Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Zusammenfassung

Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.

Einleitung

Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt ^1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist ^3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht⁵. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren⁶. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen ^7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können⁹. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt^10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.

Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapie^{untersucht 12,13}. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People's Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs

1. Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.
   1. Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-Sehne außerhalb der Patella in die Gelenkhöhle mit einer 7 # Nadel.
   2. Extrahieren Sie 10 ml der Gelenkflüssigkeit. Die Einstichstelle mit dem Transfusionsstift abdecken und 5 min drücken.
2. Der SF-Überstand ist nach der Zentrifugation bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zu verwerfen.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS), zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie das PBS.
4. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von 5 x 10⁴ Zellen/ml (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Suspension dann in einer 100-mm-Schale.
5. Die Schale wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%_CO2 inkubiert.
6. Nach 48 h die nicht adhärenten Zellen durch Mediumwechsel entfernen und mit 1x PBS waschen. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage für 2 Wochen.
7. Sammeln Sie die Zellkulturüberstände.
8. Identifizieren Sie SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie.
   1. Aufschluss der dritten Generation (P3) von SF-MSCs, Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.
      HINWEIS: Eine Passage wird als Subkultur der Zellen zu einer anderen Kulturschale erkannt. Die aus SF isolierten und auf Schalen ausgesäten Primärzellen werden als Durchgang Null (P0) bezeichnet. Bei etwa 75% Zusammenfluss werden die Zellen verdaut und vom Geschirr getrennt, auf anderen Schalen ausgesät und als P1 gekennzeichnet.
   2. 400 μL Blockierpuffer (1% BSA in 1x PBS) in das Zellpellet (5 x 10⁴) geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.
   3. Bei 1.000 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 μL 1x PBS resuspendieren.
   4. 1 μL monoklonaler fluoreszierender Antikörper CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (Verdünnungsverhältnis 1:100) (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen zugeben und bei RT für 30 min inkubieren.
   5. Zweimal mit 1x PBS waschen und den Überstand entsorgen. Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 100 μL 1x PBS.
   6. Detektieren Sie auf einem Durchflusszytometer bis zu 10.000 Zellen mit Filtern von 525/50 und 585/40, um die Fluorophore zu erkennen.

2.3D Bioreaktor-Zellkultur

1. Mikroträger-Vorbereitung
   1. Die trockenen 0,75 g Mikroträger quellen lassen (siehe Materialtabelle) und hydratisieren Sie 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 ml/g Mikroträger) für mindestens 3 h bei RT.
   2. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Mikroträger für 5 min in frischem DPBS (50 ml/g Mikroträger). Entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch frisches 1x DPBS (50 ml/g Mikroträger).
   3. Sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi). Lassen Sie die sterilisierten Mikroträger absetzen, dekantieren Sie den Überstand.
   4. Spülen Sie die Mikroträger kurz im Kulturmedium (50 ml/g Mikroträger) bei RT. Lassen Sie die Mikroträger absetzen, verwerfen Sie den Überstand.
2. Perfusionsbioreaktor
   1. Sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi).
   2. Zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs und weisen Sie dem Bioreaktor, der mit GMP-fähigem MSC-Kulturmedium (250 ml) perfundiert ist, 2,5 x 10⁷ SF-MSCs und Mikroträger zu.
   3. Den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5%_CO2 bei 37 °C geben. Drehen Sie den Bioreaktor mit einer Drehzahl von 15 U/min. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 6 Tage.
   4. Sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger für die weitere Analyse nach der Kultur für 14 Tage.

3. Identifizierung von Exosomen und Sicherheitsnachweis

1. Ultrazentrifugation
   1. Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Entsorgen Sie die Zelltrümmer.
   2. Zentrifugieren Sie die Überstände bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Verwerfen Sie die größeren Vesikel (apoptotische Körper und einige größere Mikrovesikel).
   3. Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um größere Vesikel zu entfernen; Sammeln Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 40 ml 1x PBS.
   4. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Pellets bei 120.000 x g für 70 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets, die Exosomen enthalten, in 500 μL 1x PBS.
2. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
   HINWEIS: Für jeden Durchlauf wurden 500 μL der Probe mit einer Durchflussrate von 30 μL/min in die Kammer injiziert. Führen Sie die Analyse bei 24,4 °C-24,5 °C durch.
   1. Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem 1x PBS auf 1 ml mit 10^{7-10 9} /ml Partikeln verdünnt und in das Nanopartikel-Tracking-Analysesystem injiziert (siehe Materialtabelle).
   2. Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.
   3. Analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit Software (siehe Materialtabelle), basierend auf der Verfolgung von mindestens 200 einzelnen Partikeln pro Lauf.
3. Transmissionselektronenmikroskopie
   1. Fixieren Sie die Exosomen in 4% Paraformaldehyd (in kaltem 1x DPBS) für 5 min.
   2. Montieren Sie 5 μL der Exosomen auf Kupfergittern. In diesem Experiment beträgt die Konzentration der Exosomen 1 mg/ml, quantifiziert durch ein Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
   3. Die Exosomen in 3% Phosphowolframsäure für 10 min auf Eis einbetten. Entfernen Sie die überschüssige Säure und trocknen Sie die Proben bei RT.
   4. Stellen Sie die Exosomenproben mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV vor.
4. Western Blotting
   1. 300 μL Lysepuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) und Proteaseinhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle) zu den Exosomen hinzufügen.
   2. Mischen Sie die Exosomen im Lysepuffer, indem Sie auf und ab pipettieren und 20 min auf Eis stehen lassen.
   3. Die Mischung bei 9.391 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
   4. 100 μL 4x Proteinladepuffer zugeben und 10 min bei 100 °C erhitzen.
   5. Laden Sie 15 μL Proteine in einer Konzentration von 10 mg/ml und laufen durch Gelelektrophorese (120 V, 70 min) und Elektroblotting bei 100 V, 60 min bei 4 °C.
   6. Nachweis der nicht-exosomenspezifischen Marker (Calnexin) und exosomalen Biomarker (CD9, CD63 und CD81) durch fluoreszierendes Western Blotting (siehe Materialtabelle).
5. Sicherheitsprüfung
   1. Für den Nachweis von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis folgen Sie den Schritten 3.5.2-3.5.5.
   2. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) werden auf eine Blutagarkulturplatte gesät (siehe Materialtabelle) und die Kulturplatte bei 37 °C für 24 h inkubiert.
   3. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf eine Sabouraud-Agar-Mediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und bei 35 °C 48 h inkubiert.
   4. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf einer Lowenstein-Jensen-Kulturmediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und 3 Wochen bei 37 °C inkubiert.
   5. Erkennen Sie das Auftreten von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis-Kolonien durch makroskopische Beobachtung.
      HINWEIS: Kriterien für die Bewertung der Sicherheit von Exosomen sind das Fehlen von Mikroorganismen auf der Kulturplatte.
   6. Führen Sie für den Mykoplasmennachweis die Schritte 3.5.7-3.5.9 aus.
   7. Resuspendieren Sie die Exosomen in 50 μL Pufferlösung, die im Kit enthalten ist, und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 3 min.
   8. Amplifizieren Sie das Mykoplasma in Exosomenlösung mit einem PCR-Mykoplasmen-Detektionskit (siehe Materialtabelle).
   9. Nachweis der PCR-Produkte auf 1,5% Agarose-Gelelektrophorese (30 min, 120 V).

4. In-vitro-Nachweis der Exosomenfunktion

1. Exosomen-Markierung
   1. 100 μL Exosomen (1 mg/ml) mit 1 mM Dil (1000x) markieren (siehe Materialtabelle) und bei RT für 30 min inkubieren.
   2. Die Exosomen werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 70 min zurückgewonnen. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 1x PBS.
2. Laden von Cy3-miR-140 imitiert Exosomen
   1. Mischen Sie 1 μg/μL exosomales Protein und 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in einem Endvolumen von 400 μL Elektroporationspuffer (1,15 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), 25 mM Kaliumchlorid und 21% (v/v) (siehe Materialtabelle).
   2. Die Mischung wird mit einem Gentransfektionssystem in kalte 0,4 cm Elektroporationsküvetten und Elektroporat mit einer Kapazität von 300 V/100 μF überführt (siehe Materialtabelle).
   3. Halten Sie die Mischung unmittelbar nach der Elektroporation 30 Minuten lang bei RT, um sicherzustellen, dass die Exosomenmembran vollständig wiederhergestellt ist.
   4. Behandeln Sie die Mischungen mit einer Einheit RNase A (siehe Materialtabelle) für 20 Minuten, um die miRNA-Nachahmungen außerhalb der Exosomen zu eliminieren.
   5. Ultrazentrifugieren Sie das Exosomengemisch bei 120.000 x g für 90 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Exosomen in 500 μL 1x PBS.
3. Exosomen-Aufnahmetest
   1. Die Chondrozyten (1 x 10⁷) werden in 35 mm konfokalen Schalen mit 1 ml DMEM/F12 mit 10% FBS ausgesät.
   2. Nach 24 h behandeln Sie die Chondrozyten 1 h lang mit DiI-markierten Exosomen (100 ng/ml) oder cy3-miR-140-beladenen Exosomen (100 ng/ml).
   3. Dreimal mit 1x PBS waschen und dann 10 min bei RT mit DAPI (10 ng/ml) etikettieren.
   4. Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) mit den entsprechenden Filtern (siehe Materialtabelle).

5. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter statistischer Software durch.
   ANMERKUNG: Die repräsentativen Daten in jeder Abbildung wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für den Vergleich zweier Gruppen mittels Statistiksoftware verwendet. Eine Einweg-ANOVA gefolgt von Tukey's Multiple wurde bei Vergleichen zwischen mehreren Gruppen durchgeführt. P-Werte <0,05 (*), <0,01 (**) oder <0,001 (_***).

Ergebnisse

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie^14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 ...

Diskussion

Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet^16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt¹⁸. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. S...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge