ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

要約

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。

要約

血管は体のすべての組織に遍在し、多様な機能を果たしています。したがって、血管内腔を覆う成熟血管内皮細胞のヒト多能性幹細胞からの誘導は、多数の組織工学および再生アプリケーションにとって非常に重要です。in vivoでは、始原内皮細胞は中胚葉系譜に由来し、動脈、静脈、毛細血管、血発生、リンパなどの特定のサブタイプに対して特定されます。血原性内皮細胞は、発生中に造血幹細胞と前駆細胞を生じさせ、それが生涯を通じてすべての血液系統を生成するため、特に興味深いものです。したがって、in vitroで血原性内皮細胞を生成するシステムを作成することは、内皮から造血への移行を研究する機会を提供し、ヒト血液製剤のex vivo産生とヒトドナーへの依存の減少につながる可能性があります。前駆細胞および始原内皮細胞の誘導にはいくつかのプロトコルが存在するが、ヒト幹細胞からの十分に特徴付けられた血原性内皮細胞の生成は記載されていない。ここでは、GSK3β阻害剤(CHIR99021)に応答して形成された原始的な筋細胞による分化プロトコル、bFGFによる中胚葉誘導、BMP4およびVEGF-Aによる始原内皮細胞の発生促進、そして最後にレチノイン酸による血原性内皮細胞仕様の約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導する方法を紹介します。このプロトコルは、それらの分子調節と内皮から造血への移行をさらに理解するために使用できる血原性内皮細胞の明確に定義された集団を生み出し、下流の治療アプリケーションに適用できる可能性があります。

概要

内皮細胞(EC)は、人体全体および操作された組織で複数の機能を果たす細胞の不均一な集団です。これらの機能には、他の細胞型(心筋細胞¹、骨芽細胞²)をサポートおよび調節することに加えて、血液と組織の間に選択的バリアを形成し、組織形成を支援することが含まれます³。正常な発達中の成熟ECの分化には、多様なシグナル伝達経路が必要です。原始ECは中胚葉前駆細胞に由来し、成熟した動脈、静脈、毛細血管、リンパの^表現型4に向けて指定されます。さらに、胚性卵黄嚢および胚性大動脈-生殖腺-中腎(AGM)領域のECの小さなサブセットも、胎児の肝臓と胎児の骨髄に移動する造血幹および前駆細胞(HSPC)を生じさせ、そこで出生後に留まり、生涯を通じてすべての血球タイプを生成します⁴。多様なEC表現型は、すべての組織の発生と維持に不可欠です。

したがって、ECとその誘導体は、ヒトの発生および/または疾患のモデル化およびメカニズムの解明、ならびに再生医療および組織工学の応用を目的とした研究の重要な要素です5,6,7,8。ただし、これらのタイプの研究の主な制限は、必要な量で主要なヒトECが利用できないことです。治療用途の大部分には、最低3 x 10⁸ ECが必要になると推定されています⁶。この問題を解決するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、それらの多様な系統の可能性および多数の子孫を生成する能力のために提案されている^6,9。

実際、hESCまたはhiPS細胞に由来する細胞の有用性は、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングに焦点を当てた複数の研究で実証されている^10、11、12。Organ-on-a-Chip(OOC)技術は、細胞や組織を3次元の足場に統合することにより、人体の生理機能をより忠実に再現するために使用されてきました。さらに、複数の個々のOOC(いわゆるボディオンチップまたはヒューマンオンチップ、BOC / HOC)の接続は、マイクロフルイディクスを介して達成でき、関心のある器官間のクロストークを可能にします¹³、^14、15。血管系などの支持組織は、OOCおよびBOC / HOCの重要な要素です。血管系を組み込むことは、組織全体にわたる栄養素、酸素、およびパラクリン因子の輸送を可能にし、それによって必要な組織特異的微小環境を促進する^3,12。したがって、動脈、静脈、リンパ、および血発生ECなどの成熟ヒトECを導出する方法は、これらの組織工学的アプローチを前進させるために不可欠です。

hESCまたはhiPS細胞からヒト始原性または前駆細胞ECを誘導するためのステップを詳述した複数のプロトコルが公開されている⁵、^16、17、¹⁸、¹⁹、20、21、^22、23、24^、25、26.これらのプロトコルの多くは、ESC/iPS細胞と間質細胞のマウスフィーダー層との胚様体(EB)形成または共培養に依存しています。これらの戦略は、EC収率が低く、および/またはマウス細胞によるヒトECの汚染により、困難で時間がかかる傾向があります。間質細胞を使用せずに2D培養に厳密に依存するプロトコルは、多くの場合、長い誘導を必要とし、誘導のために成長因子および/または阻害剤の複雑な組み合わせを利用し、細胞分離後の拡張期間が長くなる、またはこれらの因子の組み合わせを有する。in vivoでの成熟ECタイプの導出に関与するシグナル伝達経路および因子に関する知識の進歩は、簡単で堅牢なin vitro分化プロトコルの基礎を提供します。

以前は、発生中のマウス動脈および血原性ECの仕様におけるNotchおよびレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路の重要な役割がそれぞれ特定されていました。Notchシグナル伝達経路は、動脈EC表現型の仕様と維持において複数の役割を果たします。マウス網膜血管新生モデルを用いた研究では、流体せん断応力がNotch-Cx37-p27シグナル伝達軸を誘導し、G1細胞周期停止を促進する経路が同定され、動脈EC仕様²⁷が可能になりました。細胞周期の状態は、細胞が遺伝子発現および表現型の変化を誘発することができる特定のシグナルを受け入れる明確な機会の窓を提供することによって、細胞の運命決定において役割を果たすと仮定されている²⁸。このNotchを介したG1停止により、エフリンB2、Cx40、DLL4、Notch1、およびNotch 4などの動脈ECに富む遺伝子の発現が可能になりました(^29,30でレビュー)。また、血原性EC仕様は、RAシグナル伝達を介してインビボで促進されることも示されている^31,32。追加の研究では、RAシグナル伝達の下流で、c-KitとNotchの発現がp27をアップレギュレートし、マウス卵黄嚢と^AGM33の血原性仕様を可能にすることが確認されました。マウスの血原性ECは、内皮(すなわち、CD31、KDR)および造血(すなわち、c-Kit、CD34)マーカーの両方の発現によって最小限に同定することができる⁴。最後に、血原性ECは内皮から造血への移行(EHT)を受けてHSPCを形成し、すべての血球タイプを生じさせる可能性があります^4,34,35。

最近の研究では、この同じシグナル伝達階層がヒト血原性EC仕様を促進できるかどうかをテストしました。そのために、hESCから血発生性ECを誘導するための血清およびフィーダーフリーの2D培養プロトコルが開発され、これらの血発生性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34⁺ VE-カドヘリン- CD45^-として単一細胞レベルで特徴付けられました。この研究では、FUCCIレポーターコンストラクト(H9-FUCCI-hESC)を発現するH9-hESCを使用して、さまざまな細胞周期状態を識別する蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)レポーターも利用しました³⁶。これらの細胞を用いた研究では、RAがECにおける早期G1細胞周期停止を促進し、初期のG1状態がin vitroでの血原性仕様を可能にすることが実証された³⁷。本明細書では、これらのヒト血原性内皮細胞の分化のための詳細なプロトコールおよびそれらの同一性を確認するアッセイが提供される。この簡単な方法は、ヒト血球発生のメカニズムの将来の研究のために、この特殊なECのサブセットを生成するための有用な手段を提供します。

プロトコル

1.試薬および試薬調製

注:試薬のリストは 、材料の表に記載されています。

1. ヒト多能性幹細胞株を入手します:H1-hESC、H9-フッチ-hESC。
   注:血発生性ECの生成は、H1細胞株でより効率的である可能性があります。
2. マトリックスタンパク質ストックの準備:マトリックスタンパク質を事前に冷やした1.5 mLチューブ(氷上)に分注し、各チューブに1 mgのマトリックスタンパク質が含まれるようにします。1 mgのマトリックスタンパク質は、2つの6ウェルプレート(合計12ウェル)のすべてのウェルをコーティングするのに十分です。アリコートは使用するまで-20°Cで保管してください。
   注:マトリックスタンパク質を含むすべてのステップを氷上または4°Cで実行します。 マトリックスタンパク質の凍結ストックバイアルを氷上で4°Cで一晩解凍します。解凍したら、バイアルを回転させて内容物が混合されていることを確認します。1.5 mLマイクロ遠心チューブを-20°Cで少なくとも1時間プレチルし、分注する直前に氷に移します。
3. マトリックスタンパク質コーティングプレートの準備:マトリックスタンパク質アリコートを氷上で4°Cで解凍します。 氷冷したDMEM:F12 12 mLを氷上でプレチルした円錐形チューブに加えます。プレチルドピペットチップを使用して、1アリコート(1 mg)のマトリックスタンパク質をコニカルチューブに移し、上下にピペッティングしてよく混合します。予め冷却された血清学的ピペットを用いて、予め冷却された6ウェルプレート(氷上)の各ウェルに1mLの希釈マトリックスタンパク質を分注する。ウェル全体が均一にコーティングされるようにプレートを旋回させて揺り動かします。プレートを室温で最低30分間インキュベートして、マトリックスタンパク質を固化させます。プレートをパラフィルムで包み、使用するまで4°Cで保存してください。調製後2週間以内にマトリックスタンパク質コーティングプレートを使用してください。
   注:マトリックスタンパク質コーティングされた6ウェルプレートは、細胞の日常的な継代、および始原性および血原性内皮細胞への分化に使用します。氷上ですべての手順を実行します。6ウェルプレート、ピペットチップ、血清ピペット、コニカルチューブをプレチルしてから、-20°Cで1時間以上使用してください。 使用する準備ができたら、これらのアイテムを氷に移します。
4. 多能性幹細胞分化培地100mLにPFHM5mLを添加してベース分化培地を調製する。4°Cで保存してください。
5. 0.1 g BSAを100 mL PBSに溶解して、0.1% BSA-PBSを調製します。フィルターは0.22μmのフィルターを通過させてBSA-PBSを滅菌し、4°Cで保存します。
6. ストックHCl(12 M)を水で1:2,400に希釈して5 mM HClを調製します。NaOHを利用してpHを3.0に調整します。フィルターは0.22μmのフィルターを通過させて溶液を滅菌し、4°Cで保存します。
7. bFGF、BMP4、VEGF-A、レチノイン酸(RA)、およびDLL4ストックを準備します。
   1. bFGF:凍結乾燥粉末を0.1%BSA-PBS中で100 μg/mLに再構成します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から3ヶ月以内にbFGFストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
   2. BMP4:凍結乾燥粉末を5mM HCl、pH 3.0で1 mg/mLに再構成します。さらに0.1%BSA-PBSで50 μg/mLに希釈します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から4か月以内にBMP3ストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
   3. VEGF-A:凍結乾燥粉末を_dH2O中で1 mg/mLに再構成します。さらに0.1%BSA-PBSで100 μg/mLに希釈します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から3ヶ月以内にVEGF-Aストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
   4. RA:凍結乾燥粉末をDMSO中で100mMに再構成する。分注し、-80°Cで保存します。 準備から1ヶ月以内にRA在庫を使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
      注意: RAストックを光から保護してください。
   5. DLL4:凍結乾燥粉末をPBS中で1 mg / mLに再構成します。分注し、-20°Cで保存します。 準備から12か月以内にDLL4ストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
8. 最終濃度がそれぞれ25 ng/mLおよび50 ng/mLになるように、VEGF-AおよびBMP4をベース分化培地で希釈して、使用直前に内皮細胞分化培地を調製します(ステップ1.4)。
9. 使用直前に、100 mMストックをDMSOで1:1,000で100 μMに希釈して、作業RAを準備します。
   注意: 動作中のRAを光から保護してください。
10. VEGF-A、BMP4、ワーキングRAをベース分化培地で希釈し(ステップ1.4)、最終濃度がそれぞれ25 ng/mL、50 ng/mL、0.5 μMになるように、使用直前に血原性内皮細胞分化培地を調製します。
11. 10%FBSを含むHBSSを作製して抗体染色バッファーを調製し、1:500希釈抗菌試薬を補充します。滅菌濾過剤は緩衝液を濾過し、直ちに使用する。
12. 1%FBSを含むHBSSを作製してセルソーティングバッファーを調製し、1:500希釈抗菌試薬を補充します。滅菌濾過剤は緩衝液を濾過し、直ちに使用する。
13. 5 mgの凍結乾燥フィブロネクチンに5 mLの滅菌水を加えて、1 mg/mLのフィブロネクチンストックを準備します。分注し、-20°Cで保存します。 凍結乾燥製品ラベルの有効期限より前にフィブロネクチンストックを使用してください。使用直前にアリコートを解凍してください。
14. フィブロネクチンでコーティングされた35 mmの皿を準備します。フィブロネクチンストック(1 mg / mL)を滅菌水で4 μg / mLに希釈します。.このフィブロネクチンコーティング溶液1 mLを各ディッシュに加え、37°Cで30分から1時間インキュベートします。コーティング直後に皿を使用してください。
15. 製造元の指示に従って、3または4 mLのメチルセルロースベースの培地を調製します。アリコートは使用するまで-20°Cで保管してください。在庫製品ラベルに記載されている有効期限の前にメチルセルロースベースの培地アリコートを使用してください。.使用直前にアリコートを解凍してください。
16. 組換えヒトDLL4ストックをPBSで最終濃度10 μg/mLに希釈して、DLL4コーティング溶液を調製します。
17. 内皮細胞増殖培地は、製造元の指示に従って調製し、保管します。
18. 0.1% BSAを含むPBSを作製することにより、フローサイトメトリー解析バッファーを調製します。バッファーを滅菌ろ過し、使用するまで4°Cで保存します。

2. 細胞培養とhESCの継代

1. マトリックスタンパク質でコーティングされたプレート、幹細胞増殖培地、およびDMEM:F12を室温まで温めます。
2. hESC細胞株を幹細胞増殖培地(2 mL/ウェル)で、マトリックスタンパク質でコーティングされた6ウェルプレート上で、37°C、5%_CO2 インキュベーターで増殖させます。
3. 細胞を毎日チェックし、必要に応じてp200ピペットチップを使用してプレートからそっとこすり落とし、分化した細胞を取り除きます。
   注:分化した細胞はコロニーの周辺に現れます。培養中の分化細胞の例については、幹細胞増殖培地の製品マニュアルを参照してください。
4. 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、細胞を継代します。細胞を継代するには、次の手順を実行します。
   注:分化の増加が発生した場合は、70%〜80%のコンフルエントに達する前に細胞を分割する必要があります。
   1. 細胞の上の培地を取り除き、ウェルあたり1 mL DMEM:F12で穏やかに洗浄します。
   2. ウェルあたり1 mLのDMEM:F12を追加します。
   3. ウェルあたり160 μL/mLのディスパーゼを加え、細胞を5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで45分間インキュベートします。
   4. ディスパーゼインキュベーション後、ウェルあたりDMEM:F12を1 mL追加し、穏やかにピペットで細胞を持ち上げます。
      注:細胞を単一細胞懸濁液に解離することは避けてください。細胞を小さな塊として継代します。
   5. 細胞を12 mLのDMEM:F12を含むコニカルチューブに移し、細胞を重力(~5-10分)で沈降させます。
   6. 上清を除去し、持ち上げた細胞のウェルあたり0.5 mLの幹細胞増殖培地にペレットを静かに再懸濁して、細胞の小さな塊を得ます。
      注:細胞を単一細胞懸濁液に解離することは避けてください。細胞を小さな塊として継代します。
   7. 調製したマトリックスタンパク質コーティングプレートのウェルからマトリックスタンパク質コーティング溶液を吸引し、ウェルあたり1.5 mLの幹細胞増殖培地を追加します。
   8. 所望の量の再懸濁細胞を調製したマトリックスタンパク質コーティングプレートの各ウェルに加える(ステップ2.4.6)。
   9. プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーター内でインキュベートします。24時間ごとに培地を新鮮な幹細胞増殖培地に交換します。

3. hESCの始原内皮細胞への分化

1. 1日目:上記セクション2に記載のように細胞を培養および継代する。細胞を小さな塊(~50μm)に播種し、1平方センチメートルあたり約2塊の密度で播種します(ステップ2.4.6)³⁸。
   注: シード密度を評価し、必要に応じて経験的に調整します。
2. 0日目:細胞を播種してから24時間後、各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。5 μM GSK3iを含むベース分化培地1 mL(CHIR99021、新鮮添加)を各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%_CO2)。
   注意: すべての洗浄ステップで、プレートウェルの壁にピペッティングして、指示された洗浄媒体をプレートにゆっくりと追加します。ウェルの表面全体が洗浄媒体で覆われるように、プレートを静かに回転させます。プレートを少し傾けて、洗浄メディアが6時位置に溜まるようにし、洗浄メディアを慎重に吸引します。
3. 1日目:各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。50 ng/mL bFGF(新鮮、凍結ストックから1:2,000添加)を含むベース分化培地1 mLを各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%_CO2)。
4. 2日目:各ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。内皮細胞分化培地1 mLを各ウェルに加え、24時間インキュベートします(37°C、5%_CO2)。
5. 3日目:細胞を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した内皮細胞分化培地で細胞上の培地に交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%_CO2)。
6. 4日目:細胞上の培地を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した内皮細胞分化培地と交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%_CO2)。
7. 5日目:FACSは細胞を精製してEC表現型を評価するか(セクション4〜5)、培養に保持して血原性内皮細胞に向かって分化させます(セクション6)。

4. 始原内皮細胞のFACS精製

1. 細胞の上に培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で1回穏やかに洗浄します。
2. ウェルあたり1 mLの細胞剥離溶液を加え、37°C、5%CO2インキュベーター内で、または細胞が解離するまで細胞を₁₂ 分間インキュベートします。
3. 解離した細胞を12 mLのDMEM:F12とペレットを含むコニカルチューブに移し、5分間遠心分離してペレットを1,000 x gに移します。
4. 上清を取り除き、ペレットを12 mLのDMEM:F12に再懸濁して洗浄します。
5. 5分間の遠心分離により細胞をペレット化し、1,000 x g。
6. 上清を除去し、細胞ペレットを氷冷抗体染色バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。氷冷抗体染色バッファーを使用して濃度を1 x 10⁵ 細胞/mLに調整します。
7. 抗体染色のために、細胞を氷上のマイクロ遠心チューブに均等に分割し、それぞれに1 x 10⁵ 細胞/mLで最低600 μLの細胞を入れます。
   注:始発ECの染色には、染色されていないコントロール、CD31単一抗体コントロール、CD45単一抗体コントロール、およびCD31抗体とCD45抗体の両方を含むサンプルの4本の細胞チューブが必要です。抗体に関する情報は、 材料表に記載されています。
8. 必要に応じて、細胞を含むチューブに抗体を加え、氷上でインキュベートし、光から30分間保護します。
   1. 無染色コントロール:抗体を添加しないでください。
   2. CD31単一抗体コントロール:CD31抗体のみを追加します。
   3. CD45単一抗体コントロール:CD45抗体のみを追加します。
   4. サンプル:CD31抗体とCD45抗体の両方を追加します。
      注:サンプル中の最終抗体濃度と蛍光コンジュゲートは、使用する特異的抗体とセルソーターに基づいて最適化する必要があります。
9. 4°Cの卓上マイクロ遠心機で1,000 x gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
10. 上清を除去し、細胞ペレットを600 μLの氷冷ソーティングバッファーに再懸濁します。
11. 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、すぐにFACSを実現します。
12. 始原内皮細胞(CD31⁺ CD45^-)を得るには、以下の手順を行う。
    1. CD45陰性細胞集団およびゲート(CD45⁻)を同定する。
    2. (CD45^-)内で、CD31陽性(CD31⁺)細胞集団を特定し、細胞を6 mLの氷冷細胞ソーティングバッファーにソーティングします。これらのセルは、ダウンストリーム アプリケーションに使用します (セクション 5 を参照)。

5. 始原内皮細胞の表現型を確認するアッセイ

1. 6ウェルプレートの3ウェルを1 mL/ウェルのDLL4コーティング溶液で37°C、5%_CO2 インキュベーターで30分間コーティングします。対照として、プレートの他の3つのウェルを1 mL/ウェルPBSでモックコートします。
2. DLL4コーティング溶液およびPBSを吸引し、1ウェルあたり2mLの内皮細胞増殖培地中で25,000個の選別された始原内皮細胞(ステップ4.12を参照)をプレート化する。
3. 細胞を37°C、5%_CO2 インキュベーター内で24時間インキュベートします。
4. 細胞の上に培地を吸引し、2 mL/ウェルPBSで1回洗浄します。qPCRまたはフローサイトメトリー(FUCCIコンストラクトを発現する細胞の場合)で細胞を分析します。
   1. qPCRで細胞を分析するには、次の手順を実行します。
      1. 細胞の上の液体を吸引し、製造元のプロトコルに従ってRNA抽出キットを使用して細胞内のRNAを分離します。
      2. メーカーのプロトコルに従って、逆転写マスターミックスを使用して逆転写反応を実行します。
      3. メーカーのプロトコルに従って、SYBRグリーンマスターミックスを使用してqPCR反応を実行します。
         注:使用したプライマー(EFNB2、GJA5、GJA4、NR2F2、EPHB4、HEY2)を 表1に示します。
   2. FUCCI構築物を発現する細胞をフローサイトメトリーで解析するには、以下のステップを実行します。
      1. 細胞の上に液体を吸引し、500 μL/ウェルの0.25%トリプシン-EDTAを加えます。
      2. 細胞を5%_CO2インキュベーター内で37°Cで持ち上げるまで~5分間インキュベートします。
      3. 細胞をマイクロ遠心チューブに移し、4°Cの微量遠心機で1,000 x gで5分間ペレット化します。
      4. 上清を吸引し、ペレットを500 μLの氷冷フローサイトメトリー分析バッファーに再懸濁します。
      5. 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、細胞を光から保護された氷上に保存して、すぐにフローサイトメトリー分析を行うことができます。
      6. 初期G1(色なし)、後期G1(mCherry+/mVenus-)、G1/S(mCherry+/mVenus+)、およびS/G2/M(mCherry^-/mVenus⁺)のDLL4で播種された細胞の割合をPBSコントロールと比較して分析します。

6. hESCの血原性内皮細胞への分化

注:上記のセクション3.1〜3.6で説明されているように、細胞を4日目の始始ECに分化させます。

1. 5日目:細胞の上に培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDMEM:F12で細胞を穏やかに洗浄します。新たに調製した血液原性内皮細胞分化培地を1ウェルあたり1 mL加え、24時間インキュベートします(37°C、5%_CO2)。
2. 6日目:細胞上の培地をウェルあたり1 mLの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地と交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%_CO2)。
3. 7日目:細胞を1ウェルあたり1 mLの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地で細胞上の培地を交換し、24時間インキュベートする(37°C、5%_CO2)。
4. 8日目:FACSは血原性内皮細胞を分離します(セクション7を参照)。

7.FACS-血原性内皮細胞の分離

1. 上記のセクション4.1〜4.6で説明したように、セルを持ち上げて洗浄します。
2. 抗体染色のために、細胞を氷上のマイクロ遠心チューブに均等に分割し、それぞれに1 x 10⁵ 細胞/mLで最低600 μLの細胞を入れます。
   注:血原性ECの抗体染色には、無染色コントロール、CD31シングル抗体コントロール、CD45シングル抗体コントロール、KDRシングル抗体コントロール、c-Kitシングル抗体コントロール、CD34シングル抗体コントロール、VE-カドヘリンシングル抗体コントロール、および6つの抗体すべてを含むサンプルの8本の細胞チューブが必要です。
   注:抗体情報は 材料表に記載されています。
3. 必要に応じて、細胞を含むチューブに抗体を加え、氷上でインキュベートし、光から30分間保護します。
   1. 非染色コントロール:抗体を添加しないでください。
   2. CD31単一抗体コントロール:CD31抗体のみを追加します。
   3. CD45単一抗体コントロール:CD45抗体のみを追加します。
   4. KDR単一抗体コントロール:KDR抗体のみを追加します。
   5. c-Kit単一抗体コントロール:c-Kit抗体のみを追加します。
   6. CD34単一抗体コントロール:CD34抗体のみを追加します。
   7. VE-カドヘリン単一抗体コントロール:VE-カドヘリン抗体のみを追加します。
   8. サンプル:CD31、CD45、KDR、c-Kit、CD34、およびVE-カドヘリン抗体を追加します。
      注:サンプル中の最終抗体濃度と蛍光コンジュゲートは、使用する特異的抗体とセルソーターに基づいて最適化する必要があります。
4. 4°Cのマイクロ遠心機で1,000 x gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
5. 上清を除去し、ペレットを600 μLの氷冷ソーティングバッファーに再懸濁します。
6. 5 mL FACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保管して、すぐにFACSを実現します。
7. 血原性内皮細胞(CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34⁺ VE-カドヘリン-CD45^-)を取得するには、以下の手順を実行します。
   1. CD45-細胞集団およびゲート(CD45^-)を同定する。
   2. (CD45^-)内で、CD31+細胞集団をゲート(CD31⁺)と同定する。
   3. (CD31⁺)内で、VE-カドヘリン-細胞集団およびゲート(CDH5^-)を同定する。
   4. (CDH5-)内で、^c-Kit+細胞集団およびゲート(KIT⁺)を同定する。
   5. (KIT+)内で、CD34+細胞集団とゲート(CD34⁺)を特定します。
   6. (CD34+)内で、KDR⁺細胞を同定し、6 mLの氷冷セルソーティングバッファーにソーティングします。これらのセルをダウンストリーム アプリケーションで使用します (セクション 8 を参照)。

8.コロニー形成ユニットアッセイ

1. 製造元の指示に従って、メチルセルロースベースの培地のアリコートを解凍します。
   注:2つのサンプルには1つの3 mLアリコートで十分であり、3つのサンプルには1つの4 mLアリコートで十分です。
2. ステップ7.7で得られた選別された血原性内皮細胞をカウントする。
3. 製造元の指示に従って、各サンプルに最低1,000個の血原性内皮細胞が含まれるように、各メチルセルロースベースの培地アリコートに追加する選別された細胞の量を計算します。
   注:セルの数は必要に応じて調整できます。
4. 計算された細胞量をメチルセルロースベースの培地アリコートとボルテックスに完全に加えます。メチルセルロースベースの培地培養物を室温で10分間、または気泡が消散するまで放置します。
5. 準備した35 mmディッシュからフィブロネクチンコーティング溶液を吸引します。製造元の指示に従って、35 mmディッシュあたり1 mLのメチルセルロースベースの培地培養液を分注します。皿を静かに回転させて、文化を均等に分配します。
6. これらの35 mmディッシュと、滅菌水で満たされた追加の35 mmディッシュ2つを、15 cmの組織培養ディッシュ内に置きます。
7. 培養物を37°C、5%_CO2 インキュベーター内でインキュベートし、8日目および14日目に培養物を観察する。
   1. 8日目に、CFU-EおよびBFU-Eコロニーを数えます。
   2. 14日目に、CFU-GMおよびCFU-GEMMコロニーを数えます。
      注:コロニータイプの形態学的同定については、メチルセルロースベースの培地マニュアルを参照してください。

結果

hESC由来の始原ECおよび血原性ECの仕様を概説した模式図と、めっき後24時間後の細胞の代表的な画像を図1に示します。仕様に従い、始原ECおよび血原性ECは、それぞれ5日目および8日目にFACS精製される。原始ECはCD31+ CD45-と定義され、血原性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34⁺ VE-カドヘリン-CD45^-と定義される。始原ECおよ?...

ディスカッション

本明細書では、マウスフィーダーおよび無血清2D培養システム(図1)を用いて、約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を作製するステップを概説する。このプロトコルは、Sriramら(2015)によって記述された方法を拡張して、原始^EC38を取得します。CD31⁺ CD45-ECの原始的な性質と仕様の可能性は、これらの細胞をDLL4コーティングプレート...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm dishes	Corning	430599	tissue culture treated
35 mm dishes	Corning	430165	tissue culture treated
6-well plates	Corning	3516	tissue culture treated
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R&D systems	233-FB-025	use at 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispase	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R&D systems	1506-D4/CF	recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Lonza	CC-3162
FACS tubes	Corning	352235	polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectin	ThermoFisher Scientific	33016015	use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Matrix protein  Brand Name: Matrigel	Corning	356230	Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched	Stemcell Technologies	4435
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2	Stemcell Technologies	5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)	Gibco	12040077
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625-50mg	use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix	BioRad	1708840
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μg/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.