, dell'ipertensione e delle malattie neurodegenerative. Il trattamento degli esosomi SF-MSC potrebbe essere uno studio entusiasmante e impegnativo per far fronte all'OA. La produzione di esosomi di grado GMP e su larga scala è essenziale per la traduzione clinica. L'isolamento degli esosomi su piccola scala è stato ampiamente eseguito sulla base di colture cellulari bidimensionali (2D). Tuttavia, le strategie di produzione di esosomi su larga scala devono essere ottimizzate. In questo studio è stato sviluppato un metodo di produzione di esosomi su larga scala, basato su una massiccia coltura SF-MSC in condizioni prive di xeno. Dopo l'ultracentrifugazione da supernatanti di coltura cellulare, sono state convalidate la sicurezza e la funzione degli esosomi.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato di etica umana del secondo ospedale popolare di Shenzhen. Un diagramma schematico di esosomi isolati dal protocollo hSF-MSCs in vitro è mostrato in Figura 1.

1. Cultura e identificazione delle SF-MSC umane

1. Raccogliere 20 ml di SF usando una siringa e un ago da pazienti clinici con OA.
   1. Disinfettare l'articolazione del ginocchio del paziente OA. Puntura dal tendine del quadricipite femorale al di fuori della rotula nella cavità articolare con un ago 7#.
   2. Estrarre 10 ml del liquido articolare. Coprire il sito di puntura con il bastone trasfusionale e premere per 5 minuti.
2. Eliminare il surnatante SF dopo centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C.
3. Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il PBS.
4. Risospendere il pellet con 10 ml di terreno di coltura MSC umano ad una densità cellulare di 5 x 10⁴ cellule/ml (vedere Tabella dei materiali), quindi placcare la sospensione in un piatto da 100 mm.
5. Incubare il piatto a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO₂.
6. Dopo 48 ore, rimuovere le cellule non aderenti cambiando il mezzo e lavare con 1x PBS. Sostituire il mezzo ogni 3 giorni per 2 settimane.
7. Raccogliere i supernatanti di coltura cellulare.
8. Identificare le SF-MSC utilizzando la citometria a flusso.
   1. Digerire la terza generazione (P3) di SF-MSC, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
      NOTA: Un passaggio viene riconosciuto come la sottocoltura delle cellule in un altro piatto di coltura. Le cellule primarie isolate da SF e seminate sui piatti sono etichettate come passaggio zero (P0). A circa il 75% di confluenza, le cellule vengono digerite e staccate dai piatti, seminate su altri piatti ed etichettate come P1.
   2. Aggiungere 400 μL di tampone bloccante (1% BSA in 1x PBS) al pellet cellulare (5 x 10⁴) e lasciarlo riposare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di 1x PBS.
   4. Aggiungere 1 μL di CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonale HLA-DR (rapporto di diluizione 1:100) (vedere Tabella dei materiali) per provetta e incubare a RT per 30 minuti.
   5. Lavare due volte con 1x PBS e gettare il surnatante. Raccogliere il pellet cellulare e risospendere in 100 μL di 1x PBS.
   6. Rileva su un citometro a flusso fino a 10.000 cellule utilizzando filtri di 525/50 e 585/40 per rilevare i fluorofori.

2.3D Coltura cellulare di bioreattore

1. Preparazione microcarrier
   1. Gonfiare i 0,75 g secchi di microcarrier (vedi Tabella dei materiali) e idratare in 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (50 mL/g di microcarrier) per almeno 3 ore a RT.
   2. Decantare il surnatante e lavare i microcarrier per 5 minuti in DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier). Eliminare il PBS e sostituirlo con 1x DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier).
   3. Sterilizzare i microcarrier mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Lasciare che i microvettori sterilizzati si depositino, decantare il surnatante.
   4. Risciacquare brevemente i microcarrier nel terreno di coltura (50 mL/g di microcarrier) a RT. Lasciare che i microcarrier si depositino, scartare il surnatante.
2. Bioreattore a perfusione
   1. Sterilizzare il bioreattore mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
   2. Contare il numero di SF-MSC e allocare 2,5 x 10⁷ SF-MSC e microcarrier al bioreattore perfuso con terreno di coltura MSC di grado GMP (250 ml).
   3. Mettere il bioreattore in un incubatore con il 5% di CO₂ a 37 °C. Ruotare il bioreattore ad una velocità di 15 giri / min. Cambiare il terreno di coltura ogni 6 giorni.
   4. Raccogliere i supernatanti e i microcarrier della coltura cellulare per ulteriori analisi dopo la coltura per 14 giorni.

3. Identificazione degli esosomi e rilevamento della sicurezza

1. Ultracentrifugazione
   1. Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; Scartare i detriti cellulari.
   2. Centrifugare i surnatanti a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; scartare le vescicole più grandi (corpi apoptotici e alcune microvescicole più grandi).
   3. Centrifugare nuovamente il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere le vescicole più grandi; raccogliere i pellet e risospenderli in 40 ml di 1x PBS.
   4. Centrifugare i pellet risospesi a 120.000 x g per 70 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere i pellet che contengono esosomi in 500 μL di 1x PBS.
2. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
   NOTA: Per ogni corsa, 500 μL del campione sono stati iniettati nella camera ad una portata di 30 μL/min. Eseguire l'analisi a 24,4 °C-24,5 °C.
   1. Diluire i campioni di esosoma appena isolati con 1x PBS sterile a 1 mL contenente 10^{7-10 9} /mL di particelle e iniettarli nel sistema di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (vedere Tabella dei materiali).
   2. Impostare manualmente il sistema di acquisizione e analisi in base al protocollo del produttore. Visualizza le particelle mediante diffusione della luce laser e cattura il loro movimento browniano su video digitali.
   3. Analizza le videocassette registrate utilizzando un software (vedi Tabella dei materiali) in base al tracciamento di almeno 200 singole particelle per esecuzione.
3. Microscopia elettronica a trasmissione
   1. Fissare gli esosomi in paraformaldeide al 4% (in freddo 1x DPBS) per 5 minuti.
   2. Montare 5 μL di esosomi su griglie di rame. In questo esperimento, la concentrazione di esosomi è di 1 mg/ml quantificata da un kit di analisi delle proteine (vedi Tabella dei materiali).
   3. Incorporare gli esosomi in acido fosfotungstico al 3% per 10 minuti sul ghiaccio. Rimuovere l'acido in eccesso e asciugare i campioni a RT.
   4. Immagini dei campioni di esosoma mediante un TEM ad una tensione di accelerazione di 100 kV.
4. Western blotting
   1. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e cocktail di inibitori della proteasi (vedere Tabella dei materiali) agli esosomi.
   2. Mescolare gli esosomi nel tampone di lisi mediante pipettaggio su e giù e lasciarlo riposare sul ghiaccio per 20 minuti.
   3. Centrifugare la miscela a 9,391 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi delle proteine (vedere la tabella dei materiali).
   4. Aggiungere 100 μL di 4x tampone di carico proteico e riscaldare a 100 °C per 10 minuti.
   5. Caricare 15 μL di proteine ad una concentrazione di 10 mg/mL ed eseguire mediante elettroforesi su gel (120 V, 70 min) ed elettroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
   6. Rilevare i marcatori non esosomi-specifici (calnexina) e i biomarcatori esosomici (CD9, CD63 e CD81) mediante western blotting fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
5. Test di sicurezza
   1. Per il rilevamento di batteri, funghi e Mycobacterium tuberculosis seguire i passaggi 3.5.2-3.5.5.
   2. Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di coltura di agar sanguigno (vedere tabella dei materiali) e incubare la piastra di coltura a 37 °C per 24 ore.
   3. Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra media di agar sabouraud (vedere tabella dei materiali) e incubare a 35 °C per 48 ore.
   4. Semare 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di terreno di coltura Lowenstein-Jensen (vedere tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 3 settimane.
   5. Rilevare la comparsa di batteri, funghi e colonie di Mycobacterium tuberculosis mediante osservazione macroscopica.
      NOTA: I criteri per valutare la sicurezza degli esosomi sono l'assenza di microrganismi sulla piastra di coltura.
   6. Per il rilevamento del micoplasma, seguire i passaggi 3.5.7-3.5.9.
   7. Risospendere gli esosomi in 50 μL di soluzione tampone inclusa nel kit e riscaldare a 95 °C per 3 minuti.
   8. Amplificare il Mycoplasma in soluzione di esosoma utilizzando un kit di rilevamento del Mycoplasma PCR (vedere Tabella dei materiali).
   9. Rilevare i prodotti PCR con elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% (30 min, 120 V).

4. Rilevamento della funzione degli esosomi in vitro

1. Etichettatura degli esosomi
   1. Etichettare 100 μL di esosomi (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (vedi Tabella dei materiali) e incubare a RT per 30 minuti.
   2. Recuperare gli esosomi mediante ultracentrifugazione a 100.000 x g per 70 minuti. Risospendere il pellet in 500 μL di 1x PBS.
2. Il caricamento di Cy3-miR-140 imita negli esosomi
   1. Mescolare 1 μg/μL di proteina esosomica e 5 μmol/mL di Cy3-miR-140 in un volume finale di 400 μL di tampone per elettroporazione (1,15 mM di fosfato di potassio (pH 7,2), 25 mM di cloruro di potassio e 21% (v/v) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Trasferire la miscela in cuvette di elettroporazione fredda da 0,4 cm ed elettroporate con capacità di 300 V/100 μF utilizzando un sistema di trasfezione genica (vedi Tabella dei materiali).
   3. Immediatamente dopo l'elettroporazione, mantenere la miscela a RT per 30 minuti per garantire che la membrana dell'esosoma sia completamente ripristinata.
   4. Trattare le miscele con un'unità di RNasi A (vedere Tabella dei materiali) per 20 minuti per eliminare i miRNA imitatori al di fuori degli esosomi.
   5. Ultracentrifugare la miscela di esosomi a 120.000 x g per 90 minuti, scartare il surnatante e risospendere gli esosomi in 500 μL di 1x PBS.
3. Saggio di assorbimento degli esosomi
   1. Seminare i condrociti (1 x 10⁷) in piatti confocali da 35 mm con 1 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS.
   2. Dopo 24 ore, trattare i condrociti con esosomi marcati con DiI (100 ng/mL) o esosomi caricati con cy3-miR-140 (100 ng/mL) per 1 ora.
   3. Lavare con 1x PBS tre volte, quindi etichettare con DAPI (10 ng / mL) per 10 minuti a RT.
   4. Registrare il segnale di fluorescenza in microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale (CLSM) utilizzando i filtri appropriati (vedi Tabella dei materiali).

5. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici appropriati.
   NOTA: I dati rappresentativi in ciascuna figura sono stati espressi come media ± DS. Il t-test di Student è stato utilizzato per il confronto di due gruppi utilizzando software di statistica. Un ANOVA unidirezionale seguito dal multiplo di Tukey è stato eseguito nel caso di confronti tra più gruppi. Valori P <0,05 (_*), <0,01 (_**) o <0,001 (_***).

Risultati

La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSCs, secondo i criteri minimi per definire le MSC umane raccomandati dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare^14,15. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate in questo studio hanno soddisfatto i criteri di identificazione delle MSC. Sono risultati negativi per CD34, CD45 e HLA-DR (inferiori al 3%) e positivi per CD73, CD90 e ...

Discussione

Le cellule staminali mesenchimali sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa grazie al loro auto-rinnovamento, differenziate in cellule tissutali con funzioni specializzate ed effetti paracrini^16,17. In particolare, gli effetti paracrini esercitati dagli esosomi hanno attirato molta attenzione¹⁸. Gli esosomi trasportano le bioinformazioni delle MSC e svolgono la loro funzione biologica e superano le carenze delle MSC, com...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge