מבחן מטרי להערכת זיכרון עבודה מרחבי בחולדות בוגרות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית

Summary

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) קשורה בדרך כלל עם פגיעה בזיכרון. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת זיכרון עבודה מרחבי לאחר TBI באמצעות משימה מטרית. מבחן מטרי הוא כלי שימושי לחקר ליקויים בזיכרון העבודה המרחבי לאחר TBI.

Abstract

ליקויים בזיכרון חושי, לטווח קצר ולטווח ארוך הם תופעות לוואי נפוצות לאחר פגיעה מוחית טראומטית (TBI). בשל המגבלות האתיות של מחקרים בבני אדם, מודלים מן החי מספקים חלופות מתאימות לבדיקת שיטות הטיפול, ולחקר המנגנונים והסיבוכים הקשורים למצב. מודלים של מכרסמים ניסיוניים היו בשימוש הנפוץ ביותר מבחינה היסטורית בשל הנגישות שלהם, עלות נמוכה, רבייה וגישות מאומתות. מבחן מטרי, הבוחן את היכולת להיזכר במיקום של שני אובייקטים במרחקים וזוויות שונות זה מזה, הוא טכניקה לחקר ליקויים בזיכרון העבודה המרחבי (SWM) לאחר TBI. היתרונות המשמעותיים של משימות מטריות כוללים אפשרות של התבוננות דינמית, עלות נמוכה, רבייה, קלות יישום יחסית וסביבת לחץ נמוכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקה מטרי למדידת ליקוי של SWM בחולדות מבוגרות לאחר TBI. בדיקה זו מספקת דרך ריאלית להעריך פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של תפקוד המוח בצורה יעילה יותר.

Introduction

השכיחות של ליקויים נוירולוגיים כגון קשב, תפקוד מבצעי, ליקויי זיכרון מסוימים לאחר פגיעה מוחית טראומטית מתונה (TBI) היא יותר מ 50 אחוז^{1,2,3,4,5,6,7,8}. TBI יכול להוביל לליקויים חמורים בזיכרון עבודה מרחבי לטווח קצר, ארוך טווח ועבודה⁹. ליקויי זיכרון אלה נצפו במודלים מכרסמים של TBI. מודלים מכרסמים אפשרו פיתוח של טכניקות לבדיקת זיכרון, המאפשר בדיקות עמוקות יותר לתוך ההשפעה של TBI על עיבוד זיכרון במערכות זיכרון עצבי.

שתי בדיקות, הקשורות לעיבוד מידע מרחבי טופולוגי ומדדי בהתאמה, מסייעות במדידת זיכרון עבודה מרחבי (SWM). הבדיקה הטופולוגית תלויה בשינוי גודל המרחב הסביבתי או מרחבי חיבור או מארז קשורים סביב אובייקט, בעוד המבחן המדדי מעריך שינויים בזוויות או במרחק בין אובייקטים^10,11. גודריץ'-הונסאקר ואח' התאימו תחילה את הבדיקה הטופולוגית האנושית לחולדות¹⁰ ויישמו את המשימה המטרית לניתוק התפקידים של קליפת המוח הקודקודית (PC) וההיפוקמפוס האל-קולי בעיבוד מידע מרחבי¹¹. באופן דומה, גורקוף ועמיתיו העריכו משימות זיכרון מטרי, טופולוגי וטמפורלי לאחר פגיעה בהקשה לרוחב נוזל⁹. יש קשר בין נזק לאזורים מסוימים במוח לבין פגיעה בזיכרון מטרי או טופולוגי. הוצע כי ליקוי זיכרון מטרי קשור נגעים בgyrus gyrus gyrus דו צדדית ו cornu ammonis (CA) תת אזור CA3 של ההיפוקמפוס, וכי פגיעה בזיכרון הטופולוגי קשור נגעים קליפת המוח הקודקודית הדו צדדית^10,12.

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך גירעון זיכרון מרחבי באוכלוסיית חולדה באמצעות משימה מטרית. שיטה זו מהווה חלופה מתאימה לחקור מנגנונים של SWM לאחר פגיעה מוחית, ויתרונותיה כוללים את קלות היישום היחסית, רגישות גבוהה, עלות נמוכה של רבייה, אפשרות לתצפית דינמית וסביבת לחץ נמוכה. בהשוואה למשימות התנהגותיות אחרות כגון מבוך בארנס^13,14, מוריס משימת ניווט במים^15,16,17, או משימות מבוך מרחבי^18,19, מבחן מטרי זה הוא פחות מסובך. בשל קלות היישום, המבחן המדדי דורש תקופת הכשרה קצרה ופחות מלחיצה ומתקיימת על פני יומיים^{בלבד 9}: יום אחד להרגלה ויום אחד למשימה. יתר על כן, הבדיקה המוצעת שלנו קלה יותר לביצוע מאשר מבחני לחץ נמוכים אחרים, כגון משימת זיהוי האובייקטים החדשים (NOR), ואינה דורשת יום נוסף של הרגלה²⁰.

מאמר זה מספק מודל פשוט להערכת SWM לאחר פגיעה מוחית. הערכה זו של לאחר TBI SWM עשויה לסייע בחקירה מקיפה יותר של הפתופיזיולוגיה שלה.

Protocol

הניסויים בוצעו בעקבות המלצות הצהרות הלסינקי וטוקיו וההנחיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים של הקהילה האירופית. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב. ציר זמן של פרוטוקול מאויר באיור 1.

1. הליכים כירורגיים וכלי הקשה נוזליים TBI

1. בחר חולדות Sprague-Dawley מבוגר זכר ונקבה, שוכנות בטמפרטורת החדר של 22 ± 1 °C (50 °F), ולחות של 40%-60%, עם מחזורים בהירים-כהים של 12-12 שעות.
2. ספקו אוכל כמו צ'או ומים עד ליביטום. בצע ניסויים בין שעות הבוקר, כלומר, 6: 00 בבוקר.m ו-12: 00.m.
3. בצע הערכה נוירולוגית בסיסית הן עבור קבוצות הבקרה והן עבור קבוצות TBI לפני תחילת הניסוי (ראה סעיף 2 להלן).
4. מרדים את החולדות עם בשאיפה 4% איזופלוראן עבור אינדוקציה ו 1.5% לתחזוקה של הרדמה. ודא כי חולדה משותקת על ידי בדיקת רפלקס דוושה או תנועה בתגובה לגירא.
   הערה: השתמש במערכת ניהול איזופלוריין רציפה להרדמה. בצע את כל ההליכים בתנאים אספטיים.
5. בצע פגיעה בכלי הקשה נוזל parasagittal כפי שתואר בעבר^21,22.
6. להזריק תת עורית 0.2 מ"ל של 0.5% bupivacaine לאורך אתר החתך הפוטנציאלי, לפני החתך. רנספר החולדה לחדר ההתאוששות ולהמשיך לעקוב אחר הנוירולוג (למשל, שיתוק), נשימה (למשל, דום נשימה) ומצב לב וכלי דם (למשל, ירידה זלוף רקמות רכות, שינויים בצבע של אישונים, ברדיקרדיה) עבור 24 שעות. לפני הופעתה מהרדמה, לנהל 0.01 - 0.05 מ"ג/ק"ג buprenorphine תוך שרירי כמו מנטל לאחר הניתוח. מינונים חוזרים כל 6 - 12 שעות לפחות 48 שעות.

2. הערכת ציון חומרה נוירולוגית (NSS)

הערה: הערכת הגירעון הנוירולוגי בוצעה ודורגה באמצעות NSS, כפי שתואר בעבר^23,24. הציון המרבי של שינוי בתפקוד המוטורי ובהתנהגות הוא 24 נקודות. ציון 0 מצביע על מצב נוירולוגי שלם ו -24 מצביע על תפקוד נוירולוגי חמור, כפי שתואר בעבר²⁴.

1. בדוק את חוסר היכולת של החולדה להשאיר עיגול (בקוטר 50 ס"מ) כאשר הוא ממוקם במרכזו. בצע משימה זו שלוש פעמים, כאשר כל הפעלה נמשכת 30 דקות, 60 דקות ויותר מ -60 דקות כל אחת.
   הערה: אם להרים חולדות בזנב, להחזיק את בסיס הזנב.
2. בחן את החולדה לאובדן רפלקס ימין.
   1. מניחים את החיה על גבו בכף ידו של החוקר. תן ציון של 1 אם החיה מסוגלת לתקן את עצמה²⁵ (עומד על כל ארבע כפות).
3. בדוק את החולדה עבור hemiplegia, חוסר היכולת של החולדה להתנגד מיצוב כפוי.
4. הרם את החולדה בזנבו כדי לבדוק את הכיפוף הרפלקסיבי של האחורי.
5. שים את החולדה על הרצפה כדי לבחון את יכולתו ללכת ישר.
6. בצע בדיקות עבור שלוש התנהגויות רפלקסיביות: רפלקס פינה, רפלקס הקרנית, ואת רפלקס הבהלה.
   1. עבור רפלקס pinna, לבצע גירוי מישוש אור כדי לבדוק את נסיגה האוזן כפי שתואר בעבר²⁵.
   2. כדי לבדוק את רפלקס הקרנית, לפקח על תגובת מצמוץ בעת החלת מקל רך בקלילות על העין ולמדוד בסולם של 0 (ללא תגובה) למצמוץ עיניים משולש (3), כפי שתואר בעבר²⁵.
   3. עבור רפלקס הבהלה, גרור עט על פני החלק העליון של כלוב התיל ורשום תגובה עם קנה מידה מ 0 (ללא תגובה) ל 3 (1 ס"מ קפיצה או יותר), כפי שתואר בעבר²⁵.
7. דרג את החולדה בהתבסס על אובדן התנהגות ושקדוח (לא להזיז את השפם שלהם, לרחרח או לרוץ לאחר שהועבר לסביבה חדשה)²⁴.
8. מבחן רפלקסים גפיים עבור המיקום על החלק השמאלי והיומי, ולאחר מכן השמאלי והיומי אחורי.
9. נתח את הפונקציונליות באמצעות משימת איזון הקרן עם קרן ברוחב 1.5 ס"מ. בצע את הבדיקה עבור הפעלות שנמשכו 20 שניות, 40 שניות ויותר מ- 60 שניות.
10. תריץ את מבחן ההליכה של הקורה עם שלוש קורות שונות: רוחב 8.5 ס"מ, רוחב 5 ס"מ ורוחב 2.5 ס"מ.

3. הכנה למשימה המטרית

1. ציוד
   1. מניחים משטח עגול שחור בקוטר 200 ס"מ ובעובי 1 ס"מ על שולחן. גובה השולחן צריך להיות 80 ס"מ מעל הרצפה.
   2. צור שני עצמים שונים במרכז הפלטפורמה המעגלית במרחק של 68 ס"מ זה מזה.
      הערה: בניסוי זה, שני בקבוקי זכוכית שימשו לחפצים, בקבוק עגול אחד בגובה של 13.5 ס"מ ובקבוק פנים נוסף בגובה של 20 ס"מ. מלא בקבוקים במים כדי להבטיח יציבות.
   3. הכן מצלמה והתקן את תוכנת המחשב הנדרשת ללכידה, שמירה ועיבוד של נתונים. התקן את המצלמה בגובה של 290 ס"מ מהרצפה.
      הערה: המרחק בין הפלטפורמה למצלמה תלוי במפרט המצלמה. מסגרת המצלמה צריכה לכסות את כל שטח הזירה שבה מתבצעת הבדיקה. המרחק לניסוי שלנו בין הפלטפורמה למצלמה היה 210 ס"מ.
2. הרגלה
   1. ביום שלפני המשימה, להרגיל את החולדה לסביבה החדשה במשך 10 דקות על ידי הצבה על הזירה ללא הקלטת וידאו.
      הערה: אל תבצע את המשימות הנוירולוגיות ואת המשימה המטרית באותו יום.
      הערה: בצע בדיקות מטריות באזור אור אדום.

4. ביצוע המשימה המטרית

הערה: ביצוע המשימה המטרית מורכב משתי תקופות: 1) תקופת מבחן (15 דקות) ו- 2) (5 דקות).

1. תקופת ההרגלה
   1. קבע שני אובייקטים שונים במרכז הפלטפורמה המעגלית במרחק של 68 ס"מ זה מזה.
   2. הנח את החולדה בקצה הפלטפורמה שווה מהאובייקטים למשך תקופה של 15 דקות, והקלט את הווידאו.
   3. הסר את החולדה מן הפלטפורמה ומניחים בכלוב בודד במשך 5 דקות.
   4. נקה את הפלטפורמה עם 5%-10% אלכוהול.
      הערה: עד 70% אלכוהול עשוי לשמש לניקוי הפלטפורמה באזורים מאווררים היטב.
2. תקופת בדיקה
   1. צמצם את המרחק בין עצמים ל-34 ס"מ.
   2. הנח את החולדה על הרציף למשך 5 דקות ותיעד את פעילות המחקר של החולדה בוידאו.
   3. נקה את הפלטפורמה עם 5%-10% אלכוהול.

5. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח נתונים מבוצע על ידי תוכנת מעקב וידאו שתוכננה במיוחד למחקרי התנהגות בעלי חיים המתעדים באופן אוטומטי פעילות ותנועה של בעלי חיים (ראה טבלת חומרים). תוכנה זו הופכת מגוון משתנים התנהגותיים לאוטומטיים, כולל ניידות, פעילות והתנהגות חקרנית.

1. לפני ניתוח קבצי הווידאו, הכנס את מפתח חומרת התוכנה. הפעל את תוכנת מעקב הווידאו ופתח תבניתמוגדרת מראש .
2. במקטע התקנה, אמת הגדרות באופן הבא: ארנה, בקרת ניסיון וזיהוי הגדרות (ראה איור 2a) .
   הערה: עבור ניסוי זה, פרמטרים עבור אזור המחקר מוגדרים כ 6 ס"מ סביב מושא העניין. הזמן שהחולדה נכנסה לאזור הזה נמדדה.
3. לאחר אימות ההגדרות, שכפל ושנה את שמן.
4. על המסך הכללי של התוכנית, Grab רקע על ידי לחיצה ימנית על העכבר.
5. בחר קובץ וידאו עבור תמונת הרקע. בתפריט עיון, בחר את המיקום של קובץ הווידאו.
6. לכוד את התמונה וסמן את האזורים והאזורים הנחקרים, תוך כיול התמונה לניתוח. בצע את אותם שלבים עבור הגדרות בקרת ניסיון וזיהוי.
7. בתפריט הכללי, בחר רשימת ניסיון והורד את רשימת קבצי הווידאו לניתוח.
8. הוסף את סרטוני הווידאו וציין את המיקום עם ההגדרות הנדרשות.
9. בחר רכישה וניסיון התחלה (ראה איור 2b,c). ייצוא כל הנתונים כקבצי Excel (ראה איור 2d).
   הערה: בצע את כל החישובים עבור תקופות ההרגלה והבדיקה. הערכת פעילות מטרית מוכנה עם תבנית מתקדמת.

תוצאות

משמעות ההשוואות בין הקבוצות נקבעה באמצעות מבחן מאן-ויטני. המשמעות הסטטיסטית של התוצאות נשקלה ב- P < 0.05, בעוד רלוונטיות גבוהה סטטיסטית נמדדה ב- P < 0.01.

התוצאות לא הראו הבדלים ב- NSS בין כל הקבוצות לפני ההתערבות ו -28 ימים לאחר TBI. כל קבוצה כללה 12 חולדות או 12 גברים. ציוני NSS שהתקבלו 48 שע?...

Discussion

על ידי מיקוד ספציפי של תהליך המידע המרחבי המדדי, בדיקה מטרית זו מספקת כלי הכרחי להבנת מחסור בזיכרון לאחר TBI. הפרוטוקול המוצג במאמר זה הוא שינוי של משימות התנהגותיות שתוארו בעבר¹¹. משימה מטרית אחת שתוארה בעבר השתמשה בשתי פרדיגמות שונות, שכל אחת מהן כללה שלושה מפגשי הרגלה ומפגש ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)	This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft