Ein metrischer Test zur Beurteilung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses bei erwachsenen Ratten nach traumatischer Hirnverletzung

Zusammenfassung

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind häufig mit Gedächtnisstörungen verbunden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Bewertung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses nach TBI über eine metrische Aufgabe vor. Ein Metriktest ist ein nützliches Werkzeug, um räumliche Arbeitsgedächtnisstörungen nach TBI zu untersuchen.

Zusammenfassung

Beeinträchtigungen des sensorischen, Kurzzeit- und Langzeitgedächtnisses sind häufige Nebenwirkungen nach traumatischen Hirnverletzungen (TBI). Aufgrund der ethischen Einschränkungen von Humanstudien bieten Tiermodelle geeignete Alternativen, um Behandlungsmethoden zu testen und die Mechanismen und damit verbundenen Komplikationen der Erkrankung zu untersuchen. Experimentelle Nagetiermodelle waren in der Vergangenheit aufgrund ihrer Zugänglichkeit, niedrigen Kosten, Reproduzierbarkeit und validierten Ansätze am weitesten verbreitet. Ein metrischer Test, der die Fähigkeit testet, sich an die Platzierung von zwei Objekten in verschiedenen Abständen und Winkeln voneinander zu erinnern, ist eine Technik, um Beeinträchtigungen im räumlichen Arbeitsgedächtnis (SWM) nach TBI zu untersuchen. Zu den wesentlichen Vorteilen metrischer Aufgaben gehören die Möglichkeit der dynamischen Beobachtung, niedrige Kosten, Reproduzierbarkeit, relative Einfache Implementierung und eine umgebung mit geringer Belastung. Hier stellen wir ein metrisches Testprotokoll zur Messung der Beeinträchtigung von SWM bei erwachsenen Ratten nach TBI vor. Dieser Test bietet eine praktikable Möglichkeit, die Physiologie und Pathophysiologie der Gehirnfunktion effektiver zu bewerten.

Einleitung

Die Prävalenz neurologischer Defizite wie Aufmerksamkeit, exekutive Funktion und bestimmte Gedächtnisdefizite nach mittelschwerer traumatischer Hirnverletzung (TBI) beträgt mehr als 50 Prozent^{1,2,3,4,5,6,7,8}. TBI kann zu schweren Beeinträchtigungen des räumlichen Kurzzeit-, Langzeit- und Arbeitsgedächtnisses führen⁹. Diese Gedächtnisstörungen wurden in Nagetiermodellen von TBI beobachtet. Nagetiermodelle haben die Entwicklung von Techniken zum Testen des Gedächtnisses ermöglicht, was tiefere Untersuchungen der Wirkung von TBI auf die Gedächtnisverarbeitung in neuronalen Gedächtnissystemen ermöglicht.

Zwei Tests, die sich auf die topologische bzw. metrische räumliche Informationsverarbeitung beziehen, helfen bei der Messung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses (SWM). Der topologische Test hängt von der Änderung der Größe des Umgebungsraums oder verwandter Verbindungs- oder Umschließungsräume um ein Objekt ab, während der metrische Test Änderungen der Winkel oder des Abstands zwischen Objekten^10,11bewertet. Goodrich-Hunsaker et al. adaptierten zunächst den humanen topologischen Test für Ratten¹⁰ und wandten die metrische Aufgabe an, um die Rollen des parietalen Kortex (PC) und des dorsalen Hippocampus in der räumlichen Informationsverarbeitung zu dissoziieren¹¹. In ähnlicher Weise bewerteten Gurkoff und Kollegen metrische, topologische und zeitliche Ordnungsgedächtnisaufgaben nach einer Verletzung der lateralen Flüssigkeitsperkussion⁹. Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Schädigung bestimmter Regionen des Gehirns und der Beeinträchtigung des metrischen oder topologischen Gedächtnisses. Es wurde vermutet, dass eine metrische Gedächtnisstörung mit Läsionen im bilateralen gyrus dorsalis dentatus und der Cornu ammonis (CA) -Subregion CA3 des Hippocampus zusammenhängt und dass die topologische Gedächtnisstörung mit bilateralen parietalen Kortexläsionen zusammenhängt^10,12.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, das räumliche Gedächtnisdefizit in einer Rattenpopulation über eine metrische Aufgabe zu bewerten. Diese Methode ist eine geeignete Alternative, um Mechanismen von SWM nach Hirnverletzungen zu untersuchen, und ihre Vorteile umfassen die relative Leichtigkeit der Implementierung, hohe Empfindlichkeit, niedrige Reproduzierbarkeitskosten, die Möglichkeit der dynamischen Beobachtung und eine umgebungsarm. Im Vergleich zu anderen Verhaltensaufgaben wie dem Barnes-Labyrinth^13,14, Morris-Wassernavigationsaufgabe^15,16,17oder den räumlichen Labyrinthaufgaben^18,19ist dieser Metriktest weniger kompliziert. Aufgrund seiner einfachen Implementierung erfordert der Metriktest eine kürzere und weniger stressige Trainingszeit und findet über nur 2 Tage⁹: 1 Tag für die Gewöhnung und 1 Tag für die Aufgabe statt. Darüber hinaus ist unser vorgeschlagener Test einfacher durchzuführen als andere Tests mit geringer Belastung, wie z. B. die Aufgabe der neuartigen Objekterkennung (NOR), und erfordert keinen zusätzlichen Tag der Gewöhnung²⁰.

Dieses Papier bietet ein einfaches Modell zur Bewertung von SWM nach Hirnverletzungen. Diese Bewertung von Post-TBI-SWM kann zu einer umfassenderen Untersuchung seiner Pathophysiologie beitragen.

Protokoll

Die Versuche wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärungen von Helsinki und Tokio und den Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden vom Animal Care Committee der Ben-Gurion-Universität des Negev genehmigt. Eine Protokollzeitleiste ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Chirurgische Eingriffe und Fluid Percussion TBI

1. Wählen Sie männliche und weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten, die bei einer Raumtemperatur von 22 ± 1 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 40% -60% mit 12-12 h Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht sind.
2. Stellen Sie Nahrung als Chow und Wasser ad libitum zurVerfügung. Führen Sie Experimente zwischen den Morgenstunden durch, d.h. 6:00 Uhr.m und 12:00 Uhr.m.
3. Führen Sie vor Beginn des Experiments eine neurologische Ausgangsbewertung sowohl für die Kontroll- als auch für die TBI-Gruppe durch (siehe Abschnitt 2 unten).
4. Betäuben Sie die Ratten mit eingeatmeten 4% Isofluran zur Induktion und 1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Stellen Sie sicher, dass die Ratte immobilisiert wird, indem Sie den Pedalreflex oder die Bewegung als Reaktion auf ein Reizmittel testen.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem für die Anästhesie. Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen durch.
5. Führen Sie parasagittale Flüssigkeits-Percussion-Verletzungen wie zuvor beschrieben^{21,22 durch.}
6. Subkutan injiziert 0,2 ml 0,5% Bupivacain entlang der prospektiven Inzisionsstelle vor dem Schnitt. Ransfer die Ratte in den Aufwachraum und überwacht weiterhin den neurologischen (z. B. Lähmung), Atemwegszustand (z. B. Atemstillstand) und kardiovaskulären Zustand (z. B. Abnahme der Weichteilperfusion, Veränderungen der Pupillenfarbe und Bradykardie) für 24 h. Vor dem Auftreten aus der Anästhesie 0,01 - 0,05 mg/kg intramuskuläres Buprenorphin als postoperative Analgesie verabreichen. Wiederholen Sie die Dosen alle 6 - 12 h für mindestens 48 h.

2. Bewertung des Neurologischen Schweregrad-Scores (NSS)

HINWEIS: Die Beurteilung des neurologischen Defizits wurde mit einem NSS durchgeführt und abgestuft, wie zuvor beschrieben^23,24. Die maximale Punktzahl der Veränderung der motorischen Funktion und des Verhaltens beträgt 24 Punkte. Ein Score von 0 zeigt einen intakten neurologischen Status an und 24 zeigt eine schwere neurologische Dysfunktion an, wie zuvor beschrieben²⁴.

1. Testen Sie die Unfähigkeit der Ratte, einen Kreis (50 cm Durchmesser) zu verlassen, wenn sie in der Mitte platziert wird. Führen Sie diese Aufgabe dreimal aus, wobei jede Sitzung jeweils 30 Minuten, 60 Minuten und mehr als 60 Minuten dauert.
   HINWEIS: Wenn Sie Ratten am Schwanz aufnehmen, halten Sie die Basis des Schwanzes.
2. Testen Sie die Ratte auf einen Verlust des Aufrußeflexes.
   1. Legen Sie das Tier auf den Rücken in die Handfläche des Forschers. Geben Sie eine Punktzahl von 1 an, wenn das Tier in der Lage ist, sich^{selbst 25} zu rechtzugeben (auf allen vier Pfoten stehend).
3. Testen Sie die Ratte auf Hemiplegie, die Unfähigkeit der Ratte, einer erzwungenen Positionierung zu widerstehen.
4. Heben Sie die Ratte an ihrem Schwanz an, um die reflexive Biegung der Hinterbeine zu testen.
5. Legen Sie die Ratte auf den Boden, um ihre Fähigkeit zu testen, gerade zu gehen.
6. Führen Sie Tests für drei reflexive Verhaltensweisen durch: den Pinna-Reflex, den Hornhautreflex und den Schreckreflex.
   1. Führen Sie für den Pinna-Reflex eine leichte taktile Stimulation durch, um den Rückzug des Ohres zu testen, wie zuvor beschrieben²⁵.
   2. Um den Hornhautreflex zu testen, überwachen Sie die Blinkreaktion, wenn Sie einen weichen Stick leicht auf das Auge auftragen, und messen Sie auf einer Skala von 0 (keine Reaktion) auf dreifaches Augenblinzeln (3), wie zuvor beschrieben²⁵.
   3. Für den Schreckreflex ziehen Sie einen Stift über die Oberseite des Drahtkäfigs und zeichnen die Reaktion mit einer Skala von 0 (keine Reaktion) bis 3 (1 cm Sprung oder mehr) auf, wie zuvor beschrieben²⁵.
7. Bewerten Sie die Ratte basierend auf dem Verlust des Suchverhaltens und der Prostration (nicht ihre Schnurrhaare bewegen, schnüffeln oder rennen, nachdem sie in eine neue Umgebung verlegt wurden)²⁴.
8. Testen Sie Gliedmaßenreflexe für die Platzierung auf den linken und rechten Vorderbeinen und dann die linken und rechten Hinterbeine.
9. Analysieren Sie die Funktionalität über die Strahlausgleichsaufgabe mit einem 1,5 cm breiten Strahl. Führen Sie den Test für Sitzungen durch, die 20 Sekunden, 40 Sekunden und mehr als 60 Sekunden dauern.
10. Führen Sie den Balkenlauftest mit drei verschiedenen Balken durch: 8,5 cm breit, 5 cm breit und 2,5 cm breit.

3. Vorbereitung auf die metrische Aufgabe

1. Ausrüstung
   1. Stellen Sie eine schwarze runde Plattform mit einem Durchmesser von 200 cm und einer Dicke von 1 cm auf einen Tisch. Die Höhe des Tisches sollte 80 cm über dem Boden liegen.
   2. Stellen Sie zwei verschiedene Objekte in der Mitte der kreisförmigen Plattform 68 cm voneinander entfernt auf.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden zwei Glasflaschen für Objekte verwendet, eine runde Flasche mit einer Höhe von 13,5 cm und eine weitere facettierte Flasche mit einer Höhe von 20 cm. Füllen Sie Flaschen mit Wasser, um die Stabilität zu gewährleisten.
   3. Bereiten Sie eine Kamera vor und installieren Sie die erforderliche Computersoftware zum Erfassen, Speichern und Verarbeiten von Daten. Installieren Sie die Kamera in einer Höhe von 290 cm vom Boden.
      HINWEIS: Der Abstand zwischen Plattform und Kamera hängt von den Kameraspezifikationen ab. Der Kamerarahmen sollte den gesamten Bereich der Arena abdecken, in der der Test durchgeführt wird. Der Abstand für unser Experiment zwischen der Plattform und der Kamera betrug 210 cm.
2. Gewöhnung
   1. Gewöhnen Sie die Ratte am Tag vor der Aufgabe für 10 Minuten an die neue Umgebung, indem Sie sie ohne Videoaufzeichnung auf die Arena legen.
      HINWEIS: Führen Sie die neurologischen Aufgaben und die metrische Aufgabe nicht am selben Tag aus.
      HINWEIS: Führen Sie Metriktests in einem Rotlichtbereich durch.

4. Ausführen der Metrikaufgabe

HINWEIS: Die Durchführung der metrischen Aufgabe besteht aus zwei Perioden: 1) Gewöhnung (15 min) und 2) Testperiode (5 min).

1. Gewöhnungszeit
   1. Stellen Sie zwei verschiedene Objekte in der Mitte der kreisförmigen Plattform 68 cm voneinander entfernt auf.
   2. Platzieren Sie die Ratte für einen Zeitraum von 15 Minuten am Ende der Plattform, die gleich weit von den Objekten entfernt ist, und nehmen Sie das Video auf.
   3. Entfernen Sie die Ratte von der Plattform und legen Sie sie für 5 Minuten in einen einzelnen Käfig.
   4. Reinigen Sie die Plattform mit 5%-10% Alkohol.
      HINWEIS: Bis zu 70% Alkohol kann verwendet werden, um die Plattform in gut belüfteten Bereichen zu reinigen.
2. Testzeitraum
   1. Reduzieren Sie den Abstand zwischen Objekten auf 34 cm.
   2. Platzieren Sie die Ratte für 5 Minuten auf der Plattform und zeichnen Sie die Explorationsaktivitäten der Ratte auf Video auf.
   3. Reinigen Sie die Plattform mit 5%-10% Alkohol.

5. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse wird von einer Video-Tracking-Software durchgeführt, die speziell für Tierverhaltensstudien entwickelt wurde und automatisch die Aktivität und Bewegung von Tieren aufzeichnet (siehe Materialtabelle). Diese Software automatisiert eine Reihe von Verhaltensvariablen, einschließlich Mobilität, Aktivität und explorativem Verhalten.

1. Legen Sie vor der Analyse der Videodateien den Softwarehardwareschlüssel ein. Starten Sie die Video-Tracking-Software und öffnen Sie die voreingestellte Vorlage.
2. Überprüfen Sie im Abschnitt Setup die Einstellungen wie folgt: Arena, Teststeuerungund Erkennungseinstellungen (siehe Abbildung 2a).
   HINWEIS: Für dieses Experiment werden die Parameter für das Explorationsgebiet als 6 cm um das objekt herum definiert. Die Zeit, in der die Ratte in dieses Gebiet eintrat, wurde gemessen.
3. Nachdem Sie die Einstellungen überprüft haben, duplizieren und benennen Sie sie um.
4. Auf dem allgemeinen Bildschirm des Programms greifen Sie Hintergrund, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken.
5. Wählen Sie eine Videodatei für das Hintergrundbild aus. Wählen Sie im Menü Durchsuchen den Speicherort der Videodatei aus.
6. Erfassen Sie das Bild und markieren Sie die untersuchten Bereiche und Zonen, um das Bild für die Analyse zu kalibrieren. Führen Sie die gleichen Schritte für Teststeuerung und Erkennungseinstellungen aus.
7. Wählen Sie im menü allgemein die Option Testliste aus und laden Sie die Liste der Videodateien zur Analyse herunter.
8. Fügen Sie die Videos hinzu und geben Sie den Standort mit den erforderlichen Einstellungen an.
9. Wählen Sie Die Erfassung und starten Sie die Testversion (siehe Abbildung 2b, c). Exportieren Sie alle Daten als Excel-Dateien (siehe Abbildung 2d).
   HINWEIS: Führen Sie alle Berechnungen für die Gewöhnungs- und Testperioden durch. Die Bewertung von Metrikaufgaben wird mit einer erweiterten Vorlage vorbereitet.

Ergebnisse

Die Signifikanz von Vergleichen zwischen Gruppen wurde mit dem Mann-Whitney-Test bestimmt. Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde bei P < 0,05 betrachtet, während die statistisch hohe Relevanz bei P < 0,01 gemessen wurde.

Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in der NSS zwischen allen Gruppen vor der Intervention und 28 Tage nach TBI. Jede Gruppe bestand aus 12 weiblichen oder 12 männlichen Ratten. Die NSS-Werte, die 48 h nach dem TBI erhalten wurden, sind in Tabelle 1...

Diskussion

Durch die gezielte Ausrichtung auf den metrischen räumlichen Informationsprozess bietet dieser Metriktest ein notwendiges Werkzeug zum Verständnis von Gedächtnismangel nach TBI. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verhaltensaufgaben¹¹. Eine zuvor beschriebene metrische Aufgabe verwendete zwei verschiedene Paradigmen, die jeweils aus drei Gewöhnungssitzungen und einer Testsitzung bestehen. Das erste Paradigma bestand darin, die vertrauten O...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)			This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft