创伤性脑损伤后评估成年大鼠空间工作记忆的指标测试

摘要

创伤性脑损伤 （TBI） 通常与记忆障碍相关。在此，我们提出一个协议，通过公制任务评估 TBI 之后的空间工作内存。公制测试是研究 TBI 后空间工作记忆障碍的有用工具。

摘要

感觉、短期和长期记忆损伤是创伤性脑损伤 （TBI） 后常见的副作用。由于人类研究的伦理局限性，动物模型为测试治疗方法和研究该病的机理和相关并发症提供了合适的替代方案。实验啮齿动物模型历来是使用最广泛的，因为它的可访问性，低成本，可重复性和经过验证的方法。公制测试是一种技术，可以测试在TBI之后研究空间工作记忆 （SWM） 损伤的技术，它测试了在彼此之间不同距离和角度上回忆两个物体放置的能力。公制任务的主要优点包括动态观察的可能性、低成本、可重复性、相对易于实施和低应力环境。在这里，我们提出了一个公制测试协议，以测量TBI后成年大鼠SWM的损伤。该测试为更有效地评估大脑功能的生理学和病理生理学提供了可行的方法。

引言

中度创伤性脑损伤（TBI）后，注意力、执行功能和某些记忆缺陷等神经缺陷的患病率超过50%，1、2、3、4、5、6、7、8。TBI 可导致空间短期、长期和工作记忆⁹的严重损伤。这些记忆障碍在TBI的啮齿动物模型中已经观察到。Rodent 模型使测试记忆的技术得以发展，从而能够更深入地检查 TBI 对神经记忆系统内存处理的影响。

两项测试分别与拓扑和公制空间信息处理有关，有助于测量空间工作记忆 （SWM）。拓扑测试取决于改变环境空间的大小或相关空间的连接或围绕一个物体，而公制测试评估在角度或距离对象^10，11之间的变化。古德里奇-亨萨克等人首先对大鼠¹⁰号进行了人体拓扑测试，并应用了指标任务，将腹膜皮层（PC）和背海马在空间信息处理^中的作用分离。同样，古尔科夫和他的同事评估了横向液体打击伤害⁹后的指标、拓扑和时间顺序记忆任务。大脑某些区域的损伤与公制或拓扑记忆的损伤之间存在相关性。有人提出，公制记忆损伤与海马的双侧牙周收缩陀螺和角膜氨基（CA）亚区域CA3的病变有关，拓扑记忆损伤与双侧皮质病变^10、12有关。

此协议的目的是通过公制任务评估大鼠群体的空间记忆缺陷。该方法是脑损伤后SWM研究机制的合适替代方案，其优点包括实施相对容易、灵敏度高、可重复性低、动态观察的可能性大、应力环境低等。与其他行为任务，如巴恩斯迷宫^13，14，莫里斯水导航任务^{15，16，17，}或空间迷宫任务18，19，这个指标测试是不那么复杂。由于其易于实施，指标测试需要更短和压力较小的训练时间，只进行2天9:1天的习惯和1天的任务。此外，我们建议的测试比其他低压力测试更容易执行，如新颖的对象识别 （NOR） 任务，并且不需要额外的一天习惯^20。

本文为脑损伤后SWM的评价提供了一个简单的模型。这种对TBI后SWM的评估可能有助于对其病理生理学进行更全面的调查。

研究方案

这些实验是根据《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》以及《欧洲共同体实验动物使用准则》的建议进行的。这些实验得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。协议时间表在 图1中说明。

1. 外科手术和液体打击TBI

1. 选择雄性及雌性成年斯普拉格-道利大鼠，其室温为22±1°C，湿度为40%-60%，光黑周期为12-12小时。
2. 提供食物作为周和水 的广告。在上午6:00（.m点至中午12点之间进行实验.m。
3. 在实验开始前对控制组和 TBI 组进行基线神经学评估（参见下面的第 2 节）。
4. 麻醉大鼠吸入4%异黄素进行诱导，1.5%用于维持麻醉。通过测试踏板反射或运动以响应刺激物，确保大鼠无法活动。
   注:使用连续异黄素管理系统进行麻醉。在无菌条件下执行所有程序。
5. 执行寄生液体打击伤害如前所述^21，22。
6. 在切口之前，沿着预期切口部位皮下注射0.2 mL的0.5%的bupivacaine。将大鼠带到康复室，继续监测神经（例如瘫痪）、呼吸系统（例如呼吸骤停）和心血管状态（例如软组织灌注减少、瞳孔颜色变化和心动过速）24小时。在麻醉出现之前，将0.01 - 0.05毫克/千克肌肉内丁丙诺啡作为术后镇痛。每 6 - 12 小时重复剂量，至少 48 小时。

2. 神经严重性评分评估 （NSS）

注:神经缺陷评估是使用NSS进行和分级的，如前所述^23，24。运动功能和行为变化的最高得分为24分。分数 0 表示完整的神经状态，24 表示严重的神经功能障碍，如前所述^24。

1. 测试大鼠在放置中心时无法离开圆圈（直径为 50 厘米）。执行此任务三次，每次会话持续 30 分钟、60 分钟和 60 分钟以上。
   注意:如果用尾巴捡起老鼠，请按住尾巴的底座。
2. 测试大鼠的右反射损失。
   1. 把动物放在研究者的手掌上。如果动物能够纠正自己²⁵ （站在所有四只爪子上）， 给 1 分。
3. 测试大鼠的六肢瘫痪，大鼠无法抵抗强迫定位。
4. 将鼠尾抬起来，以测试后肢的反射弯曲。
5. 把老鼠放在地板上，以测试它直走的能力。
6. 对三种反射行为进行测试:针纳反射、角膜反射和惊吓反射。
   1. 对于pinna反射，执行轻触觉刺激，以测试耳朵缩回如前述^25。
   2. 为了测试角膜反射，监测闪烁反应时，轻轻地应用软棒的眼睛和测量的尺度0（无反应）到三眼闪烁（3），如前述^25。
   3. 对于惊人的反射，拖动笔穿过铁丝笼的顶部，并记录响应与比例从0（无响应）到3（1厘米跳或更多），如前述^25。
7. 根据寻求行为和倾向的丧失（在转移到新环境后不移动胡须、嗅探或奔跑）^对大鼠进行评分。
8. 测试肢体反射，用于放置在左右前肢，然后是左右后肢。
9. 通过光束平衡任务分析功能，光束宽度为 1.5 厘米。执行持续 20 秒、40 秒和 60 秒以上的测试。
10. 用三种不同的光束进行横梁行走测试:8.5 厘米宽、5 厘米宽和 2.5 厘米宽。

3. 为指标任务做准备

1. 设备
   1. 将一个直径200厘米、厚1厘米的黑色圆形平台放在桌子上。桌子的高度应该比地板高80厘米。
   2. 在相距68厘米的圆形平台中心建立两个不同的物体。
      注:在这个实验中，两个玻璃瓶用于物体，一个圆形瓶子，高度为13.5厘米，另一个面体瓶，高度为20厘米。给瓶子加满水，以确保稳定性。
   3. 准备相机并安装所需的计算机软件，用于捕获、保存和处理数据。在距离地面 290 厘米的高度安装摄像头。
      注:平台和摄像机之间的距离取决于摄像机的规格。摄像机框架应覆盖进行测试的竞技场的整个区域。我们实验平台和相机之间的距离是210厘米。
2. 习惯
   1. 在任务的前一天，在没有录像的情况下将老鼠放在竞技场上，在新环境中栖息10分钟。
      注意:不要在同一天执行神经任务和指标任务。
      注:在红灯区域执行公制测试。

4. 执行指标任务

注:执行指标任务包括两个句点:1） 习惯（15 分钟）和 2） 测试（5 分钟）期间。

1. 习惯期
   1. 在相距 68 厘米的圆形平台中心建立两个不同的对象。
   2. 将鼠标放在平台的末端，与物体等距 15 分钟，并录制视频。
   3. 将鼠子从平台上移开，放在单独的笼子里5分钟。
   4. 用 5%-10% 的酒精清洁平台。
      注意:在通风良好的区域，多达 70% 的酒精可用于清洁平台。
2. 测试期
   1. 将物体之间的距离缩短到 34 厘米。
   2. 将鼠放在平台上5分钟，并通过视频记录大鼠的探索活动。
   3. 用 5%-10% 的酒精清洁平台。

5. 数据分析

注:数据分析由专门为动物行为研究设计的视频跟踪软件进行，该软件可自动记录动物的活动和运动（见 材料表）。此软件可自动实现一系列行为变量的自动化，包括移动性、活动性和探索行为。

1. 在分析视频文件之前，插入软件硬件密钥。启动视频跟踪软件并打开预设 模板。
2. 在设置部分，验证设置如下:竞技场、试用控制和检测设置（见图 2a）。
   注:对于此实验，勘探区域的参数定义为围绕感兴趣对象的 6 厘米。测量了老鼠进入这个区域的时间。
3. 验证设置后，重复并重命名它们。
4. 在程序的一般屏幕上，通过右键单击鼠标 来抓取后台 。
5. 为背景图像选择视频文件。在 "浏览" 菜单中，选择视频文件的位置。
6. 捕获图像并标记被调查的区域和区域，校准图像以供分析。执行相同的步骤进行 试验控制 和 检测设置。
7. 在一般菜单中，选择 试用列表 并下载视频文件列表进行分析。
8. 添加视频，并指示位置与所需的设置。
9. 选择获取和开始试用（参见图 2b，c）。将所有数据导出为 Excel 文件（参见图 2d）。
   注:对习惯和测试期执行所有计算。公制任务评估是用高级模板准备的。

结果

使用曼-惠特尼测试确定组之间的比较的重要性。研究结果的统计意义在P<0.05，而统计高度相关性在P<0.01。

结果显示，在干预前和TBI之后的28天，所有群体在NSS上没有差异。每组由12只雌性或12只雄性大鼠组成。在 TBI出现在表1中后，NSS分数获得48小时。TBI组的老鼠在受伤后第28天表现出明显的神经缺陷，被排除在实验之外。数据按计数进行测量，并显示为中位数±范...

讨论

通过专门针对公制空间信息过程，此指标测试为了解 TBI 之后的记忆缺陷提供了必要的工具。本文提出的协议是对先前描述的行为任务¹¹的修改。先前描述的一个指标任务使用了两种不同的范式，每个范式包括三个习惯会话和一个测试会话。第一个范式包括习惯后将熟悉的物体移近在一起，第二个范式将物体移得更远^。

与巴恩斯迷宫相比，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)	This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft