Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Résumé

Les exosomes sécrétés par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérés comme des candidats prometteurs pour les lésions cartilagineuses et le traitement de l’arthrose. Les exosomes pour application clinique nécessitent une production à grande échelle. À cette fin, des CSM du liquide synovial humain (hSF-MSC) ont été cultivées sur des billes microporteuses, puis cultivées dans un système de culture dynamique en trois dimensions (3D). En utilisant la culture dynamique 3D, ce protocole a réussi à obtenir des exosomes à grande échelle à partir de surnageants de culture SF-MSC. Les exosomes ont été récoltés par ultracentrifugation et vérifiés par un microscope électronique à transmission, un test de transmission de nanoparticules et un transfert Western. En outre, la sécurité microbiologique des exosomes a été détectée. Les résultats de la détection des exosomes suggèrent que cette approche peut produire un grand nombre d’exosomes de qualité Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrose.

Introduction

L’arthrose, résultant du cartilage articulaire et de la dégradation osseuse sous-jacente, demeure un défi de taille menant à l’invalidité ^1,2. Sans apport sanguin et nerveux, la capacité d’auto-guérison du cartilage est minime une fois blessé ^3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies basées sur l’implantation de chondrocytes autologues (ICA) ont fait des progrès dans le traitement de l’arthrose⁵. Pour l’isolement et l’expansion des chondrocytes, il est nécessaire de prélever le petit cartilage de la zone non portante ....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine du deuxième hôpital populaire de Shenzhen. Un diagramme schématique des exosomes isolés à partir du protocole in vitro hSF-MSCs est présenté à la figure 1.

1. Culture et identification des SF-MSC humaines

1. Prélever 20 mL de SF à l’aide d’une seringue et d’une aiguille provenant de patients atteints d’arthrose clinique.
   1. Désinfecter l’articulation du genou du patient atteint d’arthrose. Ponction du tendon du quadriceps fémoral à l’extérieur de la rotule dans la cavité articulaire avec une aiguille 7#.
   2. ....

Résultats

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC, selon les critères minimaux pour définir les CSM humaines recommandés par l’International Society for Cellular Therapy^14,15. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-CSF cultivées dans cette étude répondaient aux critères d’identification des CSM. Ils étaient négatifs pour CD34, CD45 et HLA-DR (inférieurs à 3 %) et positifs pour CD73, CD.......

Discussion

Les cellules souches mésenchymateuses ont été largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur auto-renouvellement, différenciées en cellules tissulaires ayant des fonctions spécialisées et des effets paracrines^16,17. Notamment, les effets paracrines exercés par les exosomes ont attiré beaucoup d’attention¹⁸. Les exosomes transportent la bio-information des CSM et remplissent leur fonction biologique et surmon.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge