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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Abstract

I vasi sanguigni sono distribuiti ubiquitariamente all'interno di tutti i tessuti del corpo e svolgono diverse funzioni. Pertanto, la derivazione di cellule endoteliali vascolari mature, che rivestono i lumi dei vasi sanguigni, da cellule staminali pluripotenti umane è cruciale per una moltitudine di applicazioni di ingegneria e rigenerazione tissutale. In vivo, le cellule endoteliali primordiali derivano dalla linea mesodermica e sono specificate verso sottotipi specifici, tra cui arterioso, venoso, capillare, emogenico e linfatico. Le cellule endoteliali emogeniche sono di particolare interesse perché, durante lo sviluppo, danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, che generano quindi tutte le linee di sangue per tutta la vita. Pertanto, la creazione di un sistema per generare cellule endoteliali emogeniche in vitro offrirebbe l'opportunità di studiare la transizione endoteliale-ematopoietica e potrebbe portