Um teste métrico para avaliar a memória espacial de trabalho em ratos adultos após lesão cerebral traumática

Resumo

Lesão cerebral traumática (TCE) é comumente associada com prejuízo de memória. Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a memória de trabalho espacial após o TBI através de uma tarefa métrica. Um teste métrico é uma ferramenta útil para estudar o prejuízo de memória de trabalho espacial após o TBI.

Resumo

Prejuízos à memória sensorial, de curto e longo prazo são efeitos colaterais comuns após lesão cerebral traumática (TCE). Devido às limitações éticas dos estudos humanos, os modelos animais fornecem alternativas adequadas para testar métodos de tratamento e estudar os mecanismos e complicações relacionadas da condição. Modelos experimentais de roedores têm sido historicamente os mais utilizados devido à sua acessibilidade, baixo custo, reprodutibilidade e abordagens validadas. Um teste métrico, que testa a capacidade de recordar a colocação de dois objetos a várias distâncias e ângulos um do outro, é uma técnica para estudar o comprometimento na memória de trabalho espacial (SWM) após o TBI. As vantagens significativas das tarefas métricas incluem a possibilidade de observação dinâmica, baixo custo, reprodutibilidade, relativa facilidade de implementação e ambiente de baixo estresse. Aqui, apresentamos um protocolo de teste métrico para medir o comprometimento do SWM em ratos adultos após a TBI. Este teste fornece uma maneira viável de avaliar a fisiologia e a fisiopatologia da função cerebral de forma mais eficaz.

Introdução

A prevalência de déficits neurológicos como atenção, função executiva e certos déficits de memória após lesão cerebral traumática moderada (TCE) é superior a 50%^{1,2,3,4,5,6,7,8}. O TCE pode levar a graves prejuízos na memória espacial de curto prazo, de longo prazo e de trabalho⁹. Estes prejuízos de memória têm sido observados em modelos de roedores de TCE. Os modelos de roedores permitiram o desenvolvimento de técnicas para testar a memória, permitindo exames mais profundos sobre o efeito do TBI no processamento da memória em sistemas de memória neural.

Dois testes, relacionados ao processamento de informações espaciais topológicas e métricas, respectivamente, auxiliam na medição da memória de trabalho espacial (SWM). O teste topológico depende da alteração do tamanho do espaço ambiental ou dos espaços relacionados de conexão ou gabinete ao redor de um objeto, enquanto o teste métrico avalia alterações nos ângulos ou distância entre os objetos^10,11. Goodrich-Hunsaker et al. adaptaram pela primeira vez o teste topológico humano para ratos¹⁰ e aplicaram a tarefa métrica para dissociar os papéis do córtex parietal (PC) e do hipocampo dorsal no processamento de informações espaciais¹¹. Da mesma forma, Gurkoff e colegas avaliaram tarefas de memória métrica, topológica e temporal após lesão de percussão de fluido lateral⁹. Há uma correlação entre danos a determinadas regiões do cérebro e comprometimento da memória métrica ou topológica. Tem sido sugerido que o prejuízo de memória métrica está relacionado a lesões em giros dentados dorsais bilaterais e amonose de cornu (CA) sub-região CA3 do hipocampo, e que o prejuízo de memória topológica está relacionado às lesões parietal corxais bilaterais^10,12.

O objetivo deste protocolo é avaliar o déficit de memória espacial em uma população de ratos através de uma tarefa métrica. Este método é uma alternativa adequada para investigar mecanismos de SWM após lesão cerebral, e suas vantagens incluem a relativa facilidade de implementação, alta sensibilidade, baixo custo de reprodutibilidade, possibilidade de observação dinâmica e um ambiente de baixo estresse. Comparado com outras tarefas comportamentais como o labirinto Barnes^13,14, Morris tarefa de navegação aquática^15,16,17, ou tarefas de labirinto espacial^18,19, este teste métrico é menos complicado. Devido à sua facilidade de implementação, o teste métrico requer um período de treinamento mais curto e menos estressante e ocorre durante apenas 2 dias⁹: 1 dia para habituação e 1 dia para a tarefa. Além disso, nosso teste proposto é mais fácil de realizar do que outros testes de baixo estresse, como a tarefa de reconhecimento de objetos novos (NOR), e não requer o dia extra de habitação²⁰.

Este artigo fornece um modelo simples para avaliar SWM após lesão cerebral. Essa avaliação do PÓS-TBI SWM pode auxiliar em uma investigação mais abrangente de sua fisiopatologia.

Protocolo

Os experimentos foram realizados seguindo as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev. Um cronograma de protocolo é ilustrado na Figura 1.

