血源性内皮细胞与人多能干细胞的定向分化

摘要

这里介绍的是在大约 1 周内从人多能干细胞定向分化的血源性内皮细胞的简单方案。

摘要

血管普遍分布在身体的所有组织中，并执行不同的功能。因此，从人多能干细胞衍生出排列血管腔的成熟血管内皮细胞对于多种组织工程和再生应用至关重要。在体内，原始内皮细胞来源于中胚层谱系，并针对特定的亚型，包括动脉、静脉、毛细血管、血源性和淋巴管。血源性内皮细胞特别令人感兴趣，因为在发育过程中，它们会产生造血干细胞和祖细胞，然后在整个生命中产生所有血系。因此，创建一个在体外产生血源性内皮细胞的系统将为研究内皮到造血的转变提供机会，并可能导致人类血液制品的离体生产和减少对人类供体的依赖。虽然存在几种用于衍生祖细胞和原始内皮细胞的方案，但尚未描述从人类干细胞中产生特征明确的血源性内皮细胞。本文提出了一种在大约1周内从人胚胎干细胞衍生血源性内皮细胞的方法:分化方案，响应GSK3β抑制剂（CHIR99021）形成的原始条纹细胞，然后由bFGF介导的中胚层谱系诱导，然后是BMP4和VEGF-A促进的原始内皮细胞发育，最后是视黄酸诱导的血源性内皮细胞规格。该协议产生明确定义的血源性内皮细胞群，可用于进一步了解其分子调控和内皮到造血的转变，这有可能应用于下游治疗应用。

引言

内皮细胞（ECs）是一个异质细胞群，在整个人体和工程组织中执行多种功能。除了支持和调节其他细胞类型（即心肌细胞¹，成骨细胞²）外，这些功能还包括在血液和组织之间形成选择性屏障并协助组织形成³。成熟EC在正常发育过程中的分化需要多样化的信号通路。原始 EC 来源于中胚层祖细胞，然后针对成熟的动脉、静脉、毛细血管和淋巴表型⁴ 进行指定。此外，胚胎外卵黄囊和胚胎主动脉-性腺-中胚层（AGM）区域中的一小部分EC也被指定为血源性EC，其产生造血干细胞和祖细胞（HSPC）迁移到胎儿肝脏和胎儿骨髓，在那里它们在出生后保留并在整个生命中产生所有血细胞类型⁴。EC表型的多样性对于所有组织发育和维护都是必不可少的。

因此，EC及其衍生物是旨在建模和阐明人类发育和/或疾病以及再生医学和组织工程应用机制的研究的关键组成部分⁵，⁶，^7，8。然而，这些类型研究的主要局限性是缺乏所需数量的初级人类ECs。据估计，大多数治疗应用至少需要 3 x 10⁸ 个 EC⁶。为了解决这个问题，已经提出了使用人类胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），因为它们具有不同的谱系潜力和产生大量后代的能力6^，9。

事实上，源自hESC或hiPSC的细胞的有用性已经在多项专注于疾病建模和药物筛选的研究中得到证实¹⁰，^11，12。器官芯片（OOC）技术已被用于通过将细胞和组织整合到三维支架中来更忠实地概括人体的生理学。此外，多个单独的OOC（所谓的人体或人芯片，BOC / HOC）的连接可以通过微流体完成，以允许感兴趣的器官之间的串扰¹³，^14，15。支持组织，如脉管系统，是 OOC 和 BOC/HOC 的关键组成部分;结合脉管系统允许营养物质，氧气和旁分泌因子在整个组织中运输，从而促进必要的组织特异性微环境^3，12。因此，推导成熟人类EC的方法，如动脉，静脉，淋巴管和血源性ECs，对于推进这些组织工程方法至关重要。

已经发布了多个协议，详细说明了从hESC或hiPSC⁵，16，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21，22，^23，24，^25，26衍生人类原始或祖EC的步骤.其中许多方案依赖于胚体（EB）形成或ESC / iPSCs与基质细胞的鼠饲养层共培养。这些策略往往既困难又耗时，EC产量低和/或人EC被鼠细胞污染。严格依赖2D培养而不使用基质细胞的方案通常需要长时间诱导，利用生长因子和/或抑制剂的复杂组合进行诱导，细胞分离后具有延长的扩增期，或这些因素的组合。推进对体内成熟EC类型衍生所涉及的信号通路和因素的了解，为简单而强大的体外分化方案奠定了基础。

以前，Notch和Retinoic Acid（RA）信号通路在发育过程中分别在小鼠动脉和血源性EC的规范中的关键作用被确定。Notch信号通路在动脉EC表型的规范和维持中起着多种作用。使用小鼠视网膜血管化模型的工作确定了流体剪切应力诱导Notch-Cx37-p27信号轴的途径，促进G1细胞周期停滞，从而使动脉EC规范²⁷成为可能。据推测，细胞周期状态通过提供独特的机会窗口在细胞命运决策中发挥作用，在这些机会窗口中，细胞可以接受某些可以诱导基因表达和表型变化的信号²⁸。这种Notch介导的G1停滞使富含动脉EC的基因表达，包括ephrinB2，Cx40，DLL4，Notch1和Notch 4（在^29，30中审查）。还表明，通过RA信号传导^31，32在体内促进血源性EC规范。其他研究发现，在RA信号传导的下游，c-Kit和Notch的表达上调p27，这使得鼠卵黄囊和AGM³³中的产血性规范成为可能。小鼠血源性EC可以通过内皮（即CD31，KDR）和造血（即c-Kit，CD34^）标志物的表达进行最低限度的鉴定4。最后，血源性EC经历内皮到造血的转变（EHT）形成HSPC，可以产生所有血细胞类型⁴，^34，35。

最近的工作测试了这种相同的信号层次结构是否可以促进人类血源性EC规范。为此，开发了一种无血清和饲养层的2D培养方案，以从hESC中获取血源性EC，并且这些血源性EC在单细胞水平上表征为CD31 + KDR + c-Kit⁺ CD34 ⁺ VE-钙粘蛋白^-CD45^-。这项研究还利用了荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）报告基因，该报告基因使用表达FUCCI报告基因构建体（H9-FUCCI-hESC）的H9-hESC识别不同的细胞周期状态³⁶。在这些细胞的研究中，证明RA促进EC中的早期G1细胞周期停滞，并且早期G1状态使体外血源性规范³⁷成为可能。本文提供了用于分化这些人血源性内皮细胞的详细方案以及确认其身份的测定。这种简单的方法为未来研究人类血细胞发育的机制提供了一种有用的方法来生成这种专门的EC亚集。

研究方案

1. 试剂和试剂制备

注意: 材料表中提供了试剂列表。

1. 获得人类多能干细胞系:H1-hESC，H9-Fucci-hESC。
   注意:在H1细胞系中，血源性EC的产生可能更有效。
2. 制备基质蛋白储备液:将基质蛋白等分到预冷的 1.5 mL 管（冰上）中，使每个试管含有 1 mg 基质蛋白。1mg基质蛋白足以包被两个6孔板的所有孔（总共12个孔）。将等分试样储存在-20°C直至使用。
   注意:在冰上或4°C下执行涉及基质蛋白的所有步骤。 将冷冻的基质蛋白储备瓶在4°C的冰上解冻过夜。解冻后，旋转小瓶以确保内容物混合。在-20°C下预冷1.5mL微量离心管至少1小时，并在等分试样前立即转移到冰上。
3. 制备基质蛋白包被板:在4°C的冰上解冻基质蛋白等分试样。 将 12.5 mL 冰冷的 DMEM:F12 加入冰上预冷的锥形管中。利用预冷移液器吸头，将一等分试样（1 mg）基质蛋白转移到锥形管中，并通过上下移液充分混合。使用预冷血清移液管将 1 mL 稀释的基质蛋白等分到预冷的 6 孔板（冰上）的每个孔中。旋转和摇动板，使整个孔均匀涂覆。将板在室温下孵育至少30分钟，以使基质蛋白凝固。用封口膜包裹板，并在4°C下储存直至使用。在制备后 2 周内使用基质蛋白包被板。
   注意:使用基质蛋白包被的6孔板进行细胞的常规传代和分化为原始和血源性内皮细胞。在冰上执行所有步骤。在-20°C下使用至少1小时之前，预冷却6孔板，移液器吸头，血清移液器和锥形管。 准备使用时将这些物品转移到冰上。
4. 通过将 5 mL PFHM 加入 100 mL 多能干细胞分化培养基来制备基础分化培养基。储存在4°C。
5. 通过将 0.1 g BSA 溶解在 100 mL PBS 中来制备 0.1% BSA-PBS。过滤器通过0.22μm过滤器对BSA-PBS进行灭菌，并储存在4°C。
6. 用水以 1:2，400 的比例稀释 5 mM HCl（12 M）原液，制备 5 mM HCl。利用氢氧化钠将pH值调节至3.0。过滤器通过0.22μm过滤器对溶液进行灭菌，并储存在4°C。
7. 准备 bFGF、BMP4、VEGF-A、维甲酸 （RA） 和 DLL4 储备液。
   1. bFGF:将冻干粉末在 0.1% BSA-PBS 中复溶至 100 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在制备后 3 个月内使用 bFGF 储备液。使用前立即解冻等分试样。
   2. BMP4:将冻干粉末在 5mM HCl、pH 3.0 中复溶至 1 mg/mL。在 0.1% BSA-PBS 中进一步稀释至 50 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后 3 个月内使用 BMP4 储备液。使用前立即解冻等分试样。
   3. VEGF-A:将冻干粉末在 dH₂O 中复溶至 1 mg/mL。在 0.1% BSA-PBS 中进一步稀释至 100 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后 3 个月内使用 VEGF-A 库存。使用前立即解冻等分试样。
   4. RA:在DMSO中将冻干粉末复溶至100mM。等分并储存在-80°C。 在准备后 1 个月内使用 RA 库存。使用前立即解冻等分试样。
      注意:保护 RA 库存免受光照。
   5. DLL4:将冻干粉末在PBS中复溶至1 mg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后的 12 个月内使用 DLL4 库存。使用前立即解冻等分试样。
8. 通过使用前立即通过在碱分化培养基中稀释VEGF-A和BMP4来制备内皮细胞分化培养基（步骤1.4），使最终浓度分别为25ng / mL和50 ng / mL。
9. 在使用前立即准备工作RA，将DMSO中的100 mM储备液以1:1，000稀释至100μM。
   注意:保护工作中的 RA 免受光照。
10. 通过在碱分化培养基中稀释 VEGF-A、BMP4 和工作 RA（步骤 1.4），在使用前立即制备血源性内皮细胞分化培养基，使最终浓度分别为 25 ng/mL、50 ng/mL 和 0.5 μM。
11. 通过制作含有10%FBS的HBSS来制备抗体染色缓冲液，并补充1:500稀释的抗菌试剂。无菌过滤缓冲液并立即使用。
12. 通过制作含有1%FBS的HBSS来制备细胞分选缓冲液，并补充1:500稀释的抗菌试剂。无菌过滤缓冲液并立即使用。
13. 通过将 5 mL 无菌水加入 5 mg 冻干纤连蛋白中来制备 1 mg/mL 纤连蛋白储备液。等分并储存在-20°C。 在冻干产品标签上的有效期之前使用纤连蛋白原液。使用前立即解冻等分试样。
14. 准备纤连蛋白包被的35毫米培养皿。在无菌水中将纤连蛋白储备液（1 mg/mL）稀释至 4 μg/mL。向每个培养皿中加入1mL这种纤连蛋白包衣溶液，并在37°C下孵育30分钟至1小时。涂覆后立即使用培养皿。
15. 按照制造商的说明制备 3 或 4 mL 等分试样的甲基纤维素基培养基。将等分试样储存在-20°C直至使用。在原液标签上标明的有效期之前使用基于甲基纤维素的培养基等分试样。使用前立即解冻等分试样。
16. 通过将重组人 DLL4 原液稀释至 PBS 中的终浓度为 10 μg/mL，制备 DLL4 包衣溶液。
17. 根据制造商的说明制备和储存内皮细胞生长培养基。
18. 通过制作含有0.1%BSA的PBS来制备流式细胞术分析缓冲液。无菌过滤缓冲液并储存在4°C直至使用。

2. 细胞培养和hESC的传代

1. 让基质蛋白包被的板、干细胞生长培养基和 DMEM:F12 升温至室温。
2. 在 37 °C、5% CO 2 培养箱中的基质蛋白包被的 6 孔板上的干细胞生长培养基 （₂ mL/孔） 中培养 hESC 细胞系。
3. 每天检查细胞，并根据需要使用p200移液器吸头轻轻将其从板上刮下，从而去除分化的细胞。
   注意:分化的细胞将出现在菌落的外围。有关培养中分化细胞的示例，请参阅干细胞生长培养基产品手册。
4. 一旦细胞达到70%-80%汇合，就传代细胞。要传代细胞，请执行以下步骤。
   注意:如果分化增加，细胞应在达到70%-80%汇合度之前分裂。
   1. 取出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤。
   2. 每孔加入 1 mL DMEM:F12。
   3. 每孔加入 160 μL/mL 分散酶，并将细胞在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 45 分钟。
   4. 分散酶孵育后，每孔额外加入 1 mL DMEM:F12，轻轻移液以提升细胞。
      注意:避免将细胞解离成单细胞悬液。将细胞传代为小团块。
   5. 将细胞转移到含有 12 mL DMEM:F12 的锥形管中，并让细胞通过重力沉降（~5-10 分钟）。
   6. 除去上清液，每孔提升细胞轻轻重悬沉淀在0.5mL干细胞生长培养基中，以获得小团块细胞。
      注意:避免将细胞解离成单细胞悬液。将细胞传代为小团块。
   7. 从制备的基质蛋白包被板的孔中吸出基质蛋白包被溶液，每孔加入1.5mL干细胞生长培养基。
   8. 将所需体积的重悬细胞（步骤2.4.6）加入到制备的基质蛋白包被板的每个孔中。
   9. 将板在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育。每24小时更换一次培养基至新鲜干细胞生长培养基。

3. hESCs分化为原始内皮细胞

1. 第-1天:按照上述第2节所述培养和传代细胞。将细胞（步骤2.4.6）接种在小团块（~50μm）中，密度约为每平方厘米2个团块³⁸。
   注意:评估种子密度并在必要时根据经验进行细化。
2. 第 0 天:接种细胞后 24 小时，从每个孔中吸出培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入 1 mL 含有 5 μM GSK3i（CHIR99021，新鲜添加）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。
   注意:对于所有洗涤步骤，通过移液板孔壁，将指示的洗涤介质缓慢添加到板上。轻轻旋转板，使孔的整个表面被洗涤介质覆盖。稍微倾斜板，使洗涤介质聚集在六点钟位置，并小心地吸出洗涤介质。
3. 第 1 天:从每个孔中吸出培养基，并用每孔 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入 1 mL 含有 50 ng/mL bFGF（从冷冻原液中以 1:2，000 的新鲜添加）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。
4. 第 2 天:从每个孔中吸出培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入1mL内皮细胞分化培养基并孵育24小时（37°C，5%CO₂）。
5. 第 3 天:每孔用 1 mL 新鲜制备的内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。
6. 第 4 天:每孔用 1 mL 新鲜制备的内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。
7. 第 5 天:FACS 纯化细胞以评估 EC 表型（第 4-5 节）或保持培养并分化为血源性内皮细胞（第 6 节）。

4. 原代内皮细胞的FACS纯化

1. 吸出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤一次。
2. 每孔加入 1 mL 细胞分离溶液，并将细胞在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 12 分钟，或直到细胞解离。
3. 将解离的细胞转移到含有 12 mL DMEM:F12 的锥形管中，并通过离心 5 分钟、1，000 x g沉淀。
4. 除去上清液并将沉淀重悬于 12 mL DMEM:F12 中洗涤。
5. 通过离心5分钟，1，000× g沉淀细胞。
6. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于冰冷的抗体染色缓冲液中并计数细胞。使用冰冷的抗体染色缓冲液将浓度调节至 1 x 10⁵ 个细胞/mL。
7. 将细胞均匀地分成冰上的微量离心管中，每个离心管至少含有 600 μL 细胞，浓度为 1 x 10⁵ 个细胞/mL，用于抗体染色。
   注意:原始EC染色需要四管细胞:未染色对照，CD31单抗体对照，CD45单抗体对照以及含有CD31和CD45抗体的样品。有关抗体的信息在 材料表中提供。
8. 酌情向含有细胞的试管中添加抗体，并在冰上孵育并避光30分钟。
   1. 未染色对照:不要添加任何抗体。
   2. CD31单抗对照:仅添加CD31抗体。
   3. CD45单抗对照:仅添加CD45抗体。
   4. 样品:添加CD31和CD45抗体。
      注意:样品中的最终抗体浓度以及荧光偶联物应根据所使用的特异性抗体和细胞分选仪进行优化。
9. 通过在4°C台式微量离心机中以1，000× g离心5分钟来沉淀细胞。
10. 除去上清液，将细胞沉淀重悬于 600 μL 冰冷的分选缓冲液中。
11. 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，以便立即进行 FACS。
12. 通过执行以下步骤获得原始内皮细胞（CD31 ⁺ CD45^-）。
    1. 鉴定CD45阴性细胞群和门（CD45^-）。
    2. 在 （CD45^-） 内，鉴定 CD31 阳性 （CD31⁺） 细胞群并将细胞分选到 6 mL 冰冷细胞分选缓冲液中。将这些单元用于下游应用（请参阅第 5 节）。

5. 确认原始内皮细胞表型的测定

1. 用 1 mL/孔 DLL4 包衣溶液涂覆 6 孔板的三个孔在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中涂覆 30 分钟。作为对照，用 1 mL/孔 PBS 模拟涂覆板的其他三个孔。
2. 吸出DLL4包衣溶液和PBS，并在每孔2mL内皮细胞生长培养基中接种25，000个分选的原始内皮细胞（参见步骤4.12）。
3. 将细胞在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育24小时。
4. 吸出细胞上方的培养基，并用 2 mL/孔 PBS 洗涤一次。通过qPCR或流式细胞术分析细胞（用于表达FUCCI构建体的细胞）。
   1. 要通过qPCR分析细胞，请执行以下步骤。
      1. 根据制造商的方案，吸出细胞上方的液体并使用RNA提取试剂盒分离细胞中的RNA。
      2. 根据制造商的方案使用逆转录预混液进行逆转录反应。
      3. 根据制造商的方案，使用SYBR绿色预混液进行qPCR反应。
         注意:使用的引物（EFNB2，GJA5，GJA4，NR2F2，EPHB4，HEY2）列于 表1中。
   2. 要通过流式细胞术分析表达FUCCI构建体的细胞，请执行以下步骤。
      1. 吸出细胞上方的液体，并加入 500 μL/孔 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
      2. 将细胞在37°C的5%CO₂培养箱中孵育直至提起，~5分钟。
      3. 将细胞转移到微量离心管中，并在4°C微量离心机中以1，000× g沉淀细胞5分钟。
      4. 吸出上清液并将沉淀重悬于500μL冰冷的流式细胞术分析缓冲液中。
      5. 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，以便立即进行流式细胞术分析。
      6. 分析早期G1（无颜色），晚期G1（mCherry+/mVenus-），G1 / S（mCherry+/mVenus+）和S / G2 / M（mCherry^-/mVenus⁺）中接种在DLL4上的细胞与PBS对照的百分比。

6. hESCs分化为血源性内皮细胞

注意:将细胞分化为第 4 天原始 EC，如上文第 3.1-3.6 节所述。

1. 第 5 天:吸出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤细胞。每孔加入1mL新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基，孵育24小时（37°C，5%CO₂）。
2. 第 6 天:每孔用 1 mL 新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。
3. 第7天:每孔用1mL新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育24小时（37°C，5%CO₂）。
4. 第8天:FACS分离血源性内皮细胞（见第7节）。

7. 血源性内皮细胞的FACS分离

1. 按照上述第 4.1-4.6 节所述提起并清洗细胞。
2. 将细胞均匀地分成冰上的微量离心管中，每个离心管至少含有 600 μL 细胞，浓度为 1 x 10⁵ 个细胞/mL，用于抗体染色。
   注意:血源性EC的抗体染色需要八管细胞:未染色对照，CD31单抗体对照，CD45单抗体对照，KDR单抗体对照，c-Kit单抗体对照，CD34单抗体对照，VE-钙粘蛋白单抗体对照，以及含有所有六种抗体的样品。
   注意:抗体信息在 材料表中提供。
3. 酌情向含有细胞的试管中添加抗体，并在冰上孵育并避光30分钟。
   1. 未染色对照:不要添加抗体。
   2. CD31单抗对照:仅添加CD31抗体。
   3. CD45单抗对照:仅添加CD45抗体。
   4. KDR 单抗体对照:仅添加 KDR 抗体。
   5. c-Kit 单抗体对照:仅添加 c-Kit 抗体。
   6. CD34单抗对照:仅添加CD34抗体。
   7. VE-钙粘蛋白单抗体对照:仅添加 VE-钙粘蛋白抗体。
   8. 样品:添加 CD31、CD45、KDR、c-Kit、CD34 和 VE-钙粘蛋白抗体。
      注意:样品中的最终抗体浓度以及荧光偶联物应根据所使用的特异性抗体和细胞分选仪进行优化。
4. 通过在4°C微量离心机中以1，000× g离心5分钟来沉淀细胞。
5. 除去上清液并将沉淀重悬于 600 μL 冰冷的分选缓冲液中。
6. 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，立即进行 FACS。
7. 要获得血源性内皮细胞（CD31 + KDR + c-Kit⁺ CD34 ⁺ VE-钙粘蛋白-CD45^-），请执行以下步骤。
   1. 鉴定CD45-细胞群和门（CD45^-）。
   2. 在（CD45^-）内，鉴定CD31 +细胞群和门（CD31 ⁺）。
   3. 在（CD31⁺）内，鉴定VE-钙粘^{蛋白细胞群} 和门（CDH5^-）。
   4. 在（CDH5-）内，鉴定^c-Kit+细胞群和门（^KIT+）。
   5. 在 （KIT⁺） 内，鉴定 CD34+ 细胞群和门 （CD34⁺）。
   6. 在 （CD34⁺） 中，鉴定 KDR⁺ 细胞并将其分选到 6 mL 冰冷细胞分选缓冲液中。在下游应用中使用这些单元（参见第 8 节）。

8. 菌落形成单位测定

1. 按照制造商的说明解冻甲基纤维素基培养基的等分试样。
   注意:一个 3 mL 等分试样足以用于两个样品，一个 4 mL 等分试样足以用于三个样品。
2. 计数在步骤7.7中获得的分选的血源性内皮细胞。
3. 按照制造商的说明，计算要添加到每个甲基纤维素基培养基等分试样中的分选细胞的体积，以便每个样品至少包含 1，000 个血源性内皮细胞。
   注意:可以根据需要调整单元格数量。
4. 将计算出的细胞体积加入甲基纤维素基培养基等分试样中并彻底涡旋。让基于甲基纤维素的培养基培养物在室温下静置10分钟，或直到气泡消散。
5. 从准备好的35毫米培养皿中吸出纤连蛋白涂层溶液。按照制造商的说明，每 35 mm 培养皿分配 1 mL 基于甲基纤维素的培养基培养物。轻轻旋转培养皿以均匀分布培养物。
6. 将这些 35 mm 培养皿以及另外两个装满无菌水的 35 mm 培养皿放入 15 cm 组织培养皿中。
7. 将培养物在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育，并在第8天和第14天观察培养物。
   1. 在第8天，计数CFU-E和BFU-E菌落。
   2. 在第14天，计算CFU-GM和CFU-GEMM菌落。
      注意:请参阅基于甲基纤维素的培养基手册，了解菌落类型的形态学鉴定。

结果

图1显示了概述hESC的原始EC和血源性EC的规格的示意图，以及电镀后24小时细胞的代表性图像。按照规范，原始EC和血源性EC分别在第5天和第8天纯化FACS。原始EC定义为CD31 + CD45-，血源性EC定义为CD31+ KDR ⁺ c-Kit+ CD34⁺ VE-钙粘蛋白^-CD45^-。用于原始EC和血源性EC纯化的代表性流式细胞术门控策略如图2

讨论

本文概述了使用无小鼠饲养层和无血清的2D培养系统在大约1周内从人胚胎干细胞生产血源性内皮细胞的步骤（图1）。该协议扩展了Sriram等人（2015）描述的方法，以获得原始^{ECs 38}。通过在DLL4包被的平板上培养这些细胞并观察符合动脉规格的基因表达变化，证明了CD31 ⁺ CD45-EC的原始性质和规格潜力（图3）。此外，动脉身...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm dishes	Corning	430599	tissue culture treated
35 mm dishes	Corning	430165	tissue culture treated
6-well plates	Corning	3516	tissue culture treated
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R&D systems	233-FB-025	use at 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispase	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R&D systems	1506-D4/CF	recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Lonza	CC-3162
FACS tubes	Corning	352235	polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectin	ThermoFisher Scientific	33016015	use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Matrix protein  Brand Name: Matrigel	Corning	356230	Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched	Stemcell Technologies	4435
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2	Stemcell Technologies	5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)	Gibco	12040077
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625-50mg	use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix	BioRad	1708840
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μg/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.