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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Resumo

Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.

Introdução

A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade 1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez lesada 3,4. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA5. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, causando lesões na cartilagem. Além disso, o procedimento exigirá uma segunda operação para implantar os condrócitos expandidos6. Assim, terapias de uma etapa para o tratamento da OA sem lesões cartilaginosas estão sob extensa exploração.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridas como alternativas promissoras para o tratamento da OA 7,8. Originárias de múltiplos tecidos, as CTMs podem se diferenciar em condrócitos com estimulação específica. É importante ressaltar que as CTMs podem modular as respostas imunes por meio da anti-inflamação9. Portanto, as MSCs possuem vantagens significativas no tratamento da OA, reparando defeitos da cartilagem e modulando a resposta imune, especialmente no meio inflamatório. Para o tratamento da OA, as CTMs do líquido sinovial (SF-MSCs) têm atraído recentemente muita atenção devido à sua maior capacidade de diferenciação de condrócitos do que outras fontes deCTMs 10,11. Notavelmente, na clínica ortopédica, a extração de SF inflamatória da cavidade articular é uma terapia de rotina para aliviar o sintoma de dor de pacientes com OA. A SF inflamatória extraída geralmente é descartada como resíduo médico. Tanto os pacientes quanto os médicos estão prontos para considerar as CTMs autólogas isoladas da SF inflamatória como tratamento da OA com muito poucos conflitos éticos. No entanto, a terapia SF-MSC está comprometida devido a riscos tumorigênicos, armazenamento de longo prazo e barreiras de remessa distantes.

Os exossomos, secretados por muitos tipos de células, incluindo MSCs, carregam a maior parte da bioinformação da célula-mãe. Tem sido investigada em profundidade como terapia livre de células12,13. De acordo com os recursos atualizados disponíveis no site do governo de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov), estudos clínicos exossômicos mais extensos são iniciados e realizados nos campos de pesquisa de câncer, hipertensão e doenças neurodegenerativas. O tratamento com exossomos SF-MSC pode ser um estudo empolgante e desafiador para lidar com a OA. A produção de exossomos de boas práticas de fabrico (BPF) e de exossomas em larga escala é essencial para a tradução clínica. O isolamento exossomático em pequena escala tem sido amplamente realizado com base em cultura de células bidimensionais (2D). No entanto, as estratégias de produção de exossomos em larga escala precisam de otimização. Um método de fabricação de exossomos em larga escala foi desenvolvido neste estudo, baseado na cultura maciça de SF-MSC em condições livres de xeno. Após a ultracentrifugação de sobrenadantes de cultura celular, a segurança e a função do exossomo foram validadas.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Um diagrama esquemático de exossomos isolados do protocolo in vitro de hSF-MSCs é mostrado na Figura 1.

1. Cultura e identificação de SF-MSCs humanas

  1. Colher 20 mL de SF usando seringa e agulha de pacientes clínicos com OA.
    1. Desinfetar a articulação do joelho do paciente com OA. Punção do tendão do quadríceps femoral fora da patela para a cavidade articular com uma agulha 7#.
    2. Extraia 10 mL do fluido articular. Cubra o local da punção com o bastão de transfusão e pressione por 5 min.
  2. Rejeitar o sobrenadante SF após centrifugação a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Ressuspender o pellet celular com 10 mL de solução salina 1x tampão fosfato (PBS), centrifugar a 1.500 x g por 10 min a 4 °C e descartar o PBS.
  4. Ressuspeite o pellet com 10 mL de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de 5 x 104 células/mL (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, coloque a suspensão em um prato de 100 mm.
  5. Incubar o prato a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2.
  6. Após 48 h, retire as células não aderentes trocando o meio e lave com 1x PBS. Substitua o meio a cada 3 dias por 2 semanas.
  7. Colete os sobrenadantes da cultura celular.
  8. Identificar SF-MSCs usando citometria de fluxo.
    1. Digerir a terceira geração (P3) de SF-MSCs, centrífuga a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e colete o pellet celular.
      NOTA: Uma passagem é reconhecida como a subcultura das células para outro prato de cultura. As células primárias isoladas de SF e semeadas em pratos são rotuladas como passagem zero (P0). Com cerca de 75% de confluência, as células são digeridas e separadas dos pratos, semeadas em outros pratos e rotuladas como P1.
    2. Adicione 400 μL de tampão de bloqueio (1% BSA em 1x PBS) ao pellet da célula (5 x 104) e deixe-o repousar durante 15 min à temperatura ambiente (RT).
    3. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 μL de 1x PBS.
    4. Adicionar 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonal HLA-DR (razão de diluição 1:100) (ver Tabela de Materiais) por tubo e incubar a RT durante 30 min.
    5. Lave duas vezes com 1x PBS e descarte o sobrenadante. Recolher o pellet celular e ressuspender em 100 μL de 1x PBS.
    6. Detectar em um citômetro de fluxo até 10.000 células usando filtros de 525/50 e 585/40 para detectar os fluoróforos.

2.3D cultura de células de biorreator

  1. Preparação de microtransportadores
    1. Inchar 0,75 g secos de microcarreadores (ver Tabela de Materiais) e hidratar em 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 mL/g de microcarreadores) por pelo menos 3 h no RT.
    2. Decantar o sobrenadante e lavar os microtransportadores por 5 min em DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores). Descarte o PBS e substitua-o por 1x DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores).
    3. Esterilizar os microcarreadores por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Deixe os microportadores esterilizados se assentarem, decantando o sobrenadante.
    4. Enxaguar brevemente os microcarreadores no meio de cultura (50 mL/g de microcarreadores) no RT. Deixe os microcarreadores assentarem, descarte o sobrenadante.
  2. Biorreator de perfusão
    1. Esterilizar o biorreator por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Conte o número de SF-MSCs e aloque 2,5 x 107 SF-MSCs e microtransportadores ao biorreator perfundido com meio de cultura MSC de grau GMP (250 mL).
    3. Colocar o biorreator em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C. Gire o biorreator a uma velocidade de 15 rpm. Mude o meio de cultura a cada 6 dias.
    4. Coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise mais aprofundada após a cultura por 14 dias.

3. Identificação de exossomos e detecção de segurança

  1. Ultracentrifugação
    1. Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descartar os detritos celulares.
    2. Centrifugar os sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descarte as vesículas maiores (corpos apoptóticos e algumas microvesículas maiores).
    3. Centrifugar novamente o sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para remover vesículas maiores; coletar os pellets e ressuspender em 40 mL de 1x PBS.
    4. Centrifugar os pellets ressuspensos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender os pellets que contêm exossomas em 500 μL de 1x PBS.
  2. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    NOTA: Para cada corrida, 500 μL da amostra foram injetados na câmara a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Efectuar a análise a 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Diluir as amostras de exossomas recém-isoladas com PBS estéril de 1x a 1 mL contendo 107-10 9 /mL de partículas e injetá-las no sistema de análise de rastreamento de nanopartículas (ver Tabela de Materiais).
    2. Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.
    3. Analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software (consulte Tabela de materiais) com base no rastreamento de pelo menos 200 partículas individuais por execução.
  3. Microscopia eletrônica de transmissão
    1. Fixe os exossomos em paraformaldeído a 4% (em frio 1x DPBS) por 5 min.
    2. Monte 5 μL dos exossomos em grades de cobre. Neste experimento, a concentração de exossomos é de 1 mg/mL quantificada por um kit de ensaio de proteínas (ver Tabela de Materiais).
    3. Incorpore os exossomos em ácido fosfotúngstico a 3% por 10 min no gelo. Remova o excesso de ácido e seque as amostras no RT.
    4. Fotografe as amostras de exossomos por um MET a uma tensão de aceleração de 100 kV.
  4. Mancha ocidental
    1. Adicione 300 μL de tampão de lise (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e coquetel de inibidores de protease (ver Tabela de Materiais) aos exossomos.
    2. Misture os exossomos no tampão de lise pipetando para cima e para baixo e deixe-o repousar sobre o gelo por 20 minutos.
    3. Centrifugar a mistura a 9,391 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína (consulte Tabela de materiais).
    4. Adicionar 100 μL de tampão de carga proteica 4x e aquecer a 100 °C durante 10 min.
    5. Carga de 15 μL de proteínas na concentração de 10 mg/mL e executado por eletroforese em gel (120 V, 70 min) e eletroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
    6. Detecte os marcadores não específicos do exossomo (calexina) e os biomarcadores exossômicos (CD9, CD63 e CD81) por western blotting fluorescente (consulte Tabela de Materiais).
  5. Teste de segurança
    1. Para a detecção de bactérias, fungos e Mycobacterium tuberculosis , siga as etapas 3.5.2-3.5.5.
    2. Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/mL) numa placa de cultura em ágar sangue (ver Tabela de Materiais) e incubar a placa de cultura a 37 °C durante 24 h.
    3. Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/ml) numa placa média de ágar sabouraud (ver Tabela de Materiais) e incubar a 35 °C durante 48 h.
    4. Semear 100 μL da solução exossómica (1 mg/ml) numa placa de meio de cultura de Lowenstein-Jensen (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.
    5. Detectar o aparecimento de bactérias, fungos e colônias de Mycobacterium tuberculosis por observação macroscópica.
      NOTA: Os critérios para avaliar a segurança dos exossomos são a ausência de microrganismos na placa de cultura.
    6. Para detecção de Mycoplasma, siga as etapas 3.5.7-3.5.9.
    7. Ressuspender os exossomos em 50 μL de solução tampão incluída no kit e aquecer a 95 °C durante 3 min.
    8. Amplificar o Mycoplasma em solução exossômica usando um kit de detecção de Mycoplasma por PCR (consulte Tabela de Materiais).
    9. Detectar os produtos de PCR em eletroforese em gel de agarose a 1,5% (30 min, 120 V).

4. Detecção da função exossômica in vitro

  1. Rotulagem de exossomos
    1. Rotular 100 μL de exossomos (1 mg/mL) com 1 mM de Dil (1000x) (ver Tabela de Materiais) e incubar em RT por 30 min.
    2. Recuperar os exossomos por ultracentrifugação a 100.000 x g por 70 min. Ressuscite o pellet em 500 μL de 1x PBS.
  2. Carregamento de Cy3-miR-140 imita em exossomos
    1. Misture 1 μg/μL de proteína exossômica e 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 em um volume final de 400 μL de tampão de eletroporação (1,15 mM de fosfato de potássio (pH 7,2), 25 mM de cloreto de potássio e 21% (v/v) (ver Tabela de Materiais).
    2. Transfira a mistura para cuvetes de eletroporação frias de 0,4 cm e eletroporate a uma capacitância de 300 V/100 μF usando um sistema de transfecção gênica (ver Tabela de Materiais).
    3. Imediatamente após a eletroporação, mantenha a mistura em RT por 30 minutos para garantir que a membrana do exossomo seja totalmente restaurada.
    4. Trate as misturas com uma unidade de RNase A (ver Tabela de Materiais) por 20 minutos para eliminar os miRNA imitados fora dos exossomos.
    5. Ultracentrifugar a mistura de exossomos a 120.000 x g por 90 min, descartar o sobrenadante e ressuspender os exossomos em 500 μL de 1x PBS.
  3. Ensaio de absorção de exossomos
    1. Semeando os condrócitos (1 x 107) em placas confocais de 35 mm com 1 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS.
    2. Após 24 h, tratar os condrócitos com exossomos marcados com DiI (100 ng/mL) ou exossomos carregados com cy3-miR-140 (100 ng/mL) por 1 h.
    3. Lave com 1x PBS três vezes e, em seguida, rotule com DAPI (10 ng/mL) por 10 min no RT.
    4. Registre o sinal de fluorescência em microscopia de fluorescência a laser confocal (CLSM) usando os filtros apropriados (consulte Tabela de materiais).

5. Análise estatística

  1. Realizar análises estatísticas utilizando software estatístico apropriado.
    NOTA: Os dados representativos em cada figura foram expressos como a média ± DP. O teste t de Student foi utilizado para a comparação de dois grupos utilizando um software de estatística. Uma ANOVA one-way seguida do múltiplo de Tukey foi realizada no caso de comparações entre múltiplos grupos. Os valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (***).

Resultados

A citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs, de acordo com os critérios mínimos para definição de CTMs humanas recomendados pela International Society for Cellular Therapy14,15. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas neste estudo preencheram os critérios de identificação das CTMs. Foram negativos para CD34, CD45 e HLA-DR (abaixo de 3%) e positivos para CD73, CD90 e CD105 (acima ...

Discussão

As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção18. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armaz...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (No.2018B0303110003); Projecto de Cooperação Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Projetos de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, Não. JCYJ20170817172023838, Não. JCYJ20170306092215436, Não. JCYJ20170413161649437); Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (No.2020M682907); Fundação de Investigação Básica e Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201612079); Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na Província de Guangdong.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BCA assay kitThermoFisher23227Protein concentration assay
Blood agar plateNanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.P0903Bacteria culture
CD105 antibodyElabscienceE-AB-F1243CFlow cytometry
CD34 antibodyElabscienceE-AB-F1143CFlow cytometry
CD45 antibodyBD Bioscience555483Flow cytometry
CD63 antibodyAbclonal A5271Western blotting
CD73 antibodyElabscienceE-AB-F1242CFlow cytometry
CD81 antibodyABclonal A5270Western blotting
CD9 antibodyAbclonal A1703Western blotting
CD90 antibodyElabscienceE-AB-F1167CFlow cytometry
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5810R
CO2 incubatorThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopyZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kitBI20-700-20Mycoplasma detection
FlowcytometryBeckmanMSC identification
Gene Pulser II SystemBio-Rad Laboratories1652660Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Version 8.0.2
HLA-DR antibodyElabscienceE-AB-F1111CFlow cytometry
Lowenstein-Jensen culture mediumNanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.T0573Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGroStemRDMGro-500MSC culture
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 softwareMalvernData analysis
Odyssey FCGene Company LimitedFluorescent western blotting
OptiPrep electroporation bufferSigmaD3911Gene transfection
Protease inhibitors cocktailSigmaP8340Proteinase inhibitor
RNase AQiagen158924Removal of RNA
Sabouraud agar plateNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Fungi culture
TEMJEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)SyntheconRCCS-4HD3D culture
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosome centrifuge

Referências

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