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요약

외상성 뇌 손상 (TBI) 일반적으로 메모리 손상과 관련 된. 여기서는 메트릭 작업을 통해 TBI 후 공간 작업 메모리를 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 메트릭 테스트는 TBI 후 공간 작업 메모리 장애를 연구하는 유용한 도구입니다.

초록

감각에 장애, 단기, 그리고 장기 메모리 외상성 뇌 손상 후 일반적인 부작용 (TBI). 인간 연구의 윤리적 한계로 인해 동물 모델은 치료 방법을 테스트하고 조건의 메커니즘 및 관련 합병증을 연구하기 위해 적절한 대안을 제공합니다. 실험설치류 모델은 접근성, 저렴한 비용, 재현성 및 검증된 접근 법으로 인해 역사적으로 가장 널리 사용되었습니다. 서로 다양한 거리와 각도에서 두 오브젝트의 배치를 기억하는 기능을 테스트하는 메트릭 테스트는 TBI 후 공간 작업 메모리(SWM)에서 손상을 연구하는 기술입니다. 메트릭 작업의 중요한 장점은 동적 관찰, 저비용, 재현성, 상대적 구현 용이성 및 낮은 응력 환경의 가능성을 포함합니다. 여기서는 TBI 후 성인 쥐에서 SWM의 손상을 측정하는 메트릭 테스트 프로토콜을 제시합니다. 이 시험은 뇌 기능의 생리학 및 병리 생리학을 보다 효과적으로 평가하는 실행 가능한 방법을 제공합니다.

서문

중등도 외상성 뇌손상(TBI) 후주의, 집행기능, 특정 기억력 결핍 등의 신경학적 결핍의 유병률은 50%이상1,2,3,4,5,6,7,8이다. TBI는 공간 단기, 장기 및 작업 메모리9에심각한 손상을 초래할 수 있습니다. 이러한 메모리 장애TBI의 설치류 모델에서 관찰 되었습니다. 설치류 모델은 메모리를 테스트하는 기술의 개발을 가능하게하여 TBI가 신경 메모리 시스템의 메모리 처리에 미치는 영향에 대한 심층적인 검사를 가능하게 했습니다.

각각 토폴로지 및 메트릭 공간 정보 처리와 관련된 두 가지 테스트는 공간 작업 메모리(SWM)를 측정하는 데 도움이 됩니다. 토폴로지 테스트는 개체 주변의 환경 공간 또는 관련 연결 공간 또는 인클로저의 크기를 변경하는 데 따라 달라지며 메트릭 테스트는 개체10,11사이의 각도 또는 거리의 변화를 평가합니다. 굿리치-헌사커 등은 먼저 쥐에 대한 인간 토폴로지 시험을적용하여 공간 정보처리(11)에서정수리 피질(PC) 및 등쪽 해마의 역할을 해리하기 위해 메트릭 작업을 적용하였다. 마찬가지로 Gurkoff와 동료들은 측면 유체 타악기 손상9후 메트릭, 위상 및 측두구 주문 메모리 작업을 평가했습니다. 뇌의 특정 영역에 손상과 메트릭 또는 토폴로지 메모리의 손상 사이에 상관 관계가 있습니다. 미터법 기억 장애는 해마의 양측 등쪽 성 축균 및 코르누 암모니(CA) 하위 영역 CA3의 병변과 관련이 있으며, 토폴로지 메모리 장애는 양측 정수리 피질병변(10,12)과관련이 있음을 시사하였다.

이 프로토콜의 목적은 메트릭 작업을 통해 쥐 집단의 공간 메모리 적자를 평가하는 것입니다. 이 방법은 뇌 손상 후 SWM의 메커니즘을 조사하기에 적합한 대안이며, 그 장점은 구현의 상대적 용이성, 높은 감도, 재현성의 낮은 비용, 동적 관찰의 가능성 및 낮은 스트레스 환경을 포함한다. 반즈미로(13,14)및 모리스 수중 항법작업(15,16,17)또는 공간 미로작업(18,19)과같은 다른 행동 작업에 비해, 이 메트릭 테스트는 덜 복잡하다. 구현의 용이성으로 인해 메트릭 테스트는 짧고 스트레스가 적은 훈련 기간이 필요하며 2 일9: 1 일 동안 습관과 1 일 동안 만 수행됩니다. 더욱이, 제안된 시험은 참신한 객체 인식(NOR) 작업과 같은 다른 저스트레스 테스트보다 수행하기 쉬우며, 습관의 여분의 날이 필요하지않다(20).

이 논문은 뇌 손상 후 SWM을 평가하기위한 간단한 모델을 제공합니다. TBI SWM 이후의 이 평가는 병리생리학에 대한 보다 포괄적인 조사를 지원할 수 있습니다.

프로토콜

이 실험은 헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험 동물 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 네게브의 벤 구리온 대학의 동물 관리 위원회에 의해 승인되었다. 프로토콜 타임라인은 그림 1에설명되어 있습니다.

1. 외과 적 절차 및 유체 타악기 TBI

  1. 1 ±2-1°C의 실온에 수용된 남성과 여성 성인 Sprague-Dawley 쥐를 선택하고 습도는 40%-60%이며 12-12h의 밝은 어두운 주기를 선택합니다.
  2. 차우와 물 광고 리비툼으로음식을 제공합니다. 아침 시간, 즉, 6:00 a.m 및 12:00 p.m 사이에 실험을 수행합니다.
  3. 실험 시작 전에 대조군과 TBI 그룹에 대한 기준선 신경 평가를 수행합니다(아래 섹션 2 참조).
  4. 흡입된 4% 이소플루란으로 쥐를 마취를 위한 1.5%를 마취를 마취합니다. 자극제에 대한 응답으로 페달 반사 또는 움직임을 테스트하여 쥐가 고정되었는지 확인합니다.
    참고: 마취를 위해 연속 이소플루란 관리 시스템을 사용합니다. 무균 조건에서 모든 절차를 수행합니다.
  5. 이전에 설명된 바와 같이 기생유체 타악기 손상을수행21,22.
  6. 절개 전에 장래 절개 부위를 따라 0.5%의 0.2mL를 피하한다. 쥐를 회복실로 달려가 신경학적(예를 들어 마비), 호흡기(예를 들어, 호흡정지) 및 심혈관 상태(예를 들어 연조직 관류감소, 동공의 색 변화 및 서맥)을 24시간 동안 계속 모니터링한다. 마취에서 출현하기 전에 수술 후 진통제로 0.01 - 0.05 mg / kg 근육 부프레노르핀을 투여하십시오. 적어도 48 h에 대 한 매 6 -12 시간 반복 복용량.

2. 신경학상 심각도 점수 평가(NSS)

참고: 이전에 설명된 바와 같이, 신경적자 평가는 NSS를 사용하여 수행되고 등급이 매겨졌으며,23,24. 모터 기능 및 동작의 최대 변경 점수는 24점입니다. 점수 0은 손상되지 않은 신경 상태를 나타내고 24는 이전에 설명된24와같이 심각한 신경 기능 장애를 나타낸다.

  1. 쥐가 중앙에 배치할 때 원(직경 50cm)을 두지 못하는 것을 테스트합니다. 각 세션은 각각 30분, 60분, 60분 이상 이 작업을 세 번 수행합니다.
    참고: 꼬리에 쥐를 집어 들고 꼬리의 베이스를 잡으세요.
  2. 오른쪽 반사의 손실에 대한 쥐를 테스트합니다.
    1. 동물을 뒤쪽의 손바닥에 놓습니다. 동물이 스스로25 (네 발에 서)를 바로 할 수있는 경우 1 의 점수를 제공합니다.
  3. 쥐가 강제 포지셔닝에 저항할 수 없는 헤미플레지아에 대해 테스트합니다.
  4. 꼬리에 쥐를 올려 뒷다리의 반사 굴곡을 테스트합니다.
  5. 똑바로 걷는 능력을 테스트하기 위해 바닥에 쥐를 놓습니다.
  6. 피나 반사, 각막 반사 및 깜짝 리플렉스의 세 가지 반사 적 행동에 대한 테스트를 수행합니다.
    1. 피나 반사의 경우, 이전에 설명된25와같이 귀 후퇴를 테스트하기 위해 가벼운 촉각 자극을 수행한다.
    2. 각막 반사를 테스트하려면, 눈에 부드러운 스틱을 가볍게 적용할 때 깜박임 반응을 모니터링하고 이전에설명한바와 같이 3배(응답 없음)에 0(응답 없음)을 측정한다.
    3. 깜짝 리플렉스의 경우, 이전에설명된바와 같이, 와이어 케이지의 상단에 펜을 드래그하고 0(응답 없음)에서 3(1cm 점프 이상)으로 스케일로 응답을 기록한다.
  7. 추구 행동과 prostration의 손실에 따라 쥐를 등급 (자신의 수염을 이동하지, 스니핑, 또는 새로운 환경으로 전송 된 후 실행)24.
  8. 왼쪽과 오른쪽 앞다리의 배치를 위한 사지 반사 신경을 테스트한 다음 왼쪽과 오른쪽 뒷다리.
  9. 폭 이 1.5cm빔으로 빔 밸런싱 작업을 통해 기능을 분석합니다. 20초, 40초, 60초 이상 지속되는 세션에 대한 테스트를 수행합니다.
  10. 폭 8.5cm, 너비 5cm, 너비 2.5cm의 세 가지 빔으로 빔 보행 테스트를 실행합니다.

3. 메트릭 작업 준비

  1. 설비
    1. 검은 원형 플랫폼의 직경 200cm, 테이블에 두께 1cm를 놓습니다. 테이블의 높이는 바닥 위 80cm여야 합니다.
    2. 서로 떨어져 있는 원형 플랫폼 의 중앙에 두 개의 서로 다른 객체를 설정합니다.
      참고:이 실험에서는 물체에 유리 병 2개, 높이 13.5cm의 둥근 병 1개, 높이가 20cm인 다른 면병이 사용되었습니다. 안정성을 보장하기 위해 병을 물로 채웁니다.
    3. 카메라를 준비하고 데이터를 캡처, 저장 및 처리하기 위해 필요한 컴퓨터 소프트웨어를 설치합니다. 바닥에서 290cm높이에 카메라를 설치합니다.
      참고: 플랫폼과 카메라 사이의 거리는 카메라 사양에 따라 다릅니다. 카메라 프레임은 테스트가 수행되는 경기장의 전체 영역을 커버해야 합니다. 플랫폼과 카메라 사이의 실험 거리는 210cm였습니다.
  2. 습관화
    1. 작업 전날, 비디오 녹화없이 경기장에 배치하여 10 분 동안 새로운 환경에 쥐를 습관화.
      참고: 같은 날 신경학적 작업및 메트릭 작업을 수행하지 마십시오.
      참고: 적색 광 영역에서 메트릭 테스트를 수행합니다.

4. 메트릭 작업 수행

참고: 메트릭 작업을 수행하는 것은 1) 습관화(15분) 및 2) 테스트(5분) 기간의 두 기간으로 구성됩니다.

  1. 습관기간
    1. 서로 떨어져 있는 원형 플랫폼의 중앙에 두 개의 서로 다른 객체를 설정합니다.
    2. 플랫폼 끝에 15분 동안 오브젝트와 동등한 곳에 쥐를 놓고 비디오를 녹화합니다.
    3. 플랫폼에서 쥐를 제거하고 5 분 동안 개별 케이지에 배치합니다.
    4. 5%-10% 알코올로 플랫폼을 청소하십시오.
      참고: 통풍이 잘 되는 지역에서 최대 70%의 알코올이 플랫폼을 청소하는 데 사용될 수 있습니다.
  2. 테스트 기간
    1. 오브젝트 사이의 거리를 34cm로 줄입니다.
    2. 5 분 동안 플랫폼에 쥐를 배치하고 비디오에 쥐의 탐사 활동을 기록합니다.
    3. 5%-10% 알코올로 플랫폼을 청소하십시오.

5. 데이터 분석

참고: 데이터 분석은 동물 활동과 움직임을 자동으로 기록하는 동물 행동 연구를 위해 특별히 설계된 비디오 추적 소프트웨어에 의해 수행됩니다(재료 표참조). 이 소프트웨어는 이동성, 활동 및 탐색 동작을 비롯한 다양한 동작 변수를 자동화합니다.

  1. 비디오 파일을 분석하기 전에 소프트웨어 하드웨어 키를 삽입합니다. 비디오 추적 소프트웨어를 시작하고 사전 설정 템플릿을 엽니다.
  2. 설치 섹션에서 는 다음과 같이 설정을 확인합니다: 투기장, 평가판 제어및 설정 감지(그림 2a참조) .
    참고: 이 실험의 경우 탐색 영역에 대한 매개 변수는 관심 대상 주위의 6cm로 정의됩니다. 쥐가 이 부위에 들어간 시간을 측정했습니다.
  3. 설정을 확인한 후 복제하여 이름을 바꿉니다.
  4. 프로그램의 일반 화면에서 마우스를 마우스오른쪽으로 클릭하여 배경을 잡아버라.
  5. 배경 이미지에 대한 비디오 파일을 선택합니다. 찾아보기 메뉴에서 비디오 파일의 위치를 선택합니다.
  6. 이미지를 캡처하고 조사된 영역과 영역을 표시하여 분석을 위해 이미지를 보정합니다. 평가판 제어 및 검색 설정에 대해 동일한 단계를 수행합니다.
  7. 일반 메뉴에서 평가판 목록을 선택하고 분석을 위해 비디오 파일 목록을 다운로드합니다.
  8. 동영상을 추가하고 필요한 설정으로 위치를 나타냅니다.
  9. 획득 및 평가판 시작 선택(그림 2b,c 참조). 모든 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다(그림 2d참조).
    참고: 습관 및 테스트 기간에 대한 모든 계산을 수행합니다. 메트릭 작업 평가는 고급 템플릿으로 준비됩니다.

결과

그룹 간의 비교의 중요성은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 결과의 통계적 유의성은 P < 0.05에서 고려되었다, 통계적으로 높은 관련성은 P < 0.01에서 측정되었다.

결과는 내정간섭 의 앞에 모든 단 과 TBI 후에 28 일 사이 NSS에 있는 다름을 보여주지 않았습니다. 각 그룹은 12명의 암컷 또는 12개의 수컷 쥐로 구성되었습니다. TBI가 표 1에제시된 후 48h를 ?...

토론

메트릭 공간 정보 프로세스를 구체적으로 타겟팅하여 이 메트릭 테스트는 TBI 후 메모리 결핍을 이해하는 데 필요한 도구를 제공합니다. 이 백서에 제시된 프로토콜은 이전에 설명된 동작작업(11)을수정한 것입니다. 이전에 설명한 메트릭 작업 중 하나는 각각 세 개의 습관 세션과 하나의 테스트 세션으로 구성된 두 개의 서로 다른 패러다임을 사용했습니다. 첫 번째 패러다임은 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

올레나 세브리노프스카 교수에게 감사드립니다. 메리나 쿠체리아바 M.Sc; 막심 크리보노소프 M.Sc; 다리나 야쿠멘코 M.Sc; 예브게니아 곤카리크 M.Sc; 그리고 올하 샤포발, 생리학과박사 후보, 생물학 학부, 생태학 및 의학, 올레스 혼차 드니프로 대학, 드니프로, 우크라이나의 지지와 유용한 공헌. 데이터는 드미트리 프랭크박사 논문의 일환으로 입수되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solutionSIGMA - ALDRICH500 ccFor general antisepsis of the skin in the operatory field
 Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture4-00
BottlesTechniplastACBT0262SU150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasksFor objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameterGlass Hole Saw KitOptional. 
Digital Weighing ScaleSIGMA - ALDRICHRs 4,000
Dissecting scissorsSIGMA - ALDRICHZ265969
Ethanol 99.9 % Pharmacy5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)Noldus, Wageningen, NetherlandsOptional
Fluid-percussion devicecustom-made at the university workshop   No specific brand is recommended.
Gauze SpongesFisher22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)Optional.
Heater with thermometerHeatingpad-1Model: HEATINGPAD-1/2   No specific brand is recommended.
Horizon-XLMennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlusMicrosoft-Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscopeOlympus
Operating  forcepsSIGMA - ALDRICH
Operating  ScissorsSIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analysesIntelIntel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passageTwo transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina ChowPurina5001Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)Techniplast2000PNo specific brand is recommended
Scalpel blades 11SIGMA - ALDRICHS2771
SPSSSPSS Inc., Chicago, IL, USA 20 package
Stereotaxic Instrumentcustom-made at the university workshop   No specific brand is recommended
Timing deviceInterval Timer:Timing for recording USV'sOptional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks deviceSelf made in Ben Gurion University of NegevWhite circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video cameraLogitechC920 HD PRO WEBCAMDigital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10Microsoft

참고문헌

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