Un test metrico per valutare la memoria di lavoro spaziale nei ratti adulti a seguito di lesioni cerebrali traumatiche

Riepilogo

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è comunemente associata a compromissione della memoria. Qui, presentiamo un protocollo per valutare la memoria di lavoro spaziale dopo TBI tramite un'attività metrica. Un test metrico è uno strumento utile per studiare la compromissione della memoria di lavoro spaziale dopo TBI.

Abstract

Le menomazioni alla memoria sensoriale, a breve termine e a lungo termine sono effetti collaterali comuni dopo lesioni cerebrali traumatiche (TBI). A causa dei limiti etici degli studi sull'uomo, i modelli animali forniscono alternative adeguate ai metodi di trattamento dei test e per studiare i meccanismi e le relative complicanze della condizione. I modelli sperimentali di roditori sono stati storicamente i più utilizzati grazie alla loro accessibilità, basso costo, riproducibilità e approcci convalidati. Un test metrico, che verifica la capacità di richiamare il posizionamento di due oggetti a varie distanze e angoli l'uno dall'altro, è una tecnica per studiare la compromissione della memoria di lavoro spaziale (SWM) dopo TBI. I vantaggi significativi delle attività metriche includono la possibilità di osservazione dinamica, basso costo, riproducibilità, relativa facilità di implementazione e ambiente a basso stress. Qui, presentiamo un protocollo di test metrico per misurare la compromissione di SWM nei ratti adulti dopo TBI. Questo test fornisce un modo fattibile per valutare la fisiologia e la fisiopatologia della funzione cerebrale in modo più efficace.

Introduzione

La prevalenza di deficit neurologici come l'attenzione, la funzione esecutiva e alcuni deficit di memoria dopo una moderata lesione cerebrale traumatica (TBI) è superiore al 50%^{1,2,3,4,5,6,7,8.} Tbi può portare a gravi menomazioni nella memoria spaziale a breve termine, a lungo termine e di lavoro⁹. Queste compromissioni della memoria sono state osservate in modelli di roditori di TBI. I modelli di roditori hanno permesso lo sviluppo di tecniche per testare la memoria, consentendo esami più approfonditi sull'effetto del TBI sull'elaborazione della memoria nei sistemi di memoria neurale.

Due test, relativi rispettivamente all'elaborazione delle informazioni spaziali topologiche e metriche, aiutano a misurare la memoria di lavoro spaziale (SWM). Il test topologico dipende dalla modifica delle dimensioni dello spazio ambientale o degli spazi correlati di connessione o involucro attorno a un oggetto, mentre il test metrico valuta i cambiamenti di angoli o distanza tra gli oggetti^10,11. Goodrich-Hunsaker et al. hanno prima adattato il test topologico umano per i ratti¹⁰ e applicato il compito metrico per dissociare i ruoli della corteccia parietale (PC) e dell'ippocampo dorsale nell'elaborazione delle informazioni spaziali¹¹. Allo stesso modo, Gurkoff e colleghi hanno valutato compiti di memoria metrica, topologica e temporale dopo la lesione da percussione del fluido laterale⁹. Esiste una correlazione tra il danno a determinate regioni del cervello e la compromissione della memoria metrica o topologica. È stato suggerito che la compromissione della memoria metrica è correlata a lesioni nel giro dentato dorsale bilaterale e nella sottoregione del cornu ammonis (CA) CA3 dell'ippocampo e che la compromissione della memoria topologica è correlata alle lesioni bilaterali della corteccia parietale^10,12.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare il deficit di memoria spaziale in una popolazione di ratti tramite un compito metrico. Questo metodo è un'alternativa adatta per studiare i meccanismi di SWM dopo una lesione cerebrale e i suoi vantaggi includono la relativa facilità di implementazione, l'alta sensibilità, il basso costo di riproducibilità, la possibilità di osservazione dinamica e un ambiente a basso stress. Rispetto ad altri compiti comportamentali come il labirinto di Barnes^13,14,il compito di navigazione in acqua Morris^15,16,17o i compiti del labirinto spaziale^18,19,questo test metrico è meno complicato. Grazie alla sua facilità di implementazione, il test metrico richiede un periodo di allenamento più breve e meno stressante e si svolge in soli 2 giorni^9:1 giorno per l'assuefazione e 1 giorno per il compito. Inoltre, il nostro test proposto è più facile da eseguire rispetto ad altri test a basso stress, come il nuovo compito di riconoscimento degli oggetti (NOR) e non richiede il giorno in più di assuefazione²⁰.

Questo documento fornisce un modello semplice per valutare SWM dopo una lesione cerebrale. Questa valutazione del SWM post-TBI può aiutare in un'indagine più completa della sua fisiopatologia.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti seguendo le raccomandazioni delle Dichiarazioni di Helsinki e Tokyo e le Linee guida per l'uso degli animali da esperimento della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Una sequenza temporale del protocollo è illustrata nella Figura 1.

1. Procedure chirurgiche e TBI a percussione fluida

1. Alcuni ratti Sprague-Dawley adulti maschi e femmine, alloggiati a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e umidità del 40%-60%, con cicli luce-buio di 12-12 ore.
2. Fornire cibo come chow e acqua ad libitum. Esegui esperimenti tra le ore del mattino, ad es. 6:00 a.m. e 12:00 p.m.
3. Eseguire una valutazione neurologica di base sia per il gruppo di controllo che per il TBI prima dell'inizio dell'esperimento (vedere paragrafo 2 di seguito).
4. Anestetizzare i ratti con isoflurano inalato al 4% per induzione e 1,5% per il mantenimento dell'anestesia. Assicurarsi che il ratto sia immobilizzato testando il riflesso del pedale o il movimento in risposta a un irritante.
   NOTA: utilizzare un sistema di somministrazione continua di isoflurano per l'anestesia. Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.
5. Eseguire lesioni parasagittali fluido-percussioni come precedentemente descritto^21,22.
6. Iniettare per via sottocutanea 0,2 ml di bupivacaina allo 0,5% lungo il sito di incisione prospettica, prima dell'incisione. portare il ratto nella sala di recupero e continuare a monitorare lo stato neurologico (ad esempio, paralisi), respiratorio (ad esempio, arresto respiratorio) e cardiovascolare (ad esempio, diminuzione della perfusione dei tessuti molli, cambiamenti di colore delle pupille e bradicardia) per 24 ore. Prima dell'emergenza dall'anestesia, somministrare 0,01 - 0,05 mg / kg di buprenorfina intramuscolare come analgesia postoperatoria. Ripetere le dosi ogni 6 - 12 ore per almeno 48 ore.

2. Valutazione del punteggio di gravità neurologica (NSS)

NOTA: La valutazione del deficit neurologico è stata eseguita e classificata utilizzando un NSS, come precedentemente descritto^23,24. Il punteggio massimo di alterazione della funzione motoria e del comportamento è di 24 punti. Un punteggio di 0 indica uno stato neurologico intatto e 24 indica una grave disfunzione neurologica, come descritto in precedenza²⁴.

1. Testare l'incapacità del ratto di lasciare un cerchio (50 cm di diametro) quando viene posizionato al centro. Esegui questa attività tre volte, con ogni sessione della durata di 30 minuti, 60 minuti e più di 60 minuti ciascuna.
   NOTA: se raccogli i ratti per la coda, tieni la base della coda.
2. Testare il ratto per una perdita di riflesso raddrizzante.
   1. Metti l'animale sulla schiena nel palmo della mano del ricercatore. Dare un punteggio di 1 se l'animale è in grado di raddrizzarsi²⁵ (in piedi su tutte e quattro le zampe).
3. Testare il ratto per l'emiplegia, l'incapacità del ratto di resistere al posizionamento forzato.
4. Sollevare il ratto per la coda per testare la flessione riflessiva dell'arto posteriore.
5. Metti il topo sul pavimento per testare la sua capacità di camminare dritto.
6. Eseguire test per tre comportamenti riflessivi: il riflesso pinna, il riflesso corneale e il riflesso di startle.
   1. Per il riflesso pinna, eseguire una leggera stimolazione tattile per testare la retrazione dell'orecchio come descritto in precedenza²⁵.
   2. Per testare il riflesso corneale, monitorare la risposta del battito di ciglia quando si applica leggermente un bastoncino morbido all'occhio e misurare su una scala di 0 (nessuna risposta) al battito di ciglia triplo occhio (3), come precedentemente descritto²⁵.
   3. Per il riflesso di startle, trascinare una penna sulla parte superiore della gabbia metallica e registrare la risposta con una scala da 0 (nessuna risposta) a 3 (salto di 1 cm o più), come descritto in precedenza²⁵.
7. Classificare il ratto in base alla perdita del comportamento di ricerca e della prostrazione (non muovere i baffi, annusare o correre dopo essere stato trasferito in un nuovo ambiente)²⁴.
8. Testare i riflessi degli arti per il posizionamento sugli arti anteriori sinistro e destro, quindi sugli arti posteriori sinistro e destro.
9. Analizza la funzionalità tramite l'attività di bilanciamento del fascio con un raggio largo 1,5 cm. Eseguire il test per sessioni della durata di 20 secondi, 40 secondi e più di 60 secondi.
10. Esegui il test di camminata del fascio con tre diverse travi: 8,5 cm di larghezza, 5 cm di larghezza e 2,5 cm di larghezza.

3. Preparazione per l'attività metrica

1. Attrezzatura
   1. Posizionare una piattaforma circolare nera di 200 cm di diametro e 1 cm di spessore su un tavolo. L'altezza del tavolo dovrebbe essere di 80 cm sopra il pavimento.
   2. Stabilisci due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
      NOTA: In questo esperimento, sono state utilizzate due bottiglie di vetro per oggetti, una bottiglia rotonda con un'altezza di 13,5 cm e un'altra bottiglia sfaccettata con un'altezza di 20 cm. Riempire le bottiglie con acqua per garantire la stabilità.
   3. Preparare una fotocamera e installare il software necessario per l'acquisizione, il salvataggio e l'elaborazione dei dati. Installare la telecamera ad un'altezza di 290 cm dal pavimento.
      NOTA: la distanza tra la piattaforma e la fotocamera dipende dalle specifiche della telecamera. La cornice della telecamera deve coprire l'intera area dell'arena in cui viene condotto il test. La distanza per il nostro esperimento tra la piattaforma e la fotocamera era di 210 cm.
2. Assuefazione
   1. Il giorno prima del compito, abituare il topo al nuovo ambiente per 10 minuti posizionandolo nell'arena senza registrazione video.
      NOTA: non eseguire le attività neurologiche e l'attività metrica nello stesso giorno.
      NOTA: eseguire test metrici in un'area a luci rosse.

4. Esecuzione dell'attività metrica

NOTA: l'esecuzione dell'attività metrica consiste in due periodi: 1) assuefazione (15 min) e 2) periodo di test (5 min).

1. Periodo di assuefazione
   1. Stabilire due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
   2. Posiziona il topo all'estremità della piattaforma equidistante dagli oggetti per un periodo di 15 minuti e registra il video.
   3. Rimuovere il topo dalla piattaforma e metterlo in una gabbia individuale per 5 minuti.
   4. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.
      NOTA: fino al 70% di alcol può essere utilizzato per pulire la piattaforma in aree ben ventilate.
2. Periodo di prova
   1. Ridurre la distanza tra gli oggetti a 34 cm.
   2. Posiziona il topo sulla piattaforma per 5 minuti e registra l'attività di esplorazione del ratto in video.
   3. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.

5. Analisi dei dati

NOTA: l'analisi dei dati viene eseguita da un software di tracciamento video appositamente progettato per studi sul comportamento animale che registra automaticamente l'attività e il movimento degli animali (vedere Tabella dei materiali). Questo software automatizza una serie di variabili comportamentali, tra cui mobilità, attività e comportamento esplorativo.

1. Prima di analizzare i file video, inserire la chiave hardware del software. Avviare il software di monitoraggio video e aprire Il modellopreimpostato .
2. Nella sezione Configurazione verificare le impostazioni come segue: Arena, Controllo di provae Rilevamento impostazioni (vedere la Figura 2a).
   NOTA: per questo esperimento, i parametri per l'area di esplorazione sono definiti come 6 cm intorno all'oggetto di interesse. È stato misurato il tempo in cui il ratto è entrato in quest'area.
3. Dopo aver verificato le impostazioni, duplicarle e rinominarle.
4. Nella schermata generale del programma, Grab Background facendo clic con il pulsante destro del mouse.
5. Selezionare un file video per l'immagine di sfondo. Nel menu Sfoglia, selezionare la posizione del file video.
6. Cattura l'immagine e contrassegna le aree e le zone indagate, calibrando l'immagine per l'analisi. Eseguire gli stessi passaggi per Il controllo della versione di prova e il rilevamento delle impostazioni.
7. Nel menu generale, selezionare Elenco prove e scaricare l'elenco dei file video per l'analisi.
8. Aggiungi i video e indica la posizione con le impostazioni richieste.
9. Selezionare acquisizione e Avvia versione di prova (vedere figura 2b,c). Esportare tutti i dati come file Excel (vedere la Figura 2d).
   NOTA: eseguire tutti i calcoli per i periodi di assuefazione e di prova. La valutazione delle attività metriche viene preparata con un modello avanzato.

Risultati

Il significato dei confronti tra i gruppi è stato determinato utilizzando il test di Mann-Whitney. La significatività statistica dei risultati è stata considerata a P < 0,05, mentre la rilevanza statisticamente elevata è stata misurata a P < 0,01.

I risultati non hanno mostrato differenze nella NSS tra tutti i gruppi prima dell'intervento e 28 giorni dopo il TBI. Ogni gruppo era composto da 12 femmine o 12 ratti maschi. I punteggi NSS ottenuti 48 ore dopo TBI sono presentati nella ...

Discussione

Prendendo di mira in modo specifico il processo di informazione spaziale metrica, questo test metrico fornisce uno strumento necessario per comprendere la carenza di memoria dopo TBI. Il protocollo presentato in questo documento è una modifica delle attività comportamentali precedentemente descritte¹¹. Un'attività metrica descritta in precedenza utilizzava due diversi paradigmi, ciascuno costituito da tre sessioni di assuefazione e una sessione di test. Il primo paradigma consisteva nello spost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	SIGMA - ALDRICH	500 cc	For general antisepsis of the skin in the operatory field
Bupivacaine 0.1 %
4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm)			This is to evaluate neurological defect
4-0 Nylon suture	4-00
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution
Bottlses (four) for topological an metric tasks			For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm).
Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter		Glass Hole Saw Kit	Optional.
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Ethanol 99.9 %	Pharmacy		5%-10% solution used to clean equipment and remove odors
EthoVision XT (Video software)	Noldus, Wageningen, Netherlands		Optional
Fluid-percussion device	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended.
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
Gloves (thin laboratory gloves)			Optional.
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2	No specific brand is recommended.
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017	Anesthetic liquid for inhalation
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating  forceps	SIGMA - ALDRICH
Operating  Scissors	SIGMA - ALDRICH
PC Computer for USV recording and data analyses	Intel		Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system
Plexiglass boxes linked by a narrow passage			Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5
Rat cages  (rat home cage or another enclosure)	Techniplast	2000P	No specific brand is recommended
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
SPSS	SPSS Inc., Chicago, IL, USA	20 package
Stereotaxic Instrument	custom-made at the university workshop		No specific brand is recommended
Timing device	Interval Timer:Timing for recording USV's		Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats
Topological and metric tasks device	Self made in Ben Gurion University of Negev		White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table
Video camera	Logitech	C920 HD PRO WEBCAM	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test
Windows 10	Microsoft