Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека

Резюме

Здесь представлен простой протокол направленной дифференцировки гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю.

Аннотация

Кровеносные сосуды повсеместно распределены во всех тканях организма и выполняют разнообразные функции. Таким образом, получение зрелых эндотелиальных клеток сосудов, которые выстилают просветы кровеносных сосудов, из плюрипотентных стволовых клеток человека имеет решающее значение для множества приложений тканевой инженерии и регенерации. In vivo первичные эндотелиальные клетки получены из мезодермальной линии и указаны для конкретных подтипов, включая артериальные, венозные, капиллярные, гемогенные и лимфатические. Гемогенные эндотелиальные клетки представляют особый интерес, потому что во время развития они дают начало кроветворным стволовым и прогениторным клеткам, которые затем генерируют все линии крови на протяжении всей жизни. Таким образом, создание системы генерации гемогенных эндотелиальных клеток in vitro даст возможность изучить переход от эндотелия к кроветворению и может привести к производству ex vivo продуктов крови человека и снижению зависимости от человеческих доноров. Хотя существует несколько протоколов для получения предшественников и первичных эндотелиальных клеток, генерация хорошо охарактеризованных гемогенных эндотелиальных клеток из стволовых клеток человека не была описана. Здесь представлен способ получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю: протокол дифференцировки с примитивными полосовыми клетками, образованными в ответ на ингибитор GSK3β (CHIR99021), затем индукция линии мезодермы, опосредованная bFGF, за которой следует развитие первичных эндотелиальных клеток, способствующее развитию BMP4 и VEGF-A, и, наконец, гемогенная спецификация эндотелиальных клеток, индуцированная ретиноевой кислотой. Этот протокол дает четко определенную популяцию гемогенных эндотелиальных клеток, которые могут быть использованы для дальнейшего понимания их молекулярной регуляции и перехода эндотелия в кроветворение, что может быть применено к последующим терапевтическим приложениям.

Введение

Эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой гетерогенную популяцию клеток, которые выполняют множество функций по всему телу человека и в инженерных тканях. В дополнение к поддержке и регулированию других типов клеток (например, кардиомиоцитов¹, остеобластных клеток²), эти функции включают формирование селективного барьера между кровью и тканями и содействие в формировании тканей³. Дифференциация зрелых ЭК во время нормального развития требует разнообразных сигнальных путей. Первичные ЭК получают из предшественников мезодермы, а затем указываются на зрелые артериальные, венозные, капиллярные и лимфатические фенотипы⁴. Кроме того, небольшое подмножество ЭК в внеэмбрионном желтковом мешке и эмбриональной области Аорта-Гонад-Мезонефрос (АГМ) также специфично становится гемогенными ЭК, которые дают начало гемопоэтическим стволовым и прогениторным клеткам (ГСПЦ), которые мигрируют в печень плода и костный мозг плода, где они остаются постнатально и генерируют все типы клеток крови на протяжении всей жизни⁴. Разнообразный диапазон фенотипов ЕС необходим для развития и поддержания всех тканей.

Таким образом, ЭК и их производные являются важнейшими компонентами исследований, направленных на моделирование и выяснение механизмов развития человека и/или заболеваний, а также регенеративной медицины и тканевой инженерии 5,6,7,8. Однако основным ограничением для этих типов исследований является отсутствие первичных человеческих ЭК в необходимом количестве. Было подсчитано, что для большинства терапевтических применений⁶ потребуется минимум 3 х 10⁸ ЭК. Для решения этой проблемы было предложено использовать человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) из-за их разнообразного потенциала линии и их способности генерировать большое количество потомства ^6,9.

Действительно, полезность клеток, полученных из hESCs или hiPSCs, была продемонстрирована в многочисленных исследованиях, ориентированных на моделирование заболеваний и скрининг лекарств 10,11,12. Технология Organ-on-a-Chip (OOC) была использована для более точного повторения физиологии человеческого тела путем интеграции клеток и тканей в трехмерные каркасы. Кроме того, соединение нескольких отдельных ООК (так называемый body- или human-on-a-chip, BOC/HOC) может быть выполнено с помощью микрофлюидики, чтобы обеспечить перекрестные помехи между интересующими органами 13,14,15. Поддерживающие ткани, такие как сосудистая система, являются критическими компонентами ООК и БОК/ГОК; включение сосудистой системы позволяет транспортировать питательные вещества, кислород и паракринные факторы по всем тканям, тем самым способствуя необходимому тканеспецифическому микроокружению ^3,12. Таким образом, методы получения зрелых человеческих ЭК, таких как артериальные, венозные, лимфатические и гемогенные ЭК, имеют решающее значение для продвижения этих подходов тканевой инженерии.

Было опубликовано несколько протоколов, подробно описывающих этапы получения первичных или прародительных ЕС человека из hESCs или hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Многие из этих протоколов основаны на формировании эмбриоидного тела (EB) или совместной культивировании ЭСК / ИПСК с мышиным фидерным слоем стромальных клеток. Эти стратегии, как правило, являются сложными и трудоемкими, с низким выходом ЕС и / или загрязнением человеческих ЭК мышиными клетками. Протоколы, которые полагаются строго на 2D-культуру без использования стромальных клеток, часто требуют длительных индукции, используют сложные комбинации факторов роста и / или ингибиторов для индукции, имеют длительные периоды расширения после разделения клеток или комбинацию этих факторов. Углубление знаний о сигнальных путях и факторах, участвующих в выведении зрелых типов EC in vivo, обеспечивает основу для простого и надежного протокола дифференциации in vitro.

Ранее были определены ключевые роли сигнальных путей Notch и Ретиноевой кислоты (РА) в спецификации мышиных артериальных и гемогенных ЭК, соответственно, во время развития. Сигнальный путь Notch играет несколько ролей в спецификации и поддержании артериального фенотипа EC. Работа с использованием модели васкуляризации сетчатки мышей определила путь, в котором напряжение сдвига жидкости индуцирует сигнальную ось Notch-Cx37-p27, способствуя остановке клеточного цикла G1, что позволяет артериальную спецификацию EC²⁷. Было высказано предположение, что состояния клеточного цикла играют определенную роль в принятии решений о судьбе клеток, предоставляя различные окна возможностей, в которых клетки восприимчивы к определенным сигналам, которые могут индуцировать экспрессию генов и фенотипические изменения²⁸. Эта остановка G1, опосредованная Notch, позволила экспрессировать гены, обогащенные артериальными ЭК, включая ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 и Notch 4 (рассмотрено в^29,30). Также было показано, что гемогенная спецификация ЕС продвигается in vivo через передачу сигналов РА^31,32. Дополнительные исследования показали, что после передачи сигналов РА экспрессия c-Kit и Notch повышает регуляцию p27, что обеспечивает гемогенную спецификацию в мышином желточном мешке и AGM³³. Мышиные гемогенные ЭК могут быть минимально идентифицированы экспрессией как эндотелиальных (т.е. CD31, KDR), так и кроветворных (т.е. c-Kit, CD34) маркеров⁴. Наконец, гемогенные ЭК претерпевают эндотелиальный переход в кроветворный переход (EHT) с образованием HSPC, которые могут дать начало всем типам клеток крови ^4,34,35.

Недавняя работа проверила, может ли эта же иерархия сигнализации способствовать гемогенной спецификации ЕС человека. Для этого был разработан протокол 2D-культуры без сыворотки и кормушки для получения гемогенных ЭК из гЭСК, и эти гемогенные ЭК были охарактеризованы на уровне одной клетки как CD31 ⁺ KDR ⁺ c-Kit ⁺ CD34 ⁺ VE-Cadherin^- CD45^-. В этом исследовании также использовался репортер Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), который идентифицирует различные состояния клеточного цикла, используя H9-hESCs, которые экспрессируют конструкцию репортера FUCCI (H9-FUCCI-hESC)³⁶. В исследованиях с этими клетками было продемонстрировано, что РА способствует ранней остановке клеточного цикла G1 в ЭК, а раннее состояние G1 позволяет гемогенную спецификацию in vitro³⁷. Здесь представлен подробный протокол дифференцировки этих гемогенных эндотелиальных клеток человека и анализы, подтверждающие их идентичность. Этот простой метод обеспечивает полезные средства генерации этого специализированного подмножества ЭК для будущих исследований механизмов развития клеток крови человека.

протокол

1. Реагенты и подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов приведен в Таблице материалов.

1. Получение человеческих плюрипотентных линий стволовых клеток: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация гемогенных ЭК может быть более эффективной в клеточной линии H1.
2. Подготовьте запасы матричного белка: аликвотируйте матричный белок в предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл (на льду), чтобы каждая трубка содержала 1 мг матричного белка. 1 мг матричного белка достаточно для покрытия всех скважин двух 6-луночных пластин (всего 12 скважин). Хранить аликвоты при -20 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы с участием матричного белка на льду или при 4 °C. Разморозьте замороженный флакон матричного белка на льду при 4 °C в течение ночи. После размораживания закрутите флакон, чтобы убедиться, что содержимое смешано. Предваряют 1,5 мл микроцентрифужных трубок в течение не менее 1 ч при -20 °С и переносят на лед непосредственно перед аликотированием.
3. Приготовьте матричные пластины, покрытые белком: Разморозьте матричные белковые аликвоты на льду при 4 °C. Добавьте 12,5 мл ледяного DMEM:F12 в предварительно охлажденную коническую трубку на льду. Используя предварительно охлажденные наконечники пипетки, перенесите одну аликвоту (1 мг) матричного белка в коническую трубку и хорошо перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Aliquot 1 мл разбавленного матричного белка в каждую лунку предварительно охлажденных 6-луночных пластин (на льду) с использованием предварительно охлажденной серологической пипетки. Закрутите и раскачайте плиты так, чтобы весь колодец был равномерно покрыт. Инкубируйте пластины в течение минимум 30 минут при комнатной температуре, чтобы позволить матричному белку затвердеть. Оберните тарелки парапленкой и храните при температуре 4 °C до использования. Используйте матричные пластины, покрытые белком, в течение 2 недель после приготовления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте матричные покрытые белком 6-луночные пластины для рутинного прохождения клеток и дифференцировки в первичные и гемогенные эндотелиальные клетки. Выполняйте все шаги на льду. Предварительно охладите 6-луночные пластины, наконечники пипеток, серологические пипетки и конические трубки перед использованием в течение не менее 1 ч при -20 °C. Переложите эти предметы на лед, когда будете готовы к использованию.
4. Готовят базовую дифференцировочную среду, добавляя 5 мл PFHM к 100 мл плюрипотентной среды дифференцировки стволовых клеток. Хранить при температуре 4 °C.
5. Готовят 0,1% BSA-PBS путем растворения 0,1 г BSA в 100 мл PBS. Фильтр стерилизуют BSA-PBS, проходя через фильтр 0,22 мкм, и хранят при 4 °C.
6. Готовят 5 мМ HCl путем разбавления запаса HCl (12 М) 1:2 400 водой. Отрегулируйте pH до 3,0, используя NaOH. Фильтр стерилизуют раствор, пропуская через фильтр 0,22 мкм и хранят при 4 °C.
7. Подготовьте запасы bFGF, BMP4, VEGF-A, ретиноевой кислоты (RA) и DLL4.
   1. bFGF: Восстановите лиофилизированный порошок до 100 мкг/мл в 0,1% BSA-PBS. Аликвотировать и хранить при -20 °C. Используйте запасы bFGF в течение 3 месяцев после приготовления. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
   2. BMP4: Восстановите лиофилизированный порошок до 1 мг/мл в 5 мМ HCl, рН 3,0. Далее разбавляют до 50 мкг/мл в 0,1% BSA-PBS. Аликвотировать и хранить при -20 °C. Используйте запасы BMP4 в течение 3 месяцев после подготовки. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
   3. VEGF-A: Восстановить лиофилизированный порошок до 1 мг/мл в dH_2O. Далее разбавляют до 100 мкг/мл в 0,1% BSA-PBS. Аликвотировать и хранить при -20 °C. Используйте запасы VEGF-A в течение 3 месяцев после приготовления. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
   4. РА: Восстановить лиофилизированный порошок до 100 мМ в ДМСО. Аликвота и хранить при -80 °C. Используйте запасы РА в течение 1 месяца после подготовки. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите акции RA от света.
   5. DLL4: Восстановите лиофилизированный порошок до 1 мг/мл в PBS. Аликвотировать и хранить при -20 °C. Используйте запасы DLL4 в течение 12 месяцев после подготовки. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
8. Подготавливают среду дифференцировки эндотелиальных клеток непосредственно перед применением, разбавляя VEGF-A и BMP4 в базовой дифференцировочной среде (стадия 1.4) таким образом, чтобы конечные концентрации составляли соответственно 25 нг/мл и 50 нг/мл.
9. Подготовьте рабочий РА непосредственно перед использованием, разбавив 100 мМ запаса 1:1000 в ДМСО до 100 мкМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защита рабочего РА от света.
10. Подготавливают гемогенную среду дифференцировки эндотелиальных клеток непосредственно перед использованием, разбавляя VEGF-A, BMP4 и рабочий РА в базовой дифференцировочной среде (стадия 1.4) таким образом, чтобы конечные концентрации составляли 25 нг/мл, 50 нг/мл и 0,5 мкМ соответственно.
11. Подготовьте буфер окрашивания антител, сделав HBSS, содержащий 10% FBS, и дополните его разбавленным антимикробным реагентом 1:500. Стерильная фильтрация буфера и немедленное использование.
12. Подготовьте буфер сортировки клеток, сделав HBSS, содержащий 1% FBS, и дополните его разбавленным антимикробным реагентом 1:500. Стерильная фильтрация буфера и немедленное использование.
13. Приготовьте 1 мг/мл фибронектина, добавив 5 мл стерильной воды к 5 мг лиофилизированного фибронектина. Аликвотировать и хранить при -20 °C. Используйте запасы фибронектина до истечения срока годности на этикетке лиофилизированного продукта. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
14. Приготовьте 35 мм блюда с фибронектиновым покрытием. Разбавляют запасы фибронектина (от 1 мг/мл) до 4 мкг/мл в стерильной воде. Добавляют 1 мл этого раствора фибронектина в каждую чашку и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин до 1 ч. Используйте посуду сразу после нанесения покрытия.
15. Приготовьте 3 или 4 мл аликвоты среды на основе метилцеллюлозы в соответствии с инструкциями производителя. Хранить аликвоты при -20 °C до использования. Используйте средние аликвоты на основе метилцеллюлозы до истечения срока годности, указанного на этикетке продукта. Разморозьте аликвоты непосредственно перед использованием.
16. Подготовьте раствор для покрытия DLL4 путем разбавления рекомбинантного человеческого запаса DLL4 до конечной концентрации 10 мкг/мл в PBS.
17. Подготовьте и храните среду для роста эндотелиальных клеток в соответствии с инструкциями производителя.
18. Подготовьте буфер анализа проточной цитометрии, сделав PBS содержащим 0,1% BSA. Стерильно фильтруйте буфер и храните при 4 °C до использования.

2. Клеточная культура и прохождение гЭСК

1. Позвольте матричным пластинам, покрытым белком, среде для роста стволовых клеток и DMEM: F12 нагреваться до комнатной температуры.
2. Выращивайте клеточные линии hESC в среде роста стволовых клеток (2 мл / лунка) на матричных белковых пластинах с 6 лунками в инкубаторе с 37 ° C, 5% CO₂ .
3. Проверяйте клетки ежедневно и удаляйте дифференцированные клетки по мере необходимости, осторожно соскребая их с тарелки с помощью наконечника пипетки p200.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцированные клетки появятся на периферии колоний. Обратитесь к руководству по продукту для среды роста стволовых клеток для примеров дифференцированных клеток в культуре.
4. Прохождение клеток, как только они достигают 70%-80% конфлюзии. Чтобы пройти ячейки, выполните следующие действия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть разделены до достижения 70%-80% слияния, если происходит повышенная дифференцировка.
   1. Удалите среду над клетками и аккуратно промыть 1 мл DMEM:F12 на лунку.
   2. Добавьте 1 мл DMEM:F12 на лунку.
   3. Добавьте 160 мкл/мл диспазы на лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в 5% CO₂ инкубаторе в течение 45 мин.
   4. После инкубации Диспазы добавьте дополнительно 1 мл DMEM:F12 на лунку и аккуратно пипетку, чтобы поднять клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте диссоциации клеток в одноклеточную суспензию. Прохождение клеток в виде небольших комочков.
   5. Перенесите клетки в коническую трубку, содержащую 12 мл DMEM:F12 и позвольте клеткам осесть под действием силы тяжести (~5-10 мин).
   6. Удалите супернатант и осторожно повторно суспендируйте гранулу в 0,5 мл среды роста стволовых клеток на лунку поднятых клеток для получения небольших скоплений клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте диссоциации клеток в одноклеточную суспензию. Прохождение клеток в виде небольших комочков.
   7. Аспирировать раствор матричного белкового покрытия из лунок подготовленной матричной белковой пластины и добавлять 1,5 мл среды роста стволовых клеток на лунку.
   8. Добавьте желаемый объем повторно суспендированных клеток (этап 2.4.6) к каждой лунке подготовленной матричной пластины, покрытой белком.
   9. Инкубируйте пластину в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ . Меняйте среду каждые 24 ч на свежую среду роста стволовых клеток.

3. Дифференцировка гЭСК к первичным эндотелиальным клеткам

1. День -1: Культивирование и прохождение клеток, как описано выше в разделе 2. Засейте клетки (стадия 2.4.6) небольшими сгустками (~50 мкм) при плотности примерно 2 сгустка на квадратный сантиметр³⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените плотность семян и при необходимости уточните эмпирически.
2. День 0: 24 ч после посева клеток аспирировать среду из каждой лунки и аккуратно промыть клетки 1 мл DMEM:F12 на лунку. Добавьте в каждую лунку 1 мл базовой дифференцирующей среды, содержащей 5 мкМ GSK3i (CHIR99021, добавленная свежая), и инкубируйте в течение 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах промывки медленно добавляйте указанную промывочную среду на пластину путем пипетки о стенку плиты. Аккуратно закрутите пластину так, чтобы вся поверхность колодца была покрыта промывочными средами. Слегка наклоните пластину так, чтобы моющие средства сливались в положении «шесть часов» и тщательно аспирировать моющие средства.
3. День 1: Аспирируйте среду из каждой лунки и аккуратно промывайте клетки 1 мл DMEM:F12 на лунку. Добавьте в каждую лунку 1 мл базовой дифференцировочной среды, содержащей 50 нг/мл bFGF (добавленного свежего, 1:2000 из замороженного материала), и инкубируйте 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
4. День 2: Аспирируйте среду из каждой лунки и аккуратно промывайте клетки 1 мл DMEM: F12 на лунку. Добавляют 1 мл среды дифференцировки эндотелиальных клеток в каждую лунку и инкубируют 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
5. День 3: Замените среду над клетками 1 мл свежеприготовленной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
6. День 4: Замените среду над клетками 1 мл свежеприготовленной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
7. День 5: FACS очищают клетки для оценки фенотипа EC (разделы 4-5) или сохраняют в культуре и дифференцируют в сторону гемогенных эндотелиальных клеток (раздел 6).

4. FACS очистка первичных эндотелиальных клеток

1. Аспирировать среду над клетками и осторожно промыть один раз 1 мл DMEM:F12 на лунку.
2. Добавляют 1 мл раствора для отслоения клеток на лунку и инкубируют клетки в течение 12 мин в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ или до тех пор, пока клетки не диссоциируют.
3. Перенос диссоциированных клеток в коническую трубку, содержащую 12 мл DMEM:F12 и гранулу методом центрифугирования в течение 5 мин, 1000 х г.
4. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 12 мл DMEM:F12 для промывки.
5. Гранулирование клеток центрифугированием в течение 5 мин, 1,000 х г.
6. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере окрашивания ледяных антител и подсчитайте клетки. Отрегулируйте концентрацию с помощью буфера окрашивания ледяных антител до 1 x 10⁵ клеток/мл.
7. Разделите клетки равномерно на микроцентрифужные трубки на льду, каждая из которых содержит минимум 600 мкл клеток при 1 х 10⁵ клетках / мл, для окрашивания антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания первичных ЭК необходимы четыре пробирки клеток: неиспорченный контроль, контроль одного антитела CD31, контроль одного антитела CD45 и образец, содержащий антитела CD31 и CD45. Информация об антителах приведена в Таблице материалов.
8. Добавляют антитела в трубки, содержащие клетки, по мере необходимости, и инкубируют на льду и защищают от света в течение 30 мин.
   1. Неокрашенный контроль: не добавляйте антитела.
   2. Контроль одного антитела CD31: Добавьте только антитело CD31.
   3. Контроль одного антитела CD45: Добавьте только антитело CD45.
   4. Пример: Добавьте антитела CD31 и CD45.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация антител в образце, а также флуоресцентные конъюгаты должны быть оптимизированы на основе специфических антител и используемого клеточного сортировщика.
9. Гранулируйте клетки центрифугированием в настольной микроцентрифуге 4 °C в течение 5 мин при 1000 х г.
10. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 600 мкл ледяного сортировочного буфера.
11. Процедите образцы через крышки сетчатого фильтра из трубок FACS объемом 5 мл и храните ячейки на льду, защищенном от света, для немедленного FACS.
12. Получите первичные эндотелиальные клетки (CD31⁺ CD45^-), выполнив следующие шаги.
    1. Идентификация CD45-отрицательной клеточной популяции и затвора (CD45^-).
    2. Внутри (CD45^-) идентифицируйте CD31-положительную (CD31⁺) клеточную популяцию и сортируйте клетки в 6 мл ледяного буфера сортировки клеток. Используйте эти ячейки для последующих приложений (см. раздел 5).

5. Анализ для подтверждения фенотипа первичной эндотелиальной клетки

1. Покрыть три скважины из 6-луночной плиты раствором покрытия DLL4 1 мл/скважину в течение 30 мин в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ . В качестве контроля макет покройте три другие скважины плиты 1 мл/скважина PBS.
2. Аспирировать раствор покрытия DLL4 и PBS и пластинчат 25 000 отсортированных первичных эндотелиальных клеток (см. шаг 4.12) в 2 мл среды роста эндотелиальных клеток на лунку.
3. Инкубируют клетки в течение 24 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ .
4. Аспирировать среду над клетками и промыть один раз 2 мл/лунку PBS. Анализ клеток с помощью qPCR или проточной цитометрии (для клеток, экспрессирующих конструкцию FUCCI).
   1. Чтобы проанализировать ячейки с помощью qPCR, выполните следующие действия.
      1. Аспирируйте жидкость над клетками и изолируйте РНК в клетках с помощью набора для экстракции РНК в соответствии с протоколом производителя.
      2. Выполняйте реакции обратной транскрипции с помощью мастер-микса обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
      3. Выполняйте реакции qPCR с мастер-миксом SYBR Green в соответствии с протоколом производителя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые грунтовки (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) перечислены в таблице 1.
   2. Чтобы проанализировать клетки, экспрессирующие конструкцию FUCCI с помощью проточной цитометрии, выполните следующие действия.
      1. Аспирировать жидкость над клетками и добавить 500 мкл/хорошо 0,25% трипсина-ЭДТА.
      2. Инкубируют клетки при 37 °C в 5% CO₂ инкубаторе до подъема, ~5 мин.
      3. Перенесите клетки в микроцентрифужную трубку и гранулируйте ячейки в микроцентрифуге 4 °C в течение 5 мин при 1000 х г.
      4. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 500 мкл буфера анализа цитометрии ледяного потока.
      5. Процедите образцы через крышку сетчатого фильтра трубки FACS объемом 5 мл и храните ячейки на льду, защищенном от света, для немедленного анализа проточной цитометрии.
      6. Проанализируйте процентное соотношение ячеек, покрытых на DLL4, по сравнению с элементом управления PBS в начале G1 (без цвета), позднем G1 (mCherry⁺/mVenus^-), G1/S (mCherry⁺/mVenus⁺) и S/G2/M (mCherry^-/mVenus⁺).

6. Дифференцировка гЭСК к гемогенным эндотелиальным клеткам

ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцировать клетки до первичных ЕС 4-го дня, как описано выше в разделах 3.1-3.6.

1. День 5: Аспирируйте среду над клетками и осторожно промывайте клетки 1 мл DMEM: F12 на лунку. Добавить 1 мл свежеприготовленной гемогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубировать 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
2. День 6: Замените среду над клетками 1 мл свежеприготовленной гемогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
3. День 7: Замените среду над клетками 1 мл свежеприготовленной гемогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте 24 ч (37 °C, 5% CO₂).
4. День 8: FACS изолируют гемогенные эндотелиальные клетки (см. раздел 7).

7. FACS-изоляция гемогенных эндотелиальных клеток

1. Поднимите и промывайте ячейки, как описано выше в разделах 4.1-4.6.
2. Разделите клетки равномерно на микроцентрифужные трубки на льду, каждая из которых содержит минимум 600 мкл клеток при 1 х 10⁵ клетках / мл, для окрашивания антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания гемогенных ЭК на антитела требуется восемь пробирок клеток: контроль незапятнанных, контроль одного антитела CD31, контроль одного антитела CD45, контроль одного антитела KDR, контроль одного антитела c-Kit, контроль одного антитела CD34, контроль одного антитела VE-кадгерина и образец, содержащий все шесть антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Информация об антителах приведена в Таблице материалов.
3. Добавляют антитела в трубки, содержащие клетки, по мере необходимости, и инкубируют на льду и защищают от света в течение 30 мин.
   1. Незапятнанный контроль: не добавляйте антитела.
   2. Контроль одного антитела CD31: Добавьте только антитело CD31.
   3. Контроль одного антитела CD45: Добавьте только антитело CD45.
   4. Контроль одного антитела KDR: Добавляйте только антитела KDR.
   5. Контроль одного антитела c-Kit: Добавьте только антитело c-Kit.
   6. Контроль одного антитела CD34: Добавьте только антитело CD34.
   7. Контроль одного антитела к VE-кадгерину: добавляйте только антитела к VE-кадгерину.
   8. Образец: Добавление антител к CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 и VE-кадгерину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация антител в образце, а также флуоресцентные конъюгаты должны быть оптимизированы на основе специфических антител и используемого клеточного сортировщика.
4. Гранулирование клеток центрифугированием в микроцентрифуге 4 °C в течение 5 мин при 1000 х г.
5. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 600 мкл ледяного сортировочного буфера.
6. Процедите образцы через крышку сетчатого фильтра из 5 мл трубок FACS и храните ячейки на льду, защищенном от света, для немедленного FACS.
7. Для получения гемогенных эндотелиальных клеток (CD31⁺ KDR⁺ c-Kit⁺ CD34⁺ VE-Cadherin-CD45^-) выполните следующие действия.
   1. Идентификация популяции и затвора CD45-клеток (CD45^-).
   2. Внутри (CD45^-) идентифицируйте клеточную популяцию CD31⁺ и затвор (CD31⁺).
   3. Внутри (CD31⁺) идентифицируют VE-кадгерин-клеточную популяцию и ворота (CDH5^-).
   4. Внутри (CDH5^-) определите популяцию клеток c-Kit⁺ и ворота (KIT⁺).
   5. Внутри (KIT⁺) определите популяцию клеток CD34⁺ и ворота (CD34⁺).
   6. Внутри (CD34⁺) идентифицируйте и сортируйте ячейки KDR⁺ в буфер сортировки ледяных и холодных клеток объемом 6 мл. Используйте эти ячейки в последующих приложениях (см. раздел 8).

8. Анализ колониеобразующих единиц

1. Разморозьте аликвоты среды на основе метилцеллюлозы в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одной аликвоты 3 мл достаточно для двух образцов и одной аликвоты 4 мл для трех образцов.
2. Подсчитайте отсортированные гемогенные эндотелиальные клетки, полученные на стадии 7.7.
3. Следуя инструкциям производителя, рассчитайте объем отсортированных клеток для добавления к каждой среде на основе метилцеллюлозы, чтобы каждый образец содержал не менее 1000 гемогенных эндотелиальных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек может быть скорректировано по мере необходимости.
4. Добавьте расчетный объем клеток в среду на основе метилцеллюлозы, аликвоту и вихрь тщательно. Дайте средним культурам на основе метилцеллюлозы посидеть при комнатной температуре в течение 10 минут или до тех пор, пока пузырьки не рассеются.
5. Аспирировать раствор фибронектина из приготовленной посуды толщиной 35 мм. Следуя инструкциям производителя, дозируйте 1 мл средней культуры на основе метилцеллюлозы на тарелку толщиной 35 мм. Аккуратно поверните блюдо, чтобы равномерно распределить культуру.
6. Поместите эти 35-миллиметровые блюда, а также две дополнительные 35-миллиметровые тарелки, наполненные стерильной водой, в 15-сантиметровую чашку для культуры тканей.
7. Инкубируйте культуры в инкубаторе 37 ° C, 5% CO₂ и наблюдайте за культурами в дни 8 и 14.
   1. На 8 день подсчитайте колонии КОЕ-Е и БФУ-Е.
   2. На 14-й день подсчитайте колонии КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЕММ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству по среде на основе метилцеллюлозы для морфологической идентификации типов колоний.

Результаты

Схема, описывающая спецификацию первичных ЕС и гемогенных ЕС из hESCs, а также репрезентативное изображение клеток через 24 ч после покрытия показаны на рисунке 1. В соответствии со спецификацией, первичные ЕС и гемогенные ЕС очищаются FACS на 5 и 8 день соответственно. Первичн...

Обсуждение

В настоящем описаны этапы получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю с использованием мышиной питательной и бессывороточной 2D-культуральной системы (рисунок 1). Этот протокол расширяет метод, описанный Sri...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm dishes	Corning	430599	tissue culture treated
35 mm dishes	Corning	430165	tissue culture treated
6-well plates	Corning	3516	tissue culture treated
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R&D systems	233-FB-025	use at 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispase	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R&D systems	1506-D4/CF	recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Lonza	CC-3162
FACS tubes	Corning	352235	polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectin	ThermoFisher Scientific	33016015	use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Matrix protein  Brand Name: Matrigel	Corning	356230	Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched	Stemcell Technologies	4435
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2	Stemcell Technologies	5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)	Gibco	12040077
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625-50mg	use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix	BioRad	1708840
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μg/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.