1. Procedimentos cirúrgicos e tbi de percussão de fluido

1. Selecione ratos adultos machos e femininos Sprague-Dawley, alojados a uma temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, e umidade de 40%-60%, com ciclos claro-escuros de 12-12 h.
2. Fornecer comida como chow e ad libitumde água. Realizar experimentos entre as horas da manhã, ou seja, 6:.m 00 e 12:00.m.
3. Realize uma avaliação neurológica de base para os grupos de controle e TCE antes do início do experimento (ver seção 2 abaixo).
4. Anestesiar os ratos com isoflurano inalado de 4% para indução e 1,5% para manutenção de anestesia. Certifique-se de que o rato está imobilizado testando reflexo do pedal ou movimento em resposta a um irritante.
   NOTA: Use um sistema contínuo de administração isoflurane para anestesia. Realizar todos os procedimentos em condições assépticas.
5. Realizar lesão de fluido parasagittal-percussão como descrito anteriormente^21,22.
6. Injete subcutâneamente 0,2 mL de bupivacaína de 0,5% ao longo do local prospectivo de incisão, antes da incisão. corrisfera o rato até a sala de recuperação e continue monitorando a neurológica (por exemplo, paralisia), respiratória (por exemplo, parada respiratória) e estado cardiovascular (por exemplo, diminuição da perfusão de tecido mole, alterações na cor das pupilas e bradicardia) por 24h. Antes do surgimento da anestesia, administre 0,01 - 0,05 mg/kg buprenorfina intramuscular como analgesia pós-operatória. Repita as doses a cada 6 - 12 h por pelo menos 48 h.

2. Avaliação do Escore de Gravidade Neurológica (SN)

NOTA: A avaliação do déficit neurológico foi realizada e classificada por meio de SNS, conforme descrito anteriormente^23,24. A pontuação máxima de alteração na função motora e no comportamento é de 24 pontos. Um escore de 0 indica um estado neurológico intacto e 24 indica disfunção neurológica grave, como descrito anteriormente²⁴.

1. Teste a incapacidade do rato de deixar um círculo (50 cm de diâmetro) quando colocado em seu centro. Realize esta tarefa três vezes, com cada sessão com duração de 30 min, 60 min e mais de 60 min cada.
   NOTA: Se pegar ratos pela cauda, segure a base da cauda.
2. Teste o rato para uma perda de reflexo de redocimento.
   1. Coloque o animal de costas na palma da mão do pesquisador. Dê uma pontuação de 1 se o animal for capaz de se acertar²⁵ (em pé nas quatro patas).
3. Teste o rato para hemiplegia, a incapacidade do rato de resistir ao posicionamento forçado.
4. Levante o rato pela cauda para testar a dobra reflexiva da curva traseira.
5. Coloque o rato no chão para testar sua habilidade de andar em linha reta.
6. Realizar testes para três comportamentos reflexivos: o reflexo de pinna, o reflexo da córnea e o reflexo do assustar.
   1. Para o reflexo pinna, realize estimulação tátil leve para testar a retração do ouvido como descrito anteriormente²⁵.
   2. Para testar o reflexo da córnea, monitore a resposta piscando ao aplicar uma vara macia levemente ao olho e meça em uma escala de 0 (sem resposta) ao piscar de olhos triplo (3), como descrito anteriormente²⁵.
   3. Para o reflexo do logon, arraste uma caneta pela parte superior da gaiola de arame e grave a resposta com uma escala de 0 (sem resposta) a 3 (salto de 1 cm ou mais), como descrito anteriormente²⁵.
7. Classificar o rato com base na perda de comportamento de busca e prostração (não mover seus bigodes, cheirar ou correr após ser transferido para um novo ambiente)²⁴.
8. Teste os reflexos dos membros para a colocação nos membros dianteiros esquerdo e direito, e depois as flexs traseiras esquerda e direita.
9. Analise a funcionalidade através da tarefa de balanceamento do feixe com um feixe de 1,5 cm de largura. Realize o teste para sessões com duração de 20 segundos, 40 segundos e mais de 60 segundos.
10. Execute o teste de caminhada do feixe com três vigas diferentes: 8,5 cm de largura, 5 cm de largura e 2,5 cm de largura.

3. Preparando-se para a tarefa métrica

1. Equipamento
   1. Coloque uma plataforma circular preta de 200 cm de diâmetro e 1 cm de espessura sobre uma mesa. A altura da mesa deve estar 80 cm acima do chão.
   2. Estabeleça dois objetos diferentes no centro da plataforma circular a 68 cm um do outro.
      NOTA: Neste experimento, foram utilizadas duas garrafas de vidro para objetos, uma garrafa redonda com altura de 13,5 cm e outra garrafa facetada com altura de 20 cm. Encha garrafas com água para garantir estabilidade.
   3. Prepare uma câmera e instale o software de computador necessário para capturar, salvar e processar dados. Instale a câmera a uma altura de 290 cm do chão.
      NOTA: A distância entre a plataforma e a câmera depende das especificações da câmera. O quadro da câmera deve cobrir toda a área da arena em que o teste está sendo conduzido. A distância para nossa experiência entre a plataforma e a câmera foi de 210 cm.
2. Habituation
   1. No dia anterior à tarefa, habituar o rato ao novo ambiente por 10 minutos, colocando na arena sem gravação de vídeo.
      NOTA: Não execute as tarefas neurológicas e a tarefa métrica no mesmo dia.
      NOTA: Realize testes métricos em uma área de luz vermelha.

4. Executando a tarefa métrica

NOTA: A realização da tarefa métrica consiste em dois períodos: 1) habituação (15 min) e 2) período de teste (5 min).

1. Período de habitação
   1. Estabeleça dois objetos diferentes no centro da plataforma circular a 68 cm um do outro.
   2. Coloque o rato na extremidade da plataforma equidistante dos objetos por um período de 15 minutos, e grave o vídeo.
   3. Retire o rato da plataforma e coloque em uma gaiola individual por 5 minutos.
   4. Limpe a plataforma com 5%-10% de álcool.
      NOTA: Até 70% do álcool pode ser usado para limpar a plataforma em áreas bem ventiladas.
2. Período de teste
   1. Reduza a distância entre os objetos para 34 cm.
   2. Coloque o rato na plataforma por 5 minutos e grave a atividade de exploração do rato em vídeo.
   3. Limpe a plataforma com 5%-10% de álcool.

5. Análise de dados

NOTA: A análise de dados é realizada por software de rastreamento de vídeo especificamente projetado para estudos de comportamento animal que registra automaticamente a atividade e o movimento animal (ver Tabela de Materiais). Este software automatiza uma série de variáveis comportamentais, incluindo mobilidade, atividade e comportamento exploratório.

1. Antes de analisar os arquivos de vídeo, insira a chave de hardware do software. Inicie o software de rastreamento de vídeo e abra o modelo de predefinição.
2. Na seção Configuração, verifique as configurações da seguinte forma: Arena, Controle de Testee Configurações de Detecção (ver Figura 2a) .
   NOTA: Para este experimento, os parâmetros para a área de exploração são definidos como 6 cm em torno do objeto de interesse. O tempo em que o rato entrou nesta área foi medido.
3. Depois de verificar as configurações, copie-as e renomeie-as.
4. Na tela geral do programa, Pegue o Plano de Fundo clicando com o botão direito do mouse.
5. Selecione um arquivo de vídeo para a imagem de fundo. No menu Procurar, selecione a localização do arquivo de vídeo.
6. Capture a imagem e marque as áreas e zonas investigadas, calibrando a imagem para análise. Execute as mesmas etapas para configurações de controle de teste e detecção.
7. No menu geral, selecione Lista de Avaliação e baixe a lista de arquivos de vídeo para análise.
8. Adicione os vídeos e indique o local com as configurações necessárias.
9. Selecione aquisição e Teste inicial (ver Figura 2b,c). Exporte todos os dados como arquivos Excel (ver Figura 2d).
   NOTA: Realize todos os cálculos para os períodos de habitação e teste. A avaliação da tarefa métrica é preparada com um modelo avançado.

Resultados

A significância das comparações entre os grupos foi determinada por meio do teste De Mann-Whitney. A significância estatística dos resultados foi considerada em P < 0,05, enquanto a relevância estatisticamente alta foi medida em P < 0,01.

Os resultados não mostraram diferenças no INSS entre todos os grupos antes da intervenção e 28 dias após o TCE. Cada grupo era composto por 12 fêmeas ou 12 ratos machos. As pontuações do NSS obtiveram 48 h após a apresentação do TCE na

Discussão

Ao direcionar especificamente o processo de informações espaciais métricas, este teste métrico fornece uma ferramenta necessária para entender a deficiência de memória após o TBI. O protocolo apresentado neste artigo é uma modificação das tarefas comportamentais descritas anteriormente¹¹. Uma tarefa métrica descrita anteriormente utilizou dois paradigmas diferentes, cada um consistindo de três sessões de habituação e uma sessão de teste. O primeiro paradigma consistia em aproximar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)			This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft