Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Résumé

Les exosomes sécrétés par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérés comme des candidats prometteurs pour les lésions cartilagineuses et le traitement de l’arthrose. Les exosomes pour application clinique nécessitent une production à grande échelle. À cette fin, des CSM du liquide synovial humain (hSF-MSC) ont été cultivées sur des billes microporteuses, puis cultivées dans un système de culture dynamique en trois dimensions (3D). En utilisant la culture dynamique 3D, ce protocole a réussi à obtenir des exosomes à grande échelle à partir de surnageants de culture SF-MSC. Les exosomes ont été récoltés par ultracentrifugation et vérifiés par un microscope électronique à transmission, un test de transmission de nanoparticules et un transfert Western. En outre, la sécurité microbiologique des exosomes a été détectée. Les résultats de la détection des exosomes suggèrent que cette approche peut produire un grand nombre d’exosomes de qualité Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrose.

Introduction

L’arthrose, résultant du cartilage articulaire et de la dégradation osseuse sous-jacente, demeure un défi de taille menant à l’invalidité ^1,2. Sans apport sanguin et nerveux, la capacité d’auto-guérison du cartilage est minime une fois blessé ^3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies basées sur l’implantation de chondrocytes autologues (ICA) ont fait des progrès dans le traitement de l’arthrose⁵. Pour l’isolement et l’expansion des chondrocytes, il est nécessaire de prélever le petit cartilage de la zone non portante de l’articulation arthrose, ce qui provoque des lésions au cartilage. En outre, la procédure nécessitera une deuxième opération pour implanter les chondrocytes dilatés⁶. Ainsi, les thérapies en une étape pour le traitement de l’arthrose sans lésions cartilagineuses font l’objet d’une exploration approfondie.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérées comme alternatives prometteuses pour le traitement de l’arthrose ^7,8. Provenant de plusieurs tissus, les CSM peuvent se différencier en chondrocytes avec une stimulation spécifique. Il est important de noter que les CSM peuvent moduler les réponses immunitaires via un anti-inflammation⁹. Par conséquent, les CSM présentent des avantages significatifs dans le traitement de l’arthrose en réparant les défauts du cartilage et en modulant la réponse immunitaire, en particulier dans le milieu de l’inflammation. Pour le traitement de l’arthrose, les CSM du liquide synovial (SF-MSC) ont récemment attiré beaucoup d’attention en raison de leur capacité de différenciation des chondrocytes plus forte que les autres sources de CSM^10,11. Notamment, à la clinique orthopédique, l’extraction de SF inflammatoire de la cavité articulaire est une thérapie de routine pour soulager le symptôme de douleur des patients atteints d’arthrose. Le SF inflammatoire extrait est généralement éliminé comme un déchet médical. Les patients et les médecins sont prêts à considérer les CSM autologues isolées du SF inflammatoire comme traitement de l’arthrose avec très peu de conflits éthiques. Cependant, le traitement SF-MSC est compromis en raison des risques tumorigènes, du stockage à long terme et des barrières d’expédition éloignées.

Les exosomes, sécrétés par de nombreux types de cellules, y compris les CSM, transportent la plupart des informations biologiques de la cellule mère. Il a été étudié en profondeur en tant que thérapie acellulaire^12,13. Selon les ressources mises à jour disponibles sur le site Web du gouvernement des essais cliniques (ClinicalTrials.gov), des études cliniques plus approfondies sur les exosomes sont lancées et entreprises dans les domaines de recherche du cancer, de l’hypertension et des maladies neurodégénératives. Le traitement par exosomes SF-MSC pourrait être un essai passionnant et difficile pour faire face à l’arthrose. Les bonnes pratiques de fabrication (BPF) et la production d’exosomes à grande échelle sont essentielles pour la traduction clinique. L’isolement d’exosomes à petite échelle a été largement réalisé sur la base d’une culture cellulaire bidimensionnelle (2D). Cependant, les stratégies de production d’exosomes à grande échelle doivent être optimisées. Une méthode de fabrication d’exosomes à grande échelle a été développée dans cette étude, basée sur une culture massive de SF-MSC dans des conditions sans xéno. Après ultracentrifugation à partir de surnageants de culture cellulaire, l’innocuité et la fonction des exosomes ont été validées.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine du deuxième hôpital populaire de Shenzhen. Un diagramme schématique des exosomes isolés à partir du protocole in vitro hSF-MSCs est présenté à la figure 1.

1. Culture et identification des SF-MSC humaines

1. Prélever 20 mL de SF à l’aide d’une seringue et d’une aiguille provenant de patients atteints d’arthrose clinique.
   1. Désinfecter l’articulation du genou du patient atteint d’arthrose. Ponction du tendon du quadriceps fémoral à l’extérieur de la rotule dans la cavité articulaire avec une aiguille 7#.
   2. Extraire 10 mL du liquide articulaire. Couvrir le site de ponction avec le bâtonnet de transfusion et appuyer pendant 5 min.
2. Éliminer le surnageant SF après centrifugation à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Resuspendre la pastille cellulaire avec 10 mL de 1x solution saline tampon phosphate (PBS), centrifuger à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le PBS.
4. Remettez la pastille en suspension avec 10 mL de milieu de culture CSM humain à une densité cellulaire de 5 x 10⁴ cellules/mL (voir le tableau des matériaux), puis plaquez la suspension dans une boîte de 100 mm.
5. Incuber la capsule à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO₂.
6. Après 48 h, retirez les cellules non adhérentes en changeant le milieu et lavez avec 1x PBS. Remplacez le milieu tous les 3 jours pendant 2 semaines.
7. Recueillir les surnageants de culture cellulaire.
8. Identifier les SF-MSC à l’aide de la cytométrie en flux.
   1. Digérer la troisième génération (P3) de SF-MSC, centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et recueillez la pastille de cellule.
      NOTE: Un passage est reconnu comme la sous-culture des cellules vers une autre boîte de culture. Les cellules primaires isolées de SF et ensemencées sur des boîtes sont étiquetées comme passage zéro (P0). À environ 75% de confluence, les cellules sont digérées et détachées des plats, ensemencées sur d’autres plats et étiquetées comme P1.
   2. Ajouter 400 μL de tampon bloquant (1% BSA dans 1x PBS) à la pastille de cellule (5 x 10⁴) et laisser reposer pendant 15 min à température ambiante (RT).
   3. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
   4. Ajouter 1 μL d’anticorps fluorescents monoclonaux CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (rapport de dilution de 1:100) (voir le tableau des matières) par tube et incuber à TA pendant 30 min.
   5. Laver deux fois avec 1x PBS et jeter le surnageant. Recueillir la pastille de cellule et la remettre en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
   6. Détecter sur un cytomètre en flux jusqu’à 10 000 cellules à l’aide de filtres de 525/50 et 585/40 pour détecter les fluorophores.

2.3D culture cellulaire de bioréacteur

1. Préparation des microporteurs
   1. Gonfler les 0,75 g secs de microtransporteurs (voir le tableau des matériaux) et hydrater dans 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (50 mL/g de microporteurs) pendant au moins 3 h à TA.
   2. Décanter le surnageant et laver les microporteurs pendant 5 min dans du DPBS frais (50 mL/g de microporteurs). Jetez le PBS et remplacez-le par 1x DPBS frais (50 mL/g de microsupports).
   3. Stériliser les microporteurs par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi). Laissez les microporteurs stérilisés s’installer, décanter le surnageant.
   4. Rincer brièvement les microporteurs dans le milieu de culture (50 mL/g de microporteurs) à TA. Laisser les microporteurs s’installer, jeter le surnageant.
2. Bioréacteur de perfusion
   1. Stériliser le bioréacteur par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi).
   2. Compter le nombre de CSF-CSF et allouer 2,5 x 10⁷ CSF-CSF et microporteurs au bioréacteur perfusé avec un milieu de culture MSC de qualité GMP (250 mL).
   3. Placer le bioréacteur dans un incubateur contenant 5% de CO₂ à 37 °C. Faire pivoter le bioréacteur à une vitesse de 15 tr/min. Changez le milieu de culture tous les 6 jours.
   4. Recueillir les surnageants de culture cellulaire et les microporteurs pour une analyse plus approfondie après la culture pendant 14 jours.

3. Identification des exosomes et détection de sécurité

1. Ultracentrifugation
   1. centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; Jetez les débris cellulaires.
   2. Centrifuger les surnageants à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; jeter les plus grandes vésicules (corps apoptotiques et certaines microvésicules plus grandes).
   3. Centrifuger à nouveau le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour enlever les vésicules plus grosses; recueillir les granulés et les remettre en suspension dans 40 ml de 1x PBS.
   4. Centrifuger les pastilles en suspension à 120 000 x g pendant 70 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles contenant des exosomes dans 500 μL de 1x PBS.
2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
   REMARQUE : Pour chaque passage, 500 μL de l’échantillon ont été injectés dans la chambre à un débit de 30 μL/min. Effectuer l’analyse à 24,4 °C-24,5 °C.
   1. Diluer les échantillons d’exosomes fraîchement isolés avec 1x PBS stérile à 1 mL contenant 10^{7-10 9} /mL de particules et les injecter dans le système d’analyse de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux).
   2. Réglez manuellement le système de capture et d’analyse selon le protocole du fabricant. Visualisez les particules par diffusion laser de la lumière et capturez leur mouvement brownien sur vidéo numérique.
   3. Analysez les bandes vidéo enregistrées à l’aide d’un logiciel (voir le tableau des matériaux) en suivant au moins 200 particules individuelles par exécution.
3. Microscopie électronique à transmission
   1. Fixer les exosomes dans 4% de paraformaldéhyde (dans froid 1x DPBS) pendant 5 min.
   2. Monter 5 μL des exosomes sur des grilles de cuivre. Dans cette expérience, la concentration d’exosomes est de 1 mg/mL quantifiée par un kit de dosage des protéines (voir Tableau des matériaux).
   3. Incorporer les exosomes dans de l’acide phosphotungstique à 3% pendant 10 minutes sur de la glace. Retirer l’excès d’acide et sécher les échantillons à TA.
   4. Imager les échantillons d’exosomes par un TEM à une tension d’accélération de 100 kV.
4. Western blotting
   1. Ajouter 300 μL de tampon de lyse (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) et cocktail d’inhibiteurs de protéase (voir Tableau des matériaux) aux exosomes.
   2. Mélangez les exosomes dans le tampon de lyse en pipetant de haut en bas et laissez-le reposer sur la glace pendant 20 minutes.
   3. Centrifuger le mélange à 9 391 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines (voir le tableau des matériaux).
   4. Ajouter 100 μL de tampon de charge protéique 4x et chauffer à 100 °C pendant 10 min.
   5. Charge de 15 μL de protéines à une concentration de 10 mg/mL et fonctionnement par électrophorèse sur gel (120 V, 70 min) et électrobuvardage à 100 V, 60 min à 4 °C.
   6. Détecter les marqueurs non spécifiques aux exosomes (calnexine) et les biomarqueurs exosomiques (CD9, CD63 et CD81) par transfert Western fluorescent (voir le tableau des matériaux).
5. Test de sécurité
   1. Pour la détection des bactéries, des champignons et de Mycobacterium tuberculosis , suivez les étapes 3.5.2 à 3.5.5.
   2. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de culture de gélose au sang (voir le tableau des matières) et incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 24 h.
   3. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de sabouraud gélose moyenne (voir tableau des matières) et incuber à 35 °C pendant 48 h.
   4. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de milieu de culture Lowenstein-Jensen (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 3 semaines.
   5. Détecter l’apparition de bactéries, de champignons et de colonies de Mycobacterium tuberculosis par observation macroscopique.
      NOTE: Les critères d’évaluation de l’innocuité des exosomes sont l’absence de micro-organismes sur la plaque de culture.
   6. Pour la détection des mycoplasmes, suivez les étapes 3.5.7 à 3.5.9.
   7. Resuspendre les exosomes dans 50 μL de solution tampon incluse dans le kit et chauffer à 95 °C pendant 3 min.
   8. Amplifier le mycoplasme dans une solution d’exosomes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes PCR (voir le tableau des matériaux).
   9. Détecter les produits PCR sur électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% (30 min, 120 V).

4. Détection in vitro de la fonction exosome

1. Marquage des exosomes
   1. Étiqueter 100 μL d’exosomes (1 mg/mL) avec 1 mM Dil (1000x) (voir le tableau des matières) et incuber à TA pendant 30 min.
   2. Récupérer les exosomes par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 70 min. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
2. Chargement de mimères Cy3-miR-140 dans des exosomes
   1. Mélanger 1 μg/μL de protéine exosomale et 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 dans un volume final de 400 μL de tampon d’électroporation (1,15 mM de phosphate de potassium (pH 7,2), 25 mM de chlorure de potassium et 21 % (v/v) (voir le tableau des matières).
   2. Transférer le mélange dans des cuvettes d’électroporation froides de 0,4 cm et électropoter à une capacité de 300 V/100 μF à l’aide d’un système de transfection génique (voir Tableau des matériaux).
   3. Immédiatement après l’électroporation, maintenir le mélange à TA pendant 30 minutes pour s’assurer que la membrane exosomique est complètement restaurée.
   4. Traiter les mélanges avec une unité de RNase A (voir le tableau des matières) pendant 20 minutes pour éliminer les imitations miARN à l’extérieur des exosomes.
   5. Ultracentrifuger le mélange d’exosomes à 120 000 x g pendant 90 min, jeter le surnageant et remettre les exosomes en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
3. Dosage de l’absorption des exosomes
   1. Ensemencer les chondrocytes (1 x 10⁷) dans des boîtes confocales de 35 mm avec 1 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS.
   2. Après 24 h, traiter les chondrocytes avec des exosomes marqués DiI (100 ng / mL) ou des exosomes chargés de cy3-miR-140 (100 ng / mL) pendant 1 h.
   3. Laver avec 1x PBS trois fois, puis étiqueter avec DAPI (10 ng / mL) pendant 10 minutes à TA.
   4. Enregistrer le signal de fluorescence en microscopie confocale à fluorescence à balayage laser (CLSM) à l’aide des filtres appropriés (voir le tableau des matériaux).

5. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel statistique approprié.
   NOTA : Les données représentatives de chaque figure ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour comparer deux groupes à l’aide d’un logiciel de statistiques. Une ANOVA unidirectionnelle suivie du multiple de Tukey a été réalisée dans le cas de comparaisons entre plusieurs groupes. P valeurs <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (_***).

Résultats

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC, selon les critères minimaux pour définir les CSM humaines recommandés par l’International Society for Cellular Therapy^14,15. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-CSF cultivées dans cette étude répondaient aux critères d’identification des CSM. Ils étaient négatifs pour CD34, CD45 et HLA-DR (inférieurs à 3 %) et positifs pour CD73, CD...

Discussion

Les cellules souches mésenchymateuses ont été largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur auto-renouvellement, différenciées en cellules tissulaires ayant des fonctions spécialisées et des effets paracrines^16,17. Notamment, les effets paracrines exercés par les exosomes ont attiré beaucoup d’attention¹⁸. Les exosomes transportent la bio-information des CSM et remplissent leur fonction biologique et surmon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge