Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Resumo

Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.

Introdução

A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade ^1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez ^{lesada 3,4}. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA⁵. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, ....

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Um diagrama esquemático de exossomos isolados do protocolo in vitro de hSF-MSCs é mostrado na Figura 1.

1. Cultura e identificação de SF-MSCs humanas

1. Colher 20 mL de SF usando seringa e agulha de pacientes clínicos com OA.
   1. Desinfetar a articulação do joelho do paciente com OA. Punção do tendão do quadríceps femoral fora da patela para a cavidade articular com uma agulha 7#.
   2. Extraia 10 mL do fluido articular. Cubra o local da punção com o bastão de transfusão e press....

Resultados

A citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs, de acordo com os critérios mínimos para definição de CTMs humanas recomendados pela International Society for Cellular Therapy^14,15. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas neste estudo preencheram os critérios de identificação das CTMs. Foram negativos para CD34, CD45 e HLA-DR (abaixo de 3%) e positivos para CD73, CD90 e CD105 (acima .......

Discussão

As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos^16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção¹⁸. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armaz.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge