Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Resumo

Os vasos sanguíneos são distribuídos de forma onipresente em todos os tecidos do corpo e desempenham diversas funções. Assim, a derivação de células endoteliais vasculares maduras, que revestem lúmens de vasos sanguíneos, a partir de células-tronco pluripotentes humanas é crucial para uma infinidade de aplicações de engenharia e regeneração de tecidos. In vivo, as células endoteliais primordiais são derivadas da linhagem mesodérmica e são especificadas para subtipos específicos, incluindo arteriais, venosas, capilares, hemogênicas e linfáticas. As células endoteliais hemogênicas são de particular interesse porque, durante o desenvolvimento, dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, que geram todas as linhagens sanguíneas ao longo da vida. Assim, a criação de um sistema para gerar células endoteliais hemogênicas in vitro proporcionaria uma oportunidade para estudar a transição endotelial para hematopoiética e poderia levar à produção ex vivo de produtos sanguíneos humanos e à redução da dependência de doadores humanos. Embora existam vários protocolos para a derivação de células endoteliais progenitoras e primordiais, a geração de células endoteliais hemogênicas bem caracterizadas a partir de células-tronco humanas não foi descrita. Aqui, um método para a derivação de células endoteliais hemogênicas de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana é apresentado: um protocolo de diferenciação com células estriadas primitivas formadas em resposta ao inibidor de GSK3β (CHIR99021), depois indução de linhagem mesodérmica mediada por bFGF, seguida de desenvolvimento de células endoteliais primordiais promovidas por BMP4 e VEGF-A e, finalmente, especificação de células endoteliais hemogênicas induzida por ácido retinóico. Este protocolo produz uma população bem definida de células endoteliais hemogênicas que podem ser usadas para entender melhor sua regulação molecular e transição endotelial-hematopoiética, que tem o potencial de ser aplicada a aplicações terapêuticas a jusante.

Introdução

As células endoteliais (CEs) são uma população heterogênea de células que desempenham múltiplas funções em todo o corpo humano e em tecidos modificados. Além de apoiar e regular outros tipos de células (ou seja, cardiomiócitos¹, células osteoblásticas²), essas funções incluem a formação de uma barreira seletiva entre sangue e tecidos e auxiliam na formação de tecidos³. A diferenciação de CEs maduras durante o desenvolvimento normal requer diversas vias de sinalização. As CEs primordiais são derivadas de progenitores mesodérmicos e, em seguida, são especificadas para fenótipos arteriais, venosos, c....

Protocolo

1. Reagentes e preparação de reagentes

NOTA: Uma lista de reagentes é fornecida na Tabela de Materiais.

1. Obter as linhagens de células-tronco pluripotentes humanas: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
   NOTA: A geração de CEs hemogênicas pode ser mais eficiente na linhagem celular H1.
2. Preparar estoques de proteína da matriz: Aliquotar a proteína da matriz em tubos pré-resfriados de 1,5 mL (no gelo) para que cada tubo contenha 1 mg de proteína da matriz. 1 mg de proteína da matriz é suficiente para revestir todos os poços de duas placas de 6 poços (12 poços no total). Conservar as alíquotas a -20 °C até à sua utiliza....

Resultados

Um esquema delineando a especificação de CEs primordiais e CEs hemogênicas de hESCs e uma imagem representativa das células 24 h após o revestimento são mostradas na Figura 1. Seguindo a especificação, CEs primordiais e CEs hemogênicas são FACS purificadas nos dias 5 e 8, respectivamente. As CEs primordiais são definidas como CD31+ CD45- e as CEs hemogênicas são definidas como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34⁺ VE-Cadherin-CD45

Discussão

Neste documento, descrevem-se os passos para a produção de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana usando um sistema de cultura 2D livre de murino e soro (Figura 1). Esse protocolo expande um método descrito por Sriram et al. (2015) para obter CEs primordiais³⁸. A natureza primordial e o potencial de especificação dos CD31⁺ CD45^- ECs são demonstrados pela cultura dessas.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm dishes	Corning	430599	tissue culture treated
35 mm dishes	Corning	430165	tissue culture treated
6-well plates	Corning	3516	tissue culture treated
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R&D systems	233-FB-025	use at 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispase	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R&D systems	1506-D4/CF	recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Lonza	CC-3162
FACS tubes	Corning	352235	polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectin	ThermoFisher Scientific	33016015	use at 4 mg/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Matrix protein  Brand Name: Matrigel	Corning	356230	Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched	Stemcell Technologies	4435
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2	Stemcell Technologies	5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)	Gibco	12040077
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625-50mg	use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix	BioRad	1708840
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μg/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.