外傷性脳損傷後の成人ラットの空間ワーキングメモリ評価のための測定基準試験

要約

外傷性脳損傷(TBI)は、一般的に記憶障害に関連付けられています。ここでは、メートル単位のタスクを介して、TBI後の空間ワーキングメモリを評価するプロトコルを提示します。メトリックテストは、TBI 後の空間ワーキングメモリ障害を調べるための有用なツールです。

要約

感覚障害, 短期, 長期記憶は外傷性脳損傷後の一般的な副作用です。.人間の研究の倫理的限界のために、動物モデルは、治療方法をテストし、状態のメカニズムおよび関連する合併症を研究するために適切な代替手段を提供する。実験的なげっ歯類モデルは、アクセシビリティ、低コスト、再現性、検証されたアプローチのために、歴史的に最も広く使用されてきました。メトリックテストは、互いに異なる距離と角度での2つのオブジェクトの配置をリコールする能力をテストし、TBIの後に空間ワーキングメモリ(SWM)の障害を研究する技術です。メトリックタスクの大きな利点には、動的観察、低コスト、再現性、実装の相対的な容易さ、低ストレス環境の可能性があります。ここでは、TBI後の成体ラットにおけるSWMの障害を測定するためのメトリックテストプロトコルを提示する。この試験は、脳機能の生理学と病態生理学をより効果的に評価する実行可能な方法を提供する。

概要

中等外傷性脳損傷(TBI)後の注意、執行機能、および特定の記憶障害などの神経障害の有病率は、50%以上である1、2、3、4、5、6、7、8。TBI は、空間的な短期、長期、およびワーキング メモリ⁹で深刻な障害を引き起こす可能性があります。これらの記憶障害はTBIのげっ歯類モデルで観察されている。げっ歯類モデルは、メモリをテストする技術の開発を可能にし、TBIがニューラルメモリシステムにおけるメモリ処理に及ぼす影響を深く調べる。

トポロジカルおよびメトリック空間情報処理に関連する 2 つのテストは、それぞれ空間ワーキング メモリ (SWM) の測定に役立ちます。トポロジーテストは、オブジェクトの周囲の環境空間または関連する接続または囲いのスペースのサイズを変更することに依存し、メトリックテストはオブジェクト^10,11の間の角度または距離の変化^を評価する。グッドリッチ・フンサカーららは、まずラット¹⁰に対するヒトトポロジカルテストを適応させ、空間情報処理¹¹における頭頂皮質(PC)と背側海馬の役割を解離するメトリックタスクを適用した。同様に、Gurkoffたちは、横流流体打楽器損傷⁹後のメトリック、トポロジカル、および時間的順序付け記憶タスクを評価した。脳の特定の領域への損傷とメトリックまたはトポロジカル記憶の障害との間には相関関係があります。メートルメモリ障害は、海馬の両側背状結節回およびコルヌアンモニス(CA)サブ領域CA3における病変に関連しており、トポロジカル記憶障害が両側頭頂皮質病変^10,12に関連することが示唆されている。

このプロトコルの目的は、測定タスクを介してラット集団の空間記憶障害を評価することです。この方法は、脳損傷後のSWMのメカニズムを調査するのに適した代替手段であり、その利点は、実装の相対的な容易さ、高感度、再現性の低コスト、動的観察の可能性、および低ストレス環境を含む。Barnes迷路^13、14、モリス水ナビゲーションタスク^{15、16、17、}または空間迷路タスク^18、19のような他の行動タスクと比較して^、このメトリックテストはそれほど複雑ではありません。実装の容易さのために、メトリックテストは、より短く、より少ないストレスのトレーニング期間を必要とし、わずか2日間^9:習慣のための1日とタスクのための1日で行われます。また、提案されたテストは、新規物体認識(NOR)タスクなどの他の低ストレステストよりも実行が容易であり、また、慣例²⁰の余分な日を必要としない。

本論文は、脳損傷後のSWMを評価するための簡単なモデルを提供する。ポストTBI SWMのこの評価は、その病態生理学のより包括的な調査に役立つ可能性があります。

プロトコル

実験は、ヘルシンキと東京宣言の勧告と欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われた。実験は、ネゲブのベングリオン大学の動物ケア委員会によって承認されました.プロトコルのタイムラインを 図 1に示します。

1. 手術手順と流体パーカッションTBI

1. 1°Cの22±の室温、湿度40%~60%、12~12時間の明暗サイクルで収容されたオスとメスの成人スプレイグ・ドーリーラットを選択します。
2. チャウと水 アドリビタムとして食品を提供します。朝の時間、すなわち6:00 a.mと12:00 p.mの間で実験を行います。
3. 実験開始前に、コントロール群とTBI群の両方に対してベースライン神経学的評価を行う(下記のセクション2を参照)。
4. 吸入4%イオブルランを吸入して誘導し、麻酔の維持のために1.5%でラットを麻酔する。刺激物に反応してペダル反射や動きをテストすることで、ラットが固定されていることを確認します。
   注:麻酔には連続的なイオブルラン投与システムを使用してください。無菌状態ですべての手順を実行します。
5. 前述の^21,22と同様に、パラサジタル流体打楽器を行^う。
6. 皮下に0.2mLの0.5%ブピバカインを、切開前の前切開部位に沿って注入する。ラットを回復室に駆け付け、神経学的(例えば、麻痺)、呼吸(例えば、呼吸停止)および心血管状態(例えば、軟部組織灌流の減少、瞳孔の色の変化、および徐脈)を24時間監視し続ける。麻酔から出現する前に、術後鎮痛として0.01-0.05mg/kg筋肉内ブプレノルフィンを投与する。少なくとも48時間の6〜12時間ごとに用量を繰り返す。

2. 神経学的重症度スコア(NSS)の評価

注:神経学的欠陥の評価は、NSSを使用して行われ、前に説明した^23、24を使用して採点されました。運動機能と動作の変化の最大スコアは24ポイントです。スコア 0 は、神経学的状態がそのままであり、24 は、前に説明した²⁴のように、重度の神経機能機能障害を示します。

1. ラットの中心に置かれたときに円(直径50cm)を残すことができない状態をテストします。このタスクを 3 回実行し、各セッションを 30 分、60 分、および 60 分以上のセッションで実行します。
   注:尾でネズミを拾う場合は、尾のベースを保持します。
2. 正しい反射の損失のためにラットをテストします。
   1. 動物を背中に置いて、研究者の手のひらに置きます。動物が自分自身を右にすることができる場合は1のスコアを与えます²⁵ (すべての4つの足の上に立っています).
3. ラットの片麻痺をテストし、強制的な位置決めに抵抗するラットの能力が不足している。
4. 後肢の反射曲げをテストするために、その尾でラットを上げます。
5. まっすぐ歩く能力をテストするために床にラットを置きます。
6. 3 つの反射的な動作のテストを実行します: ピナ反射、角膜反射、および驚くべき反射。
   1. ピナ反射については、前述の²⁵のように耳の引き込みをテストするために軽い触覚刺激を行う。
   2. 角膜反射をテストするために、眼に軽くソフトスティックを塗布する際の瞬き応答を監視し、トリプルアイブリンク(3)に0(応答なし)のスケールで測定し、前述の²⁵を説明した。
   3. 驚きの反射の場合は、ワイヤーケージの上部にペンをドラッグし、前に説明した²⁵のように、0(応答なし)から3(1cmジャンプ以上)のスケールで応答を記録します。
7. 求める行動とプロストレーションの喪失(ウィスカーの移動、スニッフィング、または新しい環境に移された後の実行)に基づいてラットをグレードする^24.
8. 左と右の前肢、次に左右の後肢の配置のための四肢反射をテストします。
9. ビームバランシングタスクを使用して、幅1.5cmのビームで機能を分析します。20 秒、40 秒、60 秒以上続くセッションのテストを実行します。
10. ビームウォーキングテストは、幅8.5cm、幅5cm、幅2.5cmの3つのビームで行います。

3. メトリック タスクの準備

1. 備品
   1. 直径200cm、厚さ1cmの黒い円形のプラットフォームをテーブルの上に置きます。テーブルの高さは床の上に80センチメートルでなければなりません。
   2. 2つの異なるオブジェクトを、68cm離れた円形プラットフォームの中央に設置します。
      注:この実験では、2つのガラス瓶がオブジェクトに使用され、1つの丸いボトルは高さ13.5cm、もう1つは高さ20cmのファセットボトルでした。安定性を確保するためにボトルに水を入れます。
   3. カメラを準備し、データのキャプチャ、保存、および処理に必要なコンピュータ ソフトウェアをインストールします。床から290cmの高さでカメラを取り付けます。
      メモ:プラットフォームとカメラの間の距離は、カメラの仕様によって異なります。カメラフレームは、テストが行われているアリーナの領域全体をカバーする必要があります。プラットフォームとカメラの間の実験の距離は210cmでした。
2. 慣れ
   1. タスクの前日に、ビデオ録画なしでアリーナに置くことによって、10分間新しい環境にラットを習慣化します。
      注: 同じ日に神経学的なタスクとメトリックタスクを実行しないでください。
      注: 赤いライト領域でメトリック テストを実行します。

4. メトリックタスクの実行

注: メトリック タスクは、1) 習慣 (15 分) と 2) テスト (5 分) の 2 つの期間で構成されます。

1. 居住期間
   1. 2つの異なるオブジェクトを、68cm離れた円形プラットフォームの中央に配置します。
   2. ラットをプラットフォームの端に配置し、15 分間、オブジェクトから等距離に配置し、ビデオを記録します。
   3. プラットホームからラットを取り出し、5分間、個々のケージに入れます。
   4. 5%-10%アルコールでプラットフォームをきれいにしてください。
      注:通気の良い場所でプラットフォームをきれいにするために最大70%のアルコールを使用することができます。
2. テスト期間
   1. オブジェクト間の距離を34cmに減らします。
   2. 5分間プラットフォーム上にラットを置き、ビデオでラットの探査活動を記録します。
   3. 5%-10%アルコールでプラットフォームをきれいにしてください。

5. データ分析

注: データ解析は、動物の活動と動きを自動的に記録する動物行動調査用に特別に設計されたビデオ追跡ソフトウェアによって実行されます ( 資料表を参照)。このソフトウェアは、モビリティ、アクティビティ、探索的動作など、さまざまな動作変数を自動化します。

1. ビデオファイルを分析する前に、ソフトウェアハードウェアキーを挿入します。ビデオトラッキングソフトウェアを起動し、プリセット テンプレートを開きます。
2. [設定]セクションで、次の設定を確認します。
   注: この実験では、探査領域のパラメータは対象のオブジェクトの周囲に 6 cm として定義されます。ラットがこの領域に入った時間を測定した。
3. 設定を確認した後、複製して名前を変更します。
4. プログラムの一般的な画面で、マウスを右クリックして 背景 をつかむ。
5. 背景画像のビデオファイルを選択します。 [参照 ] メニューで、ビデオ ファイルの場所を選択します。
6. 画像をキャプチャし、調査対象の領域とゾーンにマークを付け、画像をキャリブレーションして解析します。 [試用制御 ] と [ 設定の検出] でも同じ手順を実行します。
7. 一般メニューで[ トライアルリスト ]を選択し、分析用のビデオファイルのリストをダウンロードします。
8. ビデオを追加し、必要な設定で場所を指定します。
9. [取得] と [試用開始] を選択します ( 図 2b,cを参照)。すべてのデータを Excel ファイルとしてエクスポートします ( 図 2dを参照)。
   注: 習慣とテスト期間のすべての計算を実行します。メトリック・タスク評価は、高度なテンプレートで準備されます。

結果

グループ間の比較の重要性は、マン・ホイットニー検定を用いて決定した。結果の統計的有意性はP<0.05で考慮され、統計的に高い関連性はP<0.01で測定された。

この結果は、介入前とTBIの28日後のすべてのグループ間でNSSに違いは見られない。各群は12匹の雌または12匹の雄のラットで構成された。TBI の後に 48 時間取得された NSS スコアを 表 1に示します。傷?...

ディスカッション

このメトリック テストは、メトリック空間情報プロセスを明確にターゲットにすることで、TBI 後のメモリ不足を理解するために必要なツールを提供します。このホワイト ペーパーで紹介するプロトコルは、前述の行動タスク¹¹の変更です。前述のメトリック・タスクの 1 つは、それぞれ 3 つの習慣セッションと 1 つのテスト・セッションから構成される 2 つの異なるパラ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)			This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft