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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Zusammenfassung

Blutgefäße sind ubiquitär in allen Geweben des Körpers verteilt und erfüllen vielfältige Funktionen. Daher ist die Ableitung reifer vaskulärer Endothelzellen, die Blutgefäßlumen auskleiden, aus humanen pluripotenten Stammzellen entscheidend für eine Vielzahl von Tissue Engineering- und Regenerationsanwendungen. In vivo stammen primordiale Endothelzellen aus der mesodermalen Linie und sind für bestimmte Subtypen spezifiziert, einschließlich arterieller, venöser, kapillarer, hämogener und lymphatischer Typen. Hämogene Endothelzellen sind von besonderem Interesse, da sie während der Entwicklung hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen hervorbringen, die dann im Laufe des Lebens alle Blutlinien erzeugen. Daher würde die Schaffung eines Systems zur Erzeugung hämogener Endothelzellen in vitro die Möglichkeit bieten, den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen, und könnte zu einer Ex-vivo-Produktion menschlicher Blutprodukte und einer geringeren Abhängigkeit von menschlichen Spendern führen. Während mehrere Protokolle für die Ableitung von Vorläufer- und primordialen Endothelzellen existieren, wurde die Erzeugung gut charakterisierter hämogener Endothelzellen aus menschlichen Stammzellen nicht beschrieben. Hier wird eine Methode zur Gewinnung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt: ein Differenzierungsprotokoll mit primitiven Streakzellen, die als Reaktion auf GSK3β-Inhibitor (CHIR99021) gebildet wurden, dann Mesoderm-Linieninduktion vermittelt durch bFGF, gefolgt von primordialer Endothelzellentwicklung, die durch BMP4 und VEGF-A gefördert wird, und schließlich hämogene Endothelzellspezifikation, die durch Retinsäure induziert wird. Dieses Protokoll liefert eine gut definierte Population hämogener Endothelzellen, die verwendet werden können, um ihre molekulare Regulation und ihren endothelialen zu hämatopoetischen Übergang besser zu verstehen, was das Potenzial hat, auf nachgelagerte therapeutische Anwendungen angewendet zu werden.

Einleitung

Endothelzellen (ECs) sind eine heterogene Population von Zellen, die im gesamten menschlichen Körper und in technisch hergestellten Geweben mehrere Funktionen erfüllen. Neben der Unterstützung und Regulierung anderer Zelltypen (z. B. Kardiomyozyten1, osteoblastische Zellen2) umfassen diese Funktionen die Bildung einer selektiven Barriere zwischen Blut und Geweben und die Unterstützung der Gewebebildung3. Die Differenzierung reifer ECs während der normalen Entwicklung erfordert vielfältige Signalwege. Primordiale ECs werden von Mesoderm-Vorläuferzellen abgeleitet und dann für reife arterielle, venöse, kapillare und lymphatische Phänotypen spezifiziert4. Darüber hinaus wird eine kleine Untergruppe von ECs im extraembryonalen Dottersack und in der embryonalen Aorta-Gonad-Mesonephros-Region (AGM) ebenfalls als hämogene ECs spezifiziert, aus denen hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) hervorgehen, die in die fetale Leber und das fetale Knochenmark wandern, wo sie postnatal verbleiben und alle Blutzelltypen während des gesamten Lebens erzeugen4. Die Vielfalt der EC-Phänotypen ist essentiell für die gesamte Gewebeentwicklung und -erhaltung.

Daher sind ECs und ihre Derivate kritische Komponenten von Studien zur Modellierung und Aufklärung von Mechanismen der menschlichen Entwicklung und/oder Krankheit sowie von Anwendungen der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering 5,6,7,8. Die Haupteinschränkung für diese Art von Studien ist jedoch die mangelnde Verfügbarkeit von primären Human-ECs in der erforderlichen Menge. Es wurde geschätzt, dass für die meisten therapeutischen Anwendungen mindestens 3 x 108 ECs erforderlich wären6. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) aufgrund ihres vielfältigen Abstammungspotenzials und ihrer Fähigkeit, eine große Anzahl von Nachkommen zu erzeugen, vorgeschlagen 6,9.

Tatsächlich wurde die Nützlichkeit von Zellen, die aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen gewonnen wurden, in mehreren Studien nachgewiesen, die sich auf Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening konzentrierten10,11,12. Die Organ-on-a-Chip (OOC) -Technologie wurde verwendet, um die Physiologie des menschlichen Körpers genauer zu rekapitulieren, indem Zellen und Gewebe in dreidimensionale Gerüste integriert wurden. Darüber hinaus kann die Verbindung mehrerer einzelner OOCs (ein sogenannter Body- oder Human-on-a-Chip, BOC/HOC) über Mikrofluidik erreicht werden, um ein Übersprechen zwischen den interessierenden Organen13,14,15 zu ermöglichen. Stützgewebe wie das Gefäßsystem sind kritische Bestandteile von OOCs und BOC/HOCs; Die Einbeziehung des Gefäßsystems ermöglicht den Transport von Nährstoffen, Sauerstoff und parakrinen Faktoren durch das Gewebe und fördert dadurch die erforderliche gewebespezifische Mikroumgebung 3,12. Daher sind Methoden zur Ableitung reifer humaner ECs, wie arterielle, venöse, lymphatische und hämogene ECs, entscheidend für die Weiterentwicklung dieser Tissue Engineering-Ansätze.

Es wurden mehrere Protokolle veröffentlicht, in denen die Schritte für die Ableitung humaner Ur- oder Vorläufer-ECs aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen detailliert beschrieben sind 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Viele dieser Protokolle beruhen auf der Bildung von Embryoiden Körpern (EB) oder der Kokultur von ESCs / iPSCs mit einer murinen Feederschicht von Stromazellen. Diese Strategien sind in der Regel schwierig und zeitaufwendig, mit geringen EC-Erträgen und/oder Kontamination menschlicher ECs mit Mauszellen. Protokolle, die strikt auf 2D-Kultur ohne die Verwendung von Stromazellen angewiesen sind, erfordern oft lange Induktionen, verwenden komplexe Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitoren für die Induktion, haben verlängerte Expansionszeiten nach der Zelltrennung oder eine Kombination dieser Faktoren. Die Weiterentwicklung des Wissens über Signalwege und Faktoren, die an der Ableitung reifer EC-Typen in vivo beteiligt sind, bildet die Grundlage für ein einfaches und robustes In-vitro-Differenzierungsprotokoll.

Zuvor wurden Schlüsselrollen für Notch- und Retinsäure (RA)-Signalwege bei der Spezifikation von murinen arteriellen bzw. hämogenen ECs während der Entwicklung identifiziert. Der Notch-Signalweg spielt mehrere Rollen bei der Spezifikation und Aufrechterhaltung des arteriellen EC-Phänotyps. Die Arbeit mit dem murinen retinalen Vaskularisationsmodell identifizierte einen Weg, in dem Flüssigkeitsscherspannung eine Notch-Cx37-p27-Signalachse induziert, die den G1-Zellzyklusstillstand fördert, was die arterielle EC-Spezifikation27 ermöglicht. Es wurde angenommen, dass Zellzykluszustände eine Rolle bei Zellschicksalsentscheidungen spielen, indem sie unterschiedliche Gelegenheitsfenster bieten, in denen Zellen für bestimmte Signale empfänglich sind, die Genexpression und phänotypische Veränderungen induzieren können28. Dieser Notch-vermittelte G1-Arrest ermöglichte die Expression von Genen, die in arteriellen ECs angereichert sind, einschließlich EphrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 und Notch 4 (überprüft in29,30). Es wurde auch gezeigt, dass die hämogene EC-Spezifikation in vivo über die RA-Signalisierung31,32 gefördert wird. Zusätzliche Studien zeigten, dass die Expression von c-Kit und Notch p27 stromabwärts der RA-Signalisierung hochreguliert, was eine hämogene Spezifikation im Murindottersack und AGM33 ermöglicht. Murine hämogene ECs können minimal durch Expression sowohl endothelialer (d.h. CD31, KDR) als auch hämatopoetischer (d.h. c-Kit, CD34) Marker identifiziert werden4. Schließlich durchlaufen hämogene ECs einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang (EHT), um HSPCs zu bilden, die zu allen Blutzelltypen 4,34,35 führen können.

Neuere Arbeiten haben getestet, ob dieselbe Signalhierarchie die humane hämogene EC-Spezifikation fördern kann. Dazu wurde ein serum- und feederfreies 2D-Kulturprotokoll zur Ableitung hämogener ECs aus hES-Zellen entwickelt, und diese hämogenen ECs wurden auf Einzelzellebene als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- charakterisiert. Diese Studie nutzte auch den FUCCI-Reporter (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), der verschiedene Zellzykluszustände unter Verwendung von H9-hES-Zellen identifiziert, die das FUCCI-Reporterkonstrukt (H9-FUCCI-hESC) ausdrücken36. In Studien mit diesen Zellen wurde gezeigt, dass RA den frühen G1-Zellzyklus-Arrest in ECs fördert und der frühe G1-Zustand eine hämogene Spezifikation in vitroermöglicht 37. Hierin werden ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung dieser humanen hämogenen Endothelzellen und Assays zur Bestätigung ihrer Identität bereitgestellt. Diese einfache Methode bietet ein nützliches Mittel, um diese spezialisierte Untergruppe von ECs für zukünftige Studien der Mechanismen der Entwicklung menschlicher Blutzellen zu generieren.

Protokoll

1. Reagenzien und Reagenzienzubereitung

HINWEIS: Eine Liste der Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle.

  1. Erhalten Sie die humanen pluripotenten Stammzelllinien: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    HINWEIS: Die Erzeugung von hämogenen ECs kann in der H1-Zelllinie effizienter sein.
  2. Matrixproteinvorräte vorbereiten: Aliquot das Matrixprotein in vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen (auf Eis) geben, so dass jedes Röhrchen 1 mg Matrixprotein enthält. 1 mg Matrixprotein reicht aus, um alle Vertiefungen von zwei 6-Well-Platten (insgesamt 12 Wells) zu beschichten. Lagern Sie die Aliquots bis zum Gebrauch bei -20 °C.
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Matrixprotein auf Eis oder bei 4 °C durch. Die gefrorene Durchstechflasche mit Matrixprotein über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen die Durchstechflasche schwenken, um sicherzustellen, dass der Inhalt gemischt wird. 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mindestens 1 h bei -20 °C vorkühlen und unmittelbar vor dem Aliquotieren auf Eis überführen.
  3. Matrixprotein-beschichtete Platten vorbereiten: Matrixprotein-Aliquots auf Eis bei 4 °C auftauen. 12,5 mL eiskaltes DMEM:F12 in ein vorgekühltes konisches Röhrchen auf Eis geben. Unter Verwendung vorgekühlter Pipettenspitzen ein Aliquot (1 mg) Matrixprotein in das konische Röhrchen übertragen und durch Pipettieren auf und ab gut mischen. Aliquot 1 ml des verdünnten Matrixproteins in jede Vertiefung vorgekühlter 6-Well-Platten (auf Eis) unter Verwendung einer vorgekühlten serologischen Pipette. Schwenken und schaukeln Sie die Platten, so dass der gesamte Brunnen gleichmäßig beschichtet ist. Inkubieren Sie die Platten für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur, damit sich das Matrixprotein verfestigen kann. Die Platten mit Parafilm umwickeln und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern. Verwenden Sie Matrixprotein-beschichtete Platten innerhalb von 2 Wochen nach der Zubereitung.
    HINWEIS: Verwenden Sie die mit Matrixprotein beschichteten 6-Well-Platten für den routinemäßigen Übergang von Zellen und die Differenzierung zu primordialen und hämogenen Endothelzellen. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus. 6-Well-Platten, Pipettenspitzen, serologische Pipetten und konische Röhrchen vor Gebrauch mindestens 1 h bei -20 °C vorkühlen. Übertragen Sie diese Gegenstände auf Eis, wenn sie einsatzbereit sind.
  4. Bereiten Sie das Basendifferenzierungsmedium vor, indem Sie 5 ml PFHM zu 100 ml pluripotentem Stammzelldifferenzierungsmedium hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
  5. 0,1% BSA-PBS durch Auflösen von 0,1 g BSA in 100 mL PBS herstellen. Filter sterilisieren BSA-PBS durch Passieren eines 0,22 μm Filters und lagern bei 4 °C.
  6. 5 mM HCl durch Verdünnen der Brühe HCl (12 M) 1:2,400 mit Wasser herstellen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 3,0 ein. Filter sterilisieren die Lösung durch einen 0,22 μm Filter und lagern bei 4 °C.
  7. Bereiten Sie bFGF-, BMP4-, VEGF-A-, Retinsäure (RA) und DLL4-Aktien vor.
    1. bFGF: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie bFGF-Bestände innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    2. BMP4: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver auf 1 mg / ml in 5 mM HCl, pH 3,0. Weiter auf 50 μg/ml in 0,1% BSA-PBS verdünnen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die BMP4-Bestände innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    3. VEGF-A: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 1 mg/ml indH2O. Weiter auf 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS verdünnen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die VEGF-A-Brühen innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    4. RA: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver auf 100 mM in DMSO. Aliquot und bei -80 °C lagern. Verwenden Sie die RA-Bestände innerhalb von 1 Monat nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
      HINWEIS: RA-Aktien vor Licht schützen.
    5. DLL4: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 1 mg / ml in PBS. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die DLL4-Bestände innerhalb von 12 Monaten nach der Vorbereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  8. Das Endothelzelldifferenzierungsmedium wird unmittelbar vor der Anwendung durch Verdünnen von VEGF-A und BMP4 in Basendifferenzierungsmedium (Schritt 1.4) so hergestellt, dass die Endkonzentrationen 25 ng/ml bzw. 50 ng/ml betragen.
  9. Bereiten Sie die Arbeits-RA unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie 100 mM Brühe 1:1.000 in DMSO auf 100 μM verdünnen.
    HINWEIS: Schützen Sie funktionierende RA vor Licht.
  10. Das hämogene Endothelzelldifferenzierungsmedium wird unmittelbar vor der Anwendung durch Verdünnen von VEGF-A, BMP4 und arbeitender RA im Basendifferenzierungsmedium (Schritt 1.4) so hergestellt, dass die Endkonzentrationen 25 ng/ml, 50 ng/ml bzw. 0,5 μM betragen.
  11. Bereiten Sie den Antikörperfärbepuffer vor, indem Sie HBSS mit 10% FBS herstellen und mit 1:500 verdünntem antimikrobiellen Reagenz ergänzen. Den Puffer steril filtern und sofort verwenden.
  12. Bereiten Sie den Zellsortierpuffer vor, indem Sie HBSS mit 1% FBS herstellen und mit 1:500 verdünntem antimikrobiellem Reagenz ergänzen. Den Puffer steril filtern und sofort verwenden.
  13. Bereiten Sie 1 mg / ml Fibronektinvorräte vor, indem Sie 5 ml steriles Wasser zu 5 mg lyophilisiertem Fibronektin hinzufügen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die Fibronektinvorräte vor dem Verfallsdatum auf dem Etikett des lyophilisierten Produkts. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  14. Bereiten Sie die mit Fibronektin beschichteten 35-mm-Schalen vor. Die Fibronektinvorräte (1 mg/ml) werden in sterilem Wasser auf 4 μg/ml verdünnt. Fügen Sie 1 ml dieser Fibronektin-Beschichtungslösung zu jeder Schale hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min bis 1 h. Verwenden Sie das Geschirr unmittelbar nach dem Beschichten.
  15. Bereiten Sie 3 oder 4 ml Aliquots eines Mediums auf Methylcellulosebasis gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Lagern Sie die Aliquots bis zum Gebrauch bei -20 °C. Verwenden Sie die Aliquots des Mediums auf Methylcellulosebasis vor dem auf dem Etikett des Standardprodukts angegebenen Verfallsdatum. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  16. Die DLL4-Beschichtungslösung wird hergestellt, indem rekombinanter humaner DLL4-Bestand auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml in PBS verdünnt wird.
  17. Bereiten Sie das Wachstumsmedium der Endothelzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und lagern Sie es.
  18. Bereiten Sie den Durchflusszytometrie-Analysepuffer vor, indem Sie PBS mit 0,1% BSA herstellen. Den Puffer steril filtrieren und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.

2. Zellkultur und Passaging von hES-Zellen

  1. Lassen Sie die mit Matrixprotein beschichteten Platten, das Wachstumsmedium der Stammzellen und DMEM:F12 auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Züchten Sie die hESC-Zelllinien in Stammzellwachstumsmedium (2 ml / Well) auf Matrixprotein-beschichteten 6-Well-Platten in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator .
  3. Überprüfen Sie die Zellen täglich und entfernen Sie die differenzierten Zellen nach Bedarf, indem Sie sie vorsichtig mit einer p200-Pipettenspitze von der Platte abkratzen.
    HINWEIS: Differenzierte Zellen erscheinen an der Peripherie von Kolonien. Beispiele für differenzierte Zellen in Kultur finden Sie im Produkthandbuch des Stammzellwachstumsmediums.
  4. Durchdringen Sie die Zellen, sobald sie 70% -80% Konfluenz erreicht haben. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um Zellen zu durchlaufen.
    HINWEIS: Die Zellen sollten geteilt werden, bevor eine Konfluenz von 70% -80% erreicht wird, wenn eine erhöhte Differenzierung auftritt.
    1. Entfernen Sie das Medium über den Zellen und waschen Sie es vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung.
    2. Fügen Sie 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung hinzu.
    3. 160 μL/ml Dispase pro Vertiefung zugeben und die Zellen bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator für 45 min inkubieren.
    4. Nach der Dispase-Inkubation fügen Sie zusätzlich 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung hinzu und pipetten Sie vorsichtig, um die Zellen anzuheben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Durchdringen Sie die Zellen als kleine Klumpen.
    5. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen mit 12 mL DMEM:F12 und lassen Sie die Zellen durch Schwerkraft absetzen (~5-10 min).
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 0,5 ml Stammzellwachstumsmedium pro Vertiefung der angehobenen Zellen, um kleine Zellklumpen zu erhalten.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Durchdringen Sie die Zellen als kleine Klumpen.
    7. Die Matrixproteinbeschichtungslösung wird aus den Vertiefungen der vorbereiteten Matrixprotein-beschichteten Platte abgesaugt und 1,5 ml des Stammzellwachstumsmediums pro Vertiefung hinzugefügt.
    8. Fügen Sie das gewünschte Volumen der resuspendierten Zellen (Schritt 2.4.6) in jede Vertiefung der vorbereiteten Matrixprotein-beschichteten Platte hinzu.
    9. Die Platte in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator inkubieren. Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden in ein frisches Stammzellwachstumsmedium.

3. Differenzierung von hES-Zellen zu primordialen Endothelzellen

  1. Tag -1: Kultur und Durchgang der Zellen wie oben in Abschnitt 2 beschrieben. Die Zellen (Schritt 2.4.6) werden in kleinen Klumpen (~50 μm) mit einer Dichte von etwa 2 Klumpen pro Quadratzentimeter38 ausgesät.
    HINWEIS: Bewerten Sie die Samendichte und verfeinern Sie sie bei Bedarf empirisch.
  2. Tag 0: 24 h nach der Aussaat der Zellen das Medium aus jeder Vertiefung absaugen und die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung waschen. 1 ml des Basendifferenzierungsmediums mit 5 μM GSK3i (CHIR99021, frisch zugegeben) in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
    HINWEIS: Fügen Sie für alle Waschschritte langsam die angegebenen Waschmedien auf die Platte hinzu, indem Sie gegen die Wand der Platte pipettieren. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, so dass die gesamte Oberfläche des Brunnens mit Waschmedien bedeckt ist. Neigen Sie die Platte leicht, so dass sich das Waschmedium auf der Sechs-Uhr-Position sammelt, und saugen Sie die Waschmedien vorsichtig ab.
  3. Tag 1: Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml des Basendifferenzierungsmediums mit 50 ng/mL bFGF (frisch zugegeben, 1:2.000 aus gefrorenem Material) in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
  4. Tag 2: Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml des Endothelzelldifferenzierungsmediums in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
  5. Tag 3: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  6. Tag 4: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  7. Tag 5: FACS reinigen die Zellen, um den EC-Phänotyp zu beurteilen (Abschnitte 4-5) oder halten sie in Kultur und differenzieren Sie sich in Richtung hämogene Endothelzellen (Abschnitt 6).

4. FACS-Reinigung von primordialen Endothelzellen

  1. Das Medium über den Zellen absaugen und einmal vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung waschen.
  2. Fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 12 min in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator oder bis die Zellen dissoziiert haben.
  3. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit 12 mL DMEM:F12 und Pellet durch Zentrifugieren für 5 min, 1.000 x g überführt.
  4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml DMEM:F12 zum Waschen.
  5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min, 1.000 x g.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem Antikörper-Färbepuffer und zählen Sie die Zellen. Stellen Sie die Konzentration mit eiskaltem Antikörper-Färbepuffer auf 1 x 105 Zellen/ml ein.
  7. Teilen Sie die Zellen gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 μL-Zellen bei 1 x 105 Zellen/ml enthalten, um Antikörper zu färben.
    HINWEIS: Für die Färbung von primordialen ECs sind vier Zellröhrchen erforderlich: ungefärbte Kontrolle, CD31-Einzelantikörperkontrolle, CD45-Einzelantikörperkontrolle und Probe, die sowohl CD31- als auch CD45-Antikörper enthält. Informationen über Antikörper finden Sie in der Materialtabelle.
  8. Fügen Sie gegebenenfalls Antikörper in die Röhrchen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie auf Eis und geschützt vor Licht für 30 Minuten.
    1. Ungefärbte Kontrolle: Fügen Sie keine Antikörper hinzu.
    2. CD31-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD31-Antikörper hinzu.
    3. CD45-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD45-Antikörper hinzu.
    4. Beispiel: Fügen Sie sowohl CD31- als auch CD45-Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Die endgültige Antikörperkonzentration in der Probe sowie die fluoreszierenden Konjugate sollten basierend auf den spezifischen Antikörpern und dem verwendeten Zellsortierer optimiert werden.
  9. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren in einer 4 °C Tischmikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g.
  10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 600 μL eiskaltem Sortierpuffer.
  11. Die Proben werden durch die Mesh-Filterkappen aus 5-ml-FACS-Röhrchen abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis lagern, um sofortiges FACS zu erhalten.
  12. Erhalten Sie primordiale Endothelzellen (CD31+ CD45-), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Identifizieren Sie die CD45-negative Zellpopulation und das Gate (CD45-).
    2. Identifizieren Sie innerhalb von (CD45-) die CD31-positive (CD31+) Zellpopulation und sortieren Sie die Zellen in 6 ml eiskalte Zellsortierpuffer. Verwenden Sie diese Zellen für nachgelagerte Anwendungen (siehe Abschnitt 5).

5. Assay zur Bestätigung des primordialen Endothelzellphänotyps

  1. Beschichten Sie drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 1 ml/Well-DLL4-Beschichtungslösung für 30 min in einem 37 °C, 5% CO 2-Inkubator. Als Kontrolle die anderen drei Vertiefungen der Platte mit 1 ml / Well-PBS nachlackieren.
  2. Die DLL4-Beschichtungslösung und PBS werden abgesaugt und 25.000 sortierte primordiale Endothelzellen (siehe Schritt 4.12) in 2 ml Endothelzellwachstumsmedium pro Vertiefung eingraviert.
  3. Die Zellen 24 h lang in einem 37 °C, 5%CO2 Inkubator inkubieren.
  4. Das Medium über den Zellen absaugen und einmal mit 2 ml/Well-PBS waschen. Analysieren Sie die Zellen mittels qPCR oder Durchflusszytometrie (für Zellen, die das FUCCI-Konstrukt exprimieren).
    1. Um die Zellen mittels qPCR zu analysieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Saugen Sie die Flüssigkeit über den Zellen ab und isolieren Sie die RNA in den Zellen mit einem RNA-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      2. Führen Sie umgekehrte Transkriptionsreaktionen mit einem Reverse-Transkriptions-Mastermix gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
      3. Führen Sie qPCR-Reaktionen mit einem SYBR Green-Mastermix gemäß Herstellerprotokoll durch.
        HINWEIS: Die verwendeten Primer (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    2. Um Zellen, die das FUCCI-Konstrukt exprimieren, durch Durchflusszytometrie zu analysieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Die Flüssigkeit über den Zellen absaugen und 500 μL/well 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen.
      2. Die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, bis sie angehoben werden, ~5 min.
      3. Die Zellen werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Zellen in einer 4 °C Mikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g pelletiert.
      4. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL eiskaltem Durchflusszytometrie-Analysepuffer.
      5. Die Proben werden durch die Netzfilterkappe eines 5-ml-FACS-Röhrchens abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis aufbewahren, um eine sofortige Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen.
      6. Analysieren Sie den Prozentsatz der Zellen, die auf DLL4 im Vergleich zur PBS-Kontrolle im frühen G1 (keine Farbe), späten G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) und S/G2/M (mCherry-/mVenus+) plattiert sind.

6. Differenzierung von hES-Zellen zu hämogenen Endothelzellen

HINWEIS: Differenzieren Sie die Zellen zu Tag 4 primordialen ECs, wie oben in den Abschnitten 3.1-3.6 beschrieben.

  1. Tag 5: Saugen Sie das Medium über den Zellen ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung zugeben und 24 h (37 °C, 5% CO2) inkubieren.
  2. Tag 6: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  3. Tag 7: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  4. Tag 8: FACS isoliert hämogene Endothelzellen (siehe Abschnitt 7).

7. FACS-Isolierung hämogener Endothelzellen

  1. Die Zellen werden wie oben in den Abschnitten 4.1-4.6 beschrieben angehoben und gewaschen.
  2. Teilen Sie die Zellen gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 μL-Zellen bei 1 x 105 Zellen/ml enthalten, um Antikörper zu färben.
    HINWEIS: Für die Antikörperfärbung hämogener ECs sind acht Zellröhrchen erforderlich: ungefärbte Kontrolle, CD31-Einzelantikörperkontrolle, CD45-Einzelantikörperkontrolle, KDR-Einzelantikörperkontrolle, c-Kit-Einzelantikörperkontrolle, CD34-Einzelantikörperkontrolle, VE-Cadherin-Einzelantikörperkontrolle und Probe, die alle sechs Antikörper enthält.
    HINWEIS: Informationen zu Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle.
  3. Fügen Sie gegebenenfalls Antikörper in die Röhrchen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie auf Eis und geschützt vor Licht für 30 Minuten.
    1. Ungefärbte Kontrolle: Fügen Sie keine Antikörper hinzu.
    2. CD31-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD31-Antikörper hinzu.
    3. CD45-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD45-Antikörper hinzu.
    4. KDR-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur KDR-Antikörper hinzu.
    5. c-Kit Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur c-Kit Antikörper hinzu.
    6. CD34-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD34-Antikörper hinzu.
    7. VE-Cadherin Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur VE-Cadherin-Antikörper hinzu.
    8. Beispiel: Fügen Sie CD31-, CD45-, KDR-, c-Kit-, CD34- und VE-Cadherin-Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Die endgültige Antikörperkonzentration in der Probe sowie die fluoreszierenden Konjugate sollten basierend auf den spezifischen Antikörpern und dem verwendeten Zellsortierer optimiert werden.
  4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren in einer 4 °C Mikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g.
  5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 600 μL eiskaltem Sortierpuffer.
  6. Die Proben werden durch die Netzfilterkappe aus 5-ml-FACS-Röhrchen abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis lagern, um sofortiges FACS zu erhalten.
  7. Um hämogene Endothelzellen (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) zu erhalten, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Identifizieren Sie die CD45-Zellpopulation und das Gate (CD45-).
    2. Identifizieren Sie innerhalb (CD45-) die CD31+-Zellpopulation und das Gate (CD31+).
    3. Identifizieren Sie innerhalb von (CD31+) die VE-Cadherin-Zellpopulation und das Gate (CDH5-).
    4. Identifizieren Sie innerhalb (CDH5-) die c-Kit+-Zellpopulation und das Gate (KIT+).
    5. Identifizieren Sie innerhalb von (KIT+) die CD34+-Zellpopulation und das Gate (CD34+).
    6. Identifizieren und sortieren Sie innerhalb von (CD34+) die KDR+-Zellen in einen 6-ml-Eiskaltzellensortierpuffer. Verwenden Sie diese Zellen in nachgelagerten Anwendungen (siehe Abschnitt 8).

8. Colony Forming Unit Assay

  1. Die Aliquots des Mediums auf Methylcellulosebasis gemäß den Anweisungen des Herstellers auftauen.
    HINWEIS: Ein Aliquot von 3 ml ist für zwei Proben und ein Aliquot von 4 ml für drei Proben ausreichend.
  2. Zählen Sie die sortierten hämogen Endothelzellen, die in Schritt 7.7 erhalten wurden.
  3. Berechnen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers das Volumen der sortierten Zellen, die zu jedem aliquoten Medium auf Methylcellulosebasis hinzugefügt werden sollen, so dass jede Probe mindestens 1.000 hämogene Endothelzellen enthält.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen kann nach Bedarf angepasst werden.
  4. Fügen Sie das berechnete Volumen der Zellen dem aliquoten und Wirbel auf Methylcellulosebasis gründlich hinzu. Lassen Sie die Mediumkulturen auf Methylcellulosebasis 10 min bei Raumtemperatur ruhen oder bis sich die Blasen auflösen.
  5. Die Fibronektin-Beschichtungslösung aus den vorbereiteten 35-mm-Schalen absaugen. Entsprechend den Anweisungen des Herstellers 1 ml Mediumkultur auf Methylcellulosebasis pro 35-mm-Schale abgeben. Drehen Sie die Schale vorsichtig, um die Kultur gleichmäßig zu verteilen.
  6. Legen Sie diese 35-mm-Schalen sowie zwei weitere 35-mm-Schalen, die mit sterilem Wasser gefüllt sind, in eine 15-cm-Gewebekulturschale.
  7. Inkubieren Sie die Kulturen in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator und beobachten Sie die Kulturen an Tag 8 und 14.
    1. Zählen Sie an Tag 8 die Kolonien CFU-E und BFU-E.
    2. Zählen Sie an Tag 14 die Kolonien CFU-GM und CFU-GEMM.
      HINWEIS: Zur morphologischen Identifizierung von Kolonietypen finden Sie im Handbuch für Methylcellulose-basierte Medien.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Spezifikation von primordialen ECs und hämogenen ECs aus hES-Zellen sowie ein repräsentatives Bild der Zellen 24 h nach der Beschichtung. Nach der Spezifikation werden primordiale ECs und hämogene ECs an den Tagen 5 bzw. 8 FACS gereinigt. Primordiale ECs sind definiert als CD31+ CD45- und hämogene ECs sind definiert als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-.

Diskussion

Hier werden die Schritte zur Herstellung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche unter Verwendung eines murinfütterungs- und serumfreien 2D-Kultursystems skizziert (Abbildung 1). Dieses Protokoll erweitert eine von Sriram et al. (2015) beschriebene Methode, um primordiale ECs38 zu erhalten. Die ursprüngliche Natur und das Spezifikationspotenzial der CD31+ CD45-ECs werden demonstriert, indem diese Zellen auf DLL4-beschi...

Offenlegungen

Der Autor hat nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Zuschüsse HL128064 und U2EB017103 unterstützt. Weitere Unterstützung wurde durch CT Innovations 15-RMB-YALE-04 Grant bereitgestellt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 cm dishesCorning430599tissue culture treated
35 mm dishesCorning430165tissue culture treated
6-well platesCorning3516tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR&D systems233-FB-025use at 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispaseStemcell Technologies7913
DLL4R&D systems1506-D4/CFrecombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		LonzaCC-3162
FACS tubesCorning352235polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinThermoFisher Scientific33016015use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		Corning356230Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Retinoic AcidSigma AldrichR2625-50mguse at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		BioRad1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560.25%
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20use at 50 ng/mL
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μg/mL*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μg/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

Referenzen

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