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Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Resumo

Os vasos sanguíneos são distribuídos de forma onipresente em todos os tecidos do corpo e desempenham diversas funções. Assim, a derivação de células endoteliais vasculares maduras, que revestem lúmens de vasos sanguíneos, a partir de células-tronco pluripotentes humanas é crucial para uma infinidade de aplicações de engenharia e regeneração de tecidos. In vivo, as células endoteliais primordiais são derivadas da linhagem mesodérmica e são especificadas para subtipos específicos, incluindo arteriais, venosas, capilares, hemogênicas e linfáticas. As células endoteliais hemogênicas são de particular interesse porque, durante o desenvolvimento, dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, que geram todas as linhagens sanguíneas ao longo da vida. Assim, a criação de um sistema para gerar células endoteliais hemogênicas in vitro proporcionaria uma oportunidade para estudar a transição endotelial para hematopoiética e poderia levar à produção ex vivo de produtos sanguíneos humanos e à redução da dependência de doadores humanos. Embora existam vários protocolos para a derivação de células endoteliais progenitoras e primordiais, a geração de células endoteliais hemogênicas bem caracterizadas a partir de células-tronco humanas não foi descrita. Aqui, um método para a derivação de células endoteliais hemogênicas de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana é apresentado: um protocolo de diferenciação com células estriadas primitivas formadas em resposta ao inibidor de GSK3β (CHIR99021), depois indução de linhagem mesodérmica mediada por bFGF, seguida de desenvolvimento de células endoteliais primordiais promovidas por BMP4 e VEGF-A e, finalmente, especificação de células endoteliais hemogênicas induzida por ácido retinóico. Este protocolo produz uma população bem definida de células endoteliais hemogênicas que podem ser usadas para entender melhor sua regulação molecular e transição endotelial-hematopoiética, que tem o potencial de ser aplicada a aplicações terapêuticas a jusante.

Introdução

As células endoteliais (CEs) são uma população heterogênea de células que desempenham múltiplas funções em todo o corpo humano e em tecidos modificados. Além de apoiar e regular outros tipos de células (ou seja, cardiomiócitos1, células osteoblásticas2), essas funções incluem a formação de uma barreira seletiva entre sangue e tecidos e auxiliam na formação de tecidos3. A diferenciação de CEs maduras durante o desenvolvimento normal requer diversas vias de sinalização. As CEs primordiais são derivadas de progenitores mesodérmicos e, em seguida, são especificadas para fenótipos arteriais, venosos, capilares e linfáticos maduros4. Além disso, um pequeno subconjunto de CEs no saco vitelino extraembrionário e na região embrionária da Aorta-Gônada-Mesonférfos (AGM) também é especificado para se tornar CEs hemogênicas, que dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) que migram para o fígado fetal e a medula óssea fetal, onde permanecem no pós-natal e geram todos os tipos de células sanguíneas ao longo da vida4. A gama diversificada de fenótipos de CE é essencial para todo o desenvolvimento e manutenção dos tecidos.

Assim, as CEs e seus derivados são componentes críticos de estudos voltados para modelar e elucidar mecanismos de desenvolvimento humano e/ou doenças, bem como aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos 5,6,7,8. No entanto, a principal limitação para esses tipos de estudos é a falta de disponibilidade de CEs humanas primárias na quantidade necessária. Estima-se que um mínimo de 3 x 108 CEs seria necessário para a maioria das aplicações terapêuticas6. Para resolver esse problema, o uso de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) tem sido proposto devido ao seu potencial de linhagem diversificada e sua capacidade de gerar um grande número de progênies 6,9.

De fato, a utilidade de células derivadas de hESCs ou hiPSCs tem sido demonstrada em múltiplos estudos focados em modelagem de doenças e rastreamento de drogas10,11,12. A tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) tem sido usada para recapitular mais fielmente a fisiologia do corpo humano, integrando células e tecidos em andaimes tridimensionais. Além disso, a conexão de múltiplos OOCs individuais (o chamado corpo-ou-humano-em-um-chip, BOC/HOC) pode ser realizada via microfluídica para permitir o crosstalk entre os órgãos de interesse13,14,15. Tecidos de suporte, como a vasculatura, são componentes críticos de OOCs e BOC/HOCs; a incorporação de vasculatura permite o transporte de nutrientes, oxigênio e fatores parácrinos por todos os tecidos, promovendo assim o microambiente tecidual específico necessário 3,12. Assim, métodos para derivar CEs humanas maduras, como CEs arteriais, venosas, linfáticas e hemogênicas, são cruciais para o avanço dessas abordagens de engenharia de tecidos.

Vários protocolos foram publicados detalhando etapas para a derivação de ECs primordiais ou progenitoras humanas de hESCs ou hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Muitos desses protocolos dependem da formação de corpos embrionários (EB) ou co-cultura de ESCs/iPSCs com uma camada alimentadora murina de células estromais. Essas estratégias tendem a ser difíceis e demoradas, com baixos rendimentos de CE e/ou contaminação de CEs humanas com células murinas. Protocolos que dependem estritamente da cultura 2D sem o uso de células estromais geralmente requerem induções longas, utilizam combinações complexas de fatores de crescimento e / ou inibidores para indução, têm longos períodos de expansão após a separação celular ou uma combinação desses fatores. O avanço do conhecimento das vias de sinalização e dos fatores envolvidos na derivação de tipos maduros de CE in vivo fornece as bases para um protocolo de diferenciação in vitro simples e robusto.

Anteriormente, foram identificados papéis-chave para as vias de sinalização de Notch e Ácido Retinóico (AR) na especificação de CEs murinas e hemogênicas, respectivamente, durante o desenvolvimento. A via de sinalização Notch desempenha múltiplos papéis na especificação e manutenção do fenótipo arterial da CE. O trabalho utilizando o modelo de vascularização murina da retina identificou uma via na qual o estresse por cisalhamento de líquidos induz um eixo de sinalização Notch-Cx37-p27, promovendo a parada do ciclo celular G1, o que possibilita a especificação da CE arterial27. A hipótese de que os estados do ciclo celular desempenham um papel nas decisões de destino celular, fornecendo janelas de oportunidade distintas nas quais as células são receptivas a certos sinais que podem induzir a expressão gênica e mudanças fenotípicas28. Essa parada G1 mediada por Notch permitiu a expressão de genes enriquecidos em ECs arteriais, incluindo efrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (revisado em29,30). Também foi demonstrado que a especificação hemogênica da CE é promovida in vivo via sinalização daAR 31,32. Estudos adicionais identificaram que, a jusante da sinalização da AR, a expressão de c-Kit e Notch regulam a p27, o que possibilita a especificação hemogênica no saco vitelino murino e AGM33. As CEs hemogênicas murinas podem ser minimamente identificadas pela expressão de marcadores endoteliais (ou seja, CD31, KDR) e hematopoiéticos (ou seja, c-Kit, CD34)4. Por fim, as CEs hemogênicas passam por uma transição endotelial-hematopoiética (EHT) para a formação de HSPCs, o que pode dar origem a todos os tipos de células sanguíneas 4,34,35.

Trabalhos recentes testaram se essa mesma hierarquia de sinalização pode promover a especificação hemogênica humana da CE. Para tanto, foi desenvolvido um protocolo de cultura 2D sem soro e alimentador para derivar CEs hemogênicas de hESCs, e essas CEs hemogênicas foram caracterizadas em um único nível celular como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Este estudo também aproveitou o relator Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), que identifica diferentes estados do ciclo celular, utilizando H9-hESCs que expressam o construto repórter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Em estudos com essas células, demonstrou-se que a AR promove a parada precoce do ciclo celular G1 nas CEs, e o estado G1 precoce permite a especificação hemogênica in vitro37. Neste documento, um protocolo detalhado para a diferenciação dessas células endoteliais hemogênicas humanas e ensaios confirmando sua identidade são fornecidos. Este método simples fornece um meio útil de gerar este subconjunto especializado de CEs para estudos futuros de mecanismos de desenvolvimento de células sanguíneas humanas.

Protocolo

1. Reagentes e preparação de reagentes

NOTA: Uma lista de reagentes é fornecida na Tabela de Materiais.

  1. Obter as linhagens de células-tronco pluripotentes humanas: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    NOTA: A geração de CEs hemogênicas pode ser mais eficiente na linhagem celular H1.
  2. Preparar estoques de proteína da matriz: Aliquotar a proteína da matriz em tubos pré-resfriados de 1,5 mL (no gelo) para que cada tubo contenha 1 mg de proteína da matriz. 1 mg de proteína da matriz é suficiente para revestir todos os poços de duas placas de 6 poços (12 poços no total). Conservar as alíquotas a -20 °C até à sua utilização.
    NOTA: Execute todas as etapas que envolvem a proteína da matriz no gelo ou a 4 °C. Descongele o frasco para injetáveis congelado de proteína da matriz no gelo a 4 °C durante a noite. Uma vez descongelado, agite o frasco para injetáveis para garantir que o conteúdo está misturado. Pré-arrefecer tubos de microcentrífuga de 1,5 ml durante, pelo menos, 1 h a -20 °C e transferir para o gelo imediatamente antes da alíquota.
  3. Preparar placas revestidas de proteína da matriz: Descongelar as alíquotas da proteína da matriz no gelo a 4 °C. Adicione 12,5 mL de DMEM:F12 gelado a um tubo cônico pré-resfriado sobre gelo. Utilizando pontas de pipeta pré-resfriadas, transfira uma alíquota (1 mg) de proteína da matriz para o tubo cônico e misture bem pipetando para cima e para baixo. Aliquot 1 mL da proteína da matriz diluída para cada poço de placas de 6 poços pré-resfriadas (em gelo) usando uma pipeta sorológica pré-resfriada. Gire e agite as placas para que todo o poço seja revestido uniformemente. Incubar as placas por um período mínimo de 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que a proteína da matriz se solidifique. Envolver as placas com parafilme e conservar a 4 °C até à utilização. Use placas revestidas de proteína da matriz dentro de 2 semanas após a preparação.
    NOTA: Utilizar as placas de 6 poços revestidas de proteína da matriz para a passagem rotineira das células e diferenciação para células endoteliais primordiais e hemogênicas. Execute todas as etapas no gelo. Pré-refrigerar placas de 6 poços, pontas de pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos antes do uso por pelo menos 1 h a -20 °C. Transfira esses itens para o gelo quando estiver pronto para uso.
  4. Preparar o meio de diferenciação de base adicionando 5 mL de PFHM a 100 mL de meio pluripotente de diferenciação de células-tronco. Conservar a 4 °C.
  5. Preparar 0,1% de BSA-PBS dissolvendo 0,1 g de BSA em 100 mL de PBS. Filtrar esterilizar BSA-PBS passando por um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
  6. Preparar HCl 5 mM diluindo o estoque HCl (12 M) 1:2.400 com água. Ajuste o pH para 3,0 utilizando NaOH. Esterilizar a solução passando por um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
  7. Prepare os estoques de bFGF, BMP4, VEGF-A, ácido retinóico (RA) e DLL4.
    1. bFGF: Reconstituir o pó liofilizado a 100 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Use estoques de bFGF dentro de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
    2. BMP4: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em HCl 5mM, pH 3,0. Diluir ainda mais para 50 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Utilize as existências BMP4 no prazo de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
    3. VEGF-A: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em dH2O. Diluir ainda mais para 100 μg/mL em BSA-PBS a 0,1%. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de VEGF-A dentro de 3 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
    4. AR: Reconstituir o pó liofilizado a 100 mM em DMSO. Alíquota e conservar a -80 °C. Use os estoques de RA dentro de 1 mês após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
      NOTA: Proteja os estoques de RA da luz.
    5. DLL4: Reconstituir o pó liofilizado para 1 mg/mL em PBS. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de DLL4 dentro de 12 meses após a preparação. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
  8. Preparar o meio de diferenciação de células endoteliais imediatamente antes da utilização, diluindo VEGF-A e BMP4 em meio de diferenciação de base (passo 1.4) de modo a que as concentrações finais sejam de 25 ng/ml e 50 ng/ml, respetivamente.
  9. Preparar o RA de trabalho imediatamente antes da utilização, diluindo 100 mM de 1:1.000 em DMSO a 100 μM.
    NOTA: Proteja o RA de trabalho da luz.
  10. Preparar o meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas imediatamente antes do uso, diluindo VEGF-A, BMP4 e AR de trabalho em meio de diferenciação de base (etapa 1.4) de modo que as concentrações finais sejam de 25 ng/mL, 50 ng/mL e 0,5 μM, respectivamente.
  11. Prepare o tampão de coloração de anticorpos fazendo HBSS contendo 10% de FBS e complemente com 1:500 reagente antimicrobiano diluído. Filtro estéril do buffer e use imediatamente.
  12. Prepare o tampão de classificação celular fazendo HBSS contendo 1% de FBS e complemente com 1:500 reagente antimicrobiano diluído. Filtro estéril do buffer e use imediatamente.
  13. Prepare 1 mg/mL de estoques de fibronectina adicionando 5 mL de água estéril a 5 mg de fibronectina liofilizada. Alíquota e conservar a -20 °C. Use os estoques de fibronectina antes do prazo de validade no rótulo do produto liofilizado. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
  14. Prepare os pratos de 35 mm revestidos de fibronectina. Diluir os estoques de fibronectina (1 mg/mL) a 4 μg/mL em água estéril. Adicionar 1 ml desta solução de revestimento de fibronectina a cada prato e incubar a 37 °C durante 30 min a 1 h. Use os pratos imediatamente após o revestimento.
  15. Prepare alíquotas de 3 ou 4 mL de meio à base de metilcelulose seguindo as instruções do fabricante. Conservar as alíquotas a -20 °C até à sua utilização. Utilizar as alíquotas do meio à base de metilcelulose antes do prazo de validade indicado no rótulo do produto de reserva. Descongele as alíquotas imediatamente antes do uso.
  16. Preparar a solução de revestimento DLL4 diluindo o stock de DLL4 humano recombinante até uma concentração final de 10 μg/ml em PBS.
  17. Preparar e armazenar o meio de crescimento de células endoteliais de acordo com as instruções do fabricante.
  18. Prepare o tampão de análise de citometria de fluxo fazendo PBS contendo 0,1% de BSA. Filtrar o tampão estéril e conservar a 4 °C até à sua utilização.

2. Cultura celular e passagem de hESCs

  1. Permita que as placas revestidas de proteína da matriz, o meio de crescimento de células-tronco e o DMEM:F12 aqueçam até a temperatura ambiente.
  2. Cultivar as linhagens celulares hESC em meio de crescimento de células-tronco (2 mL/poço) em placas de 6 poços revestidas de proteína da matriz em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5%.
  3. Verifique as células diariamente e remova as células diferenciadas conforme necessário, raspando-as suavemente da placa usando uma ponta de pipeta p200.
    NOTA: Células diferenciadas aparecerão na periferia das colônias. Consulte o manual do produto do meio de crescimento de células-tronco para obter exemplos de células diferenciadas em cultura.
  4. Passe as células uma vez que atinjam 70% -80% de confluência. Para passar células, execute as etapas a seguir.
    NOTA: As células devem ser divididas antes de atingir 70%-80% de confluência se ocorrer aumento da diferenciação.
    1. Retire o meio acima das células e lave suavemente com 1 mL de DMEM:F12 por poço.
    2. Adicione 1 mL de DMEM:F12 por poço.
    3. Adicionar 160 μL/mL de Dispase por poço e incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 45 min.
    4. Após a incubação Dispase, adicione mais 1 mL de DMEM:F12 por poço e pipete suavemente para levantar as células.
      NOTA: Evite dissociar as células em uma suspensão de célula única. Passe as células como pequenos aglomerados.
    5. Transfira as células para um tubo cônico contendo 12 mL de DMEM:F12 e permita que as células se depositem por gravidade (~5-10 min).
    6. Remova o sobrenadante e ressuscite suavemente o pellet em 0,5 mL de meio de crescimento de células-tronco por poço de células levantadas para obter pequenos aglomerados de células.
      NOTA: Evite dissociar as células em uma suspensão de célula única. Passe as células como pequenos aglomerados.
    7. Aspirar a solução de revestimento de proteína da matriz dos poços da placa revestida de proteína da matriz preparada e adicionar 1,5 mL do meio de crescimento de células-tronco por poço.
    8. Adicionar o volume desejado de células ressuspensas (etapa 2.4.6) a cada alvéolo da placa revestida de proteínas da matriz preparada.
    9. Incubar a placa numa incubadora de 37 °C, 5% de CO2 . Mude o meio a cada 24 h para o meio de crescimento de células-tronco frescas.

3. Diferenciação de hESCs em células endoteliais primordiais

  1. Dia -1: Cultura e passagem das células conforme descrito acima na seção 2. Semeia as células (passo 2.4.6) em pequenos aglomerados (~50 μm) a uma densidade de aproximadamente 2 aglomerados por centímetro quadrado38.
    NOTA: Avalie a densidade da semente e refine empiricamente, se necessário.
  2. Dia 0: 24 h após a semeadura das células, aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de base contendo 5 μM GSK3i (CHIR99021, adicionado fresco) a cada poço e incubar por 24 h (37 °C, 5% CO2).
    NOTA: Para todas as etapas de lavagem, adicione lentamente o meio de lavagem indicado à placa pipetando contra a parede do poço da placa. Gire suavemente a placa de modo que toda a superfície do poço seja coberta por meios de lavagem. Incline ligeiramente a placa de modo a que o meio de lavagem se acumule na posição das seis horas e aspirar cuidadosamente o meio de lavagem.
  3. Dia 1: Aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de base contendo 50 ng/mL de bFGF (adicionado fresco, 1:2.000 de estoque congelado) a cada poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
  4. Dia 2: Aspirar o meio de cada poço e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL do meio de diferenciação de células endoteliais a cada poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
  5. Dia 3: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
  6. Dia 4: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
  7. Dia 5: FACS purificar as células para avaliar o fenótipo CE (secções 4-5) ou manter em cultura e diferenciar para células endoteliais hemogénicas (secção 6).

4. Purificação FACS de células endoteliais primordiais

  1. Aspirar o meio acima das células e lavar suavemente uma vez com 1 mL de DMEM:F12 por poço.
  2. Adicionar 1 ml de solução de descolamento celular por alvéolo e incubar as células durante 12 min numa incubadora de CO2 a 37 °C, a 5%, ou até que as células se dissociassem.
  3. Transferir as células dissociadas para um tubo cônico contendo 12 mL de DMEM:F12 e pellet por centrifugação por 5 min, 1.000 x g.
  4. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 12 mL de DMEM:F12 para lavar.
  5. Pellet as células por centrifugação por 5 min, 1.000 x g.
  6. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em tampão de coloração de anticorpos gelados e conte as células. Ajustar a concentração utilizando tampão de coloração de anticorpos gelados para 1 x 105 células/ml.
  7. Divida as células uniformemente em tubos de microcentrífuga sobre gelo, cada um contendo um mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/mL, para coloração de anticorpos.
    NOTA: Quatro tubos de células são necessários para a coloração de CEs primordiais: controle não corado, controle de anticorpos únicos CD31, controle de anticorpos únicos CD45 e amostra contendo anticorpos CD31 e CD45. Informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais.
  8. Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo e protegido da luz por 30 min.
    1. Controle não corado: Não adicione nenhum anticorpo.
    2. Controle de anticorpos CD31 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD31.
    3. Controle de anticorpos CD45 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD45.
    4. Amostra: Adicione anticorpos CD31 e CD45.
      NOTA: A concentração final de anticorpos na amostra, bem como os conjugados fluorescentes, devem ser otimizados com base nos anticorpos específicos e no classificador celular usado.
  9. Pellet as células por centrifugação numa microcentrífuga de mesa de 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
  10. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets de células em 600 μL de tampão de classificação gelado.
  11. Coe as amostras através das tampas de filtro de malha de tubos FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para FACS imediato.
  12. Obtenha células endoteliais primordiais (CD31+ CD45-), executando as seguintes etapas.
    1. Identifique a população e a porta de células CD45-negativas (CD45-).
    2. Dentro de (CD45-), identifique a população de células CD31-positivas (CD31+) e classifique as células em 6 mL de tampão de classificação de células geladas. Utilize estas células para aplicações a jusante (ver secção 5).

5. Ensaio para confirmar o fenótipo de células endoteliais primordiais

  1. Revestir três poços de uma placa de 6 poços com solução de revestimento DLL4 de 1 mL/poço por 30 min em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5%. Como controle, simular os outros três poços da placa com 1 mL/poço PBS.
  2. Aspirar a solução de revestimento DLL4 e PBS e chapear 25.000 células endoteliais primordiais classificadas (ver etapa 4.12) em 2 mL de meio de crescimento de células endoteliais por poço.
  3. Incubar as células por 24 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 .
  4. Aspirar o meio acima das células e lavar uma vez com 2 mL/poço PBS. Analise as células por qPCR ou citometria de fluxo (para células que expressam o construto FUCCI).
    1. Para analisar as células por qPCR, execute as etapas a seguir.
      1. Aspirar o líquido acima das células e isolar o RNA nas células usando um kit de extração de RNA de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Realize reações de transcrição reversa com uma mistura mestre de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
      3. Realize reações de qPCR com uma master mix SYBR Green de acordo com o protocolo do fabricante.
        NOTA: Os primers utilizados (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) estão listados na Tabela 1.
    2. Para analisar as células que expressam o construto FUCCI por citometria de fluxo, execute as etapas a seguir.
      1. Aspirar o líquido acima das células e adicionar 500 μL/poço 0,25% de tripsina-EDTA.
      2. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% até serem levantadas, ~5 min.
      3. Transfira as células para um tubo de microcentrífuga e coloque as células em uma microcentrífuga de 4 °C por 5 min a 1.000 x g.
      4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão de análise de citometria de fluxo gelado.
      5. Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de um tubo FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para análise imediata da citometria de fluxo.
      6. Analise a porcentagem de células banhadas no DLL4 vs. controle PBS no início do G1 (sem cor), G1 tardio (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) e S/G2/M (mCherry-/mVenus+).

6. Diferenciação de hESCs em células endoteliais hemogênicas

NOTA: Diferenciar as células das CEs primordiais do dia 4, conforme descrito acima nas seções 3.1-3.6.

  1. Dia 5: Aspirar o meio acima das células e lavar suavemente as células com 1 mL de DMEM:F12 por poço. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incubar 24 h (37 °C, 5% de CO2).
  2. Dia 6: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% de CO2).
  3. Dia 7: Substitua o meio acima das células por 1 mL de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube 24 h (37 °C, 5% CO2).
  4. Dia 8: FACS isola células endoteliais hemogénicas (ver secção 7).

7. FACS-isolamento de células endoteliais hemogênicas

  1. Levantar e lavar as células conforme descrito acima nas secções 4.1-4.6.
  2. Divida as células uniformemente em tubos de microcentrífuga sobre gelo, cada um contendo um mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/mL, para coloração de anticorpos.
    NOTA: Oito tubos de células são necessários para a coloração de anticorpos de CEs hemogênicas: controle não corado, controle de anticorpos únicos CD31, controle de anticorpos únicos CD45, controle de anticorpos únicos KDR, controle de anticorpos únicos c-Kit, controle de anticorpos únicos CD34, controle de anticorpos únicos VE-caderina e amostra contendo todos os seis anticorpos.
    NOTA: As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais.
  3. Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo e protegido da luz por 30 min.
    1. Controle não corado: Não adicione anticorpos.
    2. Controle de anticorpos CD31 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD31.
    3. Controle de anticorpos CD45 únicos: Adicione apenas o anticorpo CD45.
    4. Controle de anticorpos únicos KDR: Adicione apenas anticorpos KDR.
    5. Controle de anticorpos únicos c-Kit: Adicione apenas o anticorpo c-Kit.
    6. Controle de anticorpos CD34 únicos: Adicione apenas anticorpos CD34.
    7. Controle de anticorpos únicos de VE-caderina: Adicione apenas o anticorpo VE-caderina.
    8. Amostra: Adicione anticorpos CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 e VE-caderina.
      NOTA: A concentração final de anticorpos na amostra, bem como os conjugados fluorescentes, devem ser otimizados com base nos anticorpos específicos e no classificador celular usado.
  4. Pellet as células por centrifugação numa microcentrífuga a 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
  5. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 600 μL de tampão de triagem gelado.
  6. Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de tubos FACS de 5 mL e armazene as células no gelo, protegidas da luz, para FACS imediato.
  7. Para obter células endoteliais hemogênicas (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Caderina-CD45-), execute as seguintes etapas.
    1. Identifique a população e a porta de células CD45- (CD45-).
    2. Dentro (CD45-), identifique a população de células CD31+ e a porta (CD31+).
    3. Dentro (CD31+), identifique a população de células VE-Caderrina e o portão (CDH5-).
    4. Dentro de (CDH5-), identifique a população de células c-Kit+ e o gate (KIT+).
    5. Dentro (KIT+), identifique a população de células CD34+ e a porta (CD34+).
    6. Dentro (CD34+), identifique e classifique as células KDR+ em 6 mL de tampão de classificação de células geladas. Utilize estas células em aplicações a jusante (ver secção 8).

8. Ensaio da unidade formadora de colônias

  1. Descongele as alíquotas do meio à base de metilcelulose seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: Uma alíquota de 3 mL é suficiente para duas amostras e uma alíquota de 4 mL é suficiente para três amostras.
  2. Contar as células endoteliais hemogênicas classificadas obtidas na etapa 7.7.
  3. Seguindo as instruções do fabricante, calcule o volume de células classificadas para adicionar a cada alíquota de meio à base de metilcelulose, de modo que cada amostra contenha um mínimo de 1.000 células endoteliais hemogênicas.
    Observação : O número de células pode ser ajustado conforme necessário.
  4. Adicione o volume calculado de células à alíquota do meio à base de metilcelulose e ao vórtice completamente. Permita que as culturas de meio à base de metilcelulose permaneçam à temperatura ambiente por 10 minutos ou até que as bolhas se dissipem.
  5. Aspirar a solução de revestimento de fibronectina das placas preparadas de 35 mm. Seguindo as instruções do fabricante, dispense 1 mL de cultura de meio à base de metilcelulose por prato de 35 mm. Gire suavemente o prato para distribuir uniformemente a cultura.
  6. Coloque estes pratos de 35 mm, bem como dois pratos adicionais de 35 mm cheios de água estéril, dentro de um prato de cultura de tecidos de 15 cm.
  7. Incubar as culturas em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e observar as culturas nos dias 8 e 14.
    1. No dia 8, conte as colônias CFU-E e BFU-E.
    2. No dia 14, conte as colônias CFU-GM e CFU-GEMM.
      NOTA: Consulte o manual de meios à base de metilcelulose para identificação morfológica de tipos de colônias.

Resultados

Um esquema delineando a especificação de CEs primordiais e CEs hemogênicas de hESCs e uma imagem representativa das células 24 h após o revestimento são mostradas na Figura 1. Seguindo a especificação, CEs primordiais e CEs hemogênicas são FACS purificadas nos dias 5 e 8, respectivamente. As CEs primordiais são definidas como CD31+ CD45- e as CEs hemogênicas são definidas como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45

Discussão

Neste documento, descrevem-se os passos para a produção de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana usando um sistema de cultura 2D livre de murino e soro (Figura 1). Esse protocolo expande um método descrito por Sriram et al. (2015) para obter CEs primordiais38. A natureza primordial e o potencial de especificação dos CD31+ CD45- ECs são demonstrados pela cultura dessas...

Divulgações

O autor não tem nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos subsídios do NIH HL128064 e U2EB017103. Mais apoio foi fornecido pela concessão CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
15 cm dishesCorning430599tissue culture treated
35 mm dishesCorning430165tissue culture treated
6-well platesCorning3516tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR&D systems233-FB-025use at 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispaseStemcell Technologies7913
DLL4R&D systems1506-D4/CFrecombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		LonzaCC-3162
FACS tubesCorning352235polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinThermoFisher Scientific33016015use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		Corning356230Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Retinoic AcidSigma AldrichR2625-50mguse at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		BioRad1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560.25%
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20use at 50 ng/mL
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μg/mL*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μg/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

Referências

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