Una prueba métrica para evaluar la memoria de trabajo espacial en ratas adultas después de una lesión cerebral traumática

Resumen

La lesión cerebral traumática (LCT) se asocia comúnmente con el deterioro de la memoria. Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la memoria de trabajo espacial después de una LCT a través de una tarea métrica. Una prueba métrica es una herramienta útil para estudiar el deterioro de la memoria de trabajo espacial después de una LCT.

Resumen

Las deficiencias de la memoria sensorial, a corto y largo plazo son efectos secundarios comunes después de una lesión cerebral traumática (LCT). Debido a las limitaciones éticas de los estudios en humanos, los modelos animales proporcionan alternativas adecuadas para probar los métodos de tratamiento y para estudiar los mecanismos y las complicaciones relacionadas de la afección. Los modelos experimentales de roedores han sido históricamente los más utilizados debido a su accesibilidad, bajo costo, reproducibilidad y enfoques validados. Una prueba métrica, que prueba la capacidad de recordar la colocación de dos objetos a varias distancias y ángulos entre sí, es una técnica para estudiar el deterioro en la memoria de trabajo espacial (SWM) después de una LCT. Las ventajas significativas de las tareas métricas incluyen la posibilidad de observación dinámica, bajo costo, reproducibilidad, relativa facilidad de implementación y ambiente de bajo estrés. Aquí, presentamos un protocolo de prueba métrica para medir el deterioro de SWM en ratas adultas después de TBI. Esta prueba proporciona una forma factible de evaluar la fisiología y la fisiopatología de la función cerebral de manera más efectiva.

Introducción

La prevalencia de déficits neurológicos como la atención, la función ejecutiva y ciertos déficits de memoria después de una lesión cerebral traumática moderada (LCT) es de más del 50 por ciento^{1,2,3,4,5,6,7,8.} La LCT puede conducir a deficiencias graves en la memoria espacial a corto plazo, a largo plazo y de trabajo⁹. Estas alteraciones de la memoria se han observado en modelos de roedores de LCT. Los modelos de roedores han permitido el desarrollo de técnicas para probar la memoria, lo que permite exámenes más profundos sobre el efecto de la LCT en el procesamiento de la memoria en los sistemas de memoria neuronal.

Dos pruebas, relacionadas con el procesamiento de información espacial topológica y métrica respectivamente, ayudan a medir la memoria de trabajo espacial (SWM). La prueba topológica depende de cambiar el tamaño del espacio ambiental o espacios relacionados de conexión o recinto alrededor de un objeto, mientras que la prueba métrica evalúa los cambios en los ángulos o la distancia entre los objetos^10,11. Goodrich-Hunsaker et al. primero adaptaron la prueba topológica humana para^{ratas 10} y aplicaron la tarea métrica para disociar los roles de la corteza parietal (PC) y el hipocampo dorsal en el procesamiento de información espacial¹¹. Del mismo modo, Gurkoff y sus colegas evaluaron las tareas de memoria métrica, topológica y de ordenación temporal después de^{la lesión}por percusión del fluido lateral 9 . Existe una correlación entre el daño a ciertas regiones del cerebro y el deterioro de la memoria métrica o topológica. Se ha sugerido que el deterioro de la memoria métrica está relacionado con lesiones en el giro dentado dorsal bilateral y la subregión CA3 de cornu ammonis (CA) del hipocampo, y que el deterioro topológico de la memoria está relacionado con lesiones bilaterales de la corteza parietal^10,12.

El propósito de este protocolo es evaluar el déficit de memoria espacial en una población de ratas a través de una tarea métrica. Este método es una alternativa adecuada para investigar los mecanismos de SWM después de una lesión cerebral, y sus ventajas incluyen la relativa facilidad de implementación, alta sensibilidad, bajo costo de reproducibilidad, la posibilidad de observación dinámica y un entorno de bajo estrés. En comparación con otras tareas de comportamiento como el laberinto de Barnes^13,14,la tarea de navegación acuática de Morris^15,16,17o las tareas de laberinto espacial^18,19,esta prueba métrica es menos complicada. Debido a su facilidad de implementación, la prueba métrica requiere un período de entrenamiento más corto y menos estresante y se lleva a cabo durante solo 2 días^9:1 día para la habituación y 1 día para la tarea. Además, nuestra prueba propuesta es más fácil de realizar que otras pruebas de bajo estrés, como la nueva tarea de reconocimiento de objetos (NOR), y no requiere el día adicional de habituación²⁰.

Este documento proporciona un modelo sencillo para evaluar swm después de una lesión cerebral. Esta evaluación del SWM post-TBI puede ayudar en una investigación más exhaustiva de su fisiopatología.

Protocolo

Los experimentos se realizaron siguiendo las recomendaciones de las Declaraciones de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales de experimentación de la Comunidad Europea. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev. Una línea de tiempo de protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Procedimientos quirúrgicos y TBI de percusión fluida

1. Seleccione ratas Sprague-Dawley adultas macho y hembra, alojadas a una temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C, y una humedad del 40% -60%, con ciclos de luz-oscuridad de 12-12 h.
2. Proporcionar alimentos como chow y agua ad libitum. Realizar experimentos entre las horas de la mañana, es decir, de 6:00 a.m. a 12:00 p.m.
3. Realizar una evaluación neurológica basal tanto para el grupo de control como para el grupo de LCT antes del inicio del experimento (ver sección 2 a continuación).
4. Anestesiar a las ratas con isoflurano inhalado al 4% para la inducción y al 1,5% para el mantenimiento de la anestesia. Asegúrese de que la rata esté inmovilizada probando el reflejo del pedal o el movimiento en respuesta a un irritante.
   NOTA: Utilice un sistema de administración continua de isoflurano para la anestesia. Realizar todos los procedimientos en condiciones asépticas.
5. Realizar lesiones por percusión de líquido parasagital como se describió anteriormente^21,22.
6. Inyecte por vía subcutánea 0,2 ml de bupivacaína al 0,5% a lo largo del sitio de la incisión prospectiva, antes de la incisión. Llevar a la rata a la sala de recuperación y continuar monitoreando el estado neurológico (por ejemplo, parálisis), respiratorio (por ejemplo, paro respiratorio) y cardiovascular (por ejemplo, disminución de la perfusión de tejidos blandos, cambios en el color de las pupilas y bradicardia) durante 24 h. Antes de la emergencia de la anestesia, administrar 0,01 - 0,05 mg/kg de buprenorfina intramuscular como analgesia postoperatoria. Repita las dosis cada 6 - 12 h durante al menos 48 h.

2. Evaluación de la puntuación de gravedad neurológica (NSS)

NOTA: La evaluación del déficit neurológico se realizó y calificó utilizando un NSS, como se describió anteriormente^23,24. La puntuación máxima de alteración en la función motora y el comportamiento es de 24 puntos. Una puntuación de 0 indica un estado neurológico intacto y 24 indica disfunción neurológica grave, como se describió anteriormente²⁴.

1. Pruebe la incapacidad de la rata para dejar un círculo (50 cm de diámetro) cuando se coloca en su centro. Realice esta tarea tres veces, y cada sesión durará 30 minutos, 60 minutos y más de 60 minutos cada una.
   NOTA: Si recoge ratas por la cola, sostenga la base de la cola.
2. Pruebe a la rata para detectar una pérdida del reflejo de enrechamiento.
   1. Coloque el animal sobre su espalda en la palma de la mano del investigador. Dé una puntuación de 1 si el animal es capaz de ense derecho²⁵ (de pie sobre las cuatro patas).
3. Pruebe a la rata para detectar hemiplejia, la incapacidad de la rata para resistir el posicionamiento forzado.
4. Levante la rata por su cola para probar la flexión reflexiva de la extremidad posterior.
5. Coloque la rata en el suelo para probar su capacidad para caminar recta.
6. Realice pruebas para tres comportamientos reflexivos: el reflejo del pabellón auricular, el reflejo corneal y el reflejo de sobresalto.
   1. Para el reflejo del pabellón auricular, realice una estimulación táctil ligera para probar la retracción del oído como se describió anteriormente²⁵.
   2. Para probar el reflejo corneal, monitoree la respuesta de parpadeo cuando aplique un palo suave ligeramente al ojo y mida en una escala de 0 (sin respuesta) al parpadeo triple del ojo (3), como se describió anteriormente²⁵.
   3. Para el reflejo de sobresalto, arrastre un bolígrafo a través de la parte superior de la jaula de alambre y registre la respuesta con una escala de 0 (sin respuesta) a 3 (salto de 1 cm o más), como se describió anteriormente²⁵.
7. Califíque a la rata en función de la pérdida del comportamiento de búsqueda y la postración (no mover los bigotes, oler o correr después de ser transferido a un nuevo entorno)²⁴.
8. Pruebe los reflejos de las extremidades para la colocación en las extremidades anteriores izquierda y derecha, y luego en las extremidades posteriores izquierda y derecha.
9. Analice la funcionalidad a través de la tarea de equilibrado de vigas con una viga de 1,5 cm de ancho. Realice la prueba para sesiones que duran 20 segundos, 40 segundos y más de 60 segundos.
10. Ejecute la prueba de caminata de viga con tres vigas diferentes: 8,5 cm de ancho, 5 cm de ancho y 2,5 cm de ancho.

3. Preparación para la tarea métrica

1. Equipo
   1. Coloque una plataforma circular negra de 200 cm de diámetro y 1 cm de grosor sobre una mesa. La altura de la mesa debe ser de 80 cm sobre el piso.
   2. Establezca dos objetos diferentes en el centro de la plataforma circular a 68 cm de distancia entre sí.
      NOTA: En este experimento, se utilizaron dos botellas de vidrio para objetos, una botella redonda con una altura de 13,5 cm y otra botella facetada con una altura de 20 cm. Llene las botellas con agua para garantizar la estabilidad.
   3. Prepare una cámara e instale el software informático necesario para capturar, guardar y procesar datos. Instale la cámara a una altura de 290 cm del suelo.
      NOTA: La distancia entre la plataforma y la cámara depende de las especificaciones de la cámara. El marco de la cámara debe cubrir toda el área de la arena en la que se está llevando a cabo la prueba. La distancia para nuestro experimento entre la plataforma y la cámara fue de 210 cm.
2. Habituación
   1. El día antes de la tarea, habitúe a la rata al nuevo entorno durante 10 minutos colocándola en la arena sin grabación de video.
      NOTA: No realice las tareas neurológicas y la tarea métrica el mismo día.
      NOTA: Realice pruebas métricas en un área de luz roja.

4. Realización de la tarea métrica

NOTA: La realización de la tarea métrica consta de dos períodos: 1) período de habituación (15 min) y 2) período de prueba (5 min).

1. Período de habituación
   1. Establezca dos objetos diferentes en el centro de la plataforma circular a 68 cm de distancia entre sí.
   2. Coloque la rata en el extremo de la plataforma equidistante de los objetos durante un período de 15 minutos y grabe el video.
   3. Retire la rata de la plataforma y colóquela en una jaula individual durante 5 minutos.
   4. Limpie la plataforma con 5% -10% de alcohol.
      NOTA: Se puede usar hasta un 70% de alcohol para limpiar la plataforma en áreas bien ventiladas.
2. Período de prueba
   1. Reducir la distancia entre objetos a 34 cm.
   2. Coloque la rata en la plataforma durante 5 minutos y grabe la actividad de exploración de la rata en video.
   3. Limpie la plataforma con 5% -10% de alcohol.

5. Análisis de datos

NOTA: El análisis de datos se realiza mediante un software de seguimiento de video diseñado específicamente para estudios de comportamiento animal que registra automáticamente la actividad y el movimiento de los animales (consulte la Tabla de materiales). Este software automatiza una serie de variables de comportamiento, incluida la movilidad, la actividad y el comportamiento exploratorio.

1. Antes de analizar los archivos de vídeo, inserte la clave de hardware del software. Inicie el software de seguimiento de video y abra la plantillapreestablecida.
2. En la sección Configuración, compruebe la configuración de la siguiente manera: Arena, Control de pruebay Configuración de detección (consulte la Figura 2a).
   NOTA: Para este experimento, los parámetros para el área de exploración se definen como 6 cm alrededor del objeto de interés. Se midió el tiempo que la rata entró en esta área.
3. Después de verificar la configuración, duplique y cámbiele el nombre.
4. En la pantalla general del programa, Grab Background haciendo clic derecho en el mouse.
5. Seleccione un archivo de vídeo para la imagen de fondo. En el menú Examinar, seleccione la ubicación del archivo de vídeo.
6. Capture la imagen y marque las áreas y zonas investigadas, calibrando la imagen para su análisis. Realice los mismos pasos para el control de prueba y la configuración de detección.
7. En el menú general, seleccione Lista de prueba y descargue la lista de archivos de vídeo para su análisis.
8. Agregue los videos e indique la ubicación con la configuración requerida.
9. Seleccione Adquisición e Iniciar prueba (consulte la Figura 2b,c). Exportar todos los datos como archivos de Excel (consulte la Figura 2d).
   NOTA: Realice todos los cálculos para los períodos de habituación y prueba. La evaluación de tareas métricas se prepara con una plantilla avanzada.

Resultados

La importancia de las comparaciones entre los grupos se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney. La significación estadística de los resultados se consideró en P < 0,05, mientras que la relevancia estadísticamente alta se midió en P < 0,01.

Los resultados no mostraron diferencias en el SEN entre todos los grupos antes de la intervención y 28 días después de la LCT. Cada grupo consistía en 12 hembras o 12 ratas macho. Las puntuaciones NSS obtenidas 48 h después de TBI se present...

Discusión

Al dirigirse específicamente al proceso de información espacial métrica, esta prueba métrica proporciona una herramienta necesaria para comprender la deficiencia de memoria después de una LCT. El protocolo presentado en este trabajo es una modificación de las tareas conductuales descritas anteriormente¹¹. Una tarea métrica descrita anteriormente utilizó dos paradigmas diferentes, cada uno de los que consta de tres sesiones de habituación y una sesión de prueba. El primer paradigma consis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)			This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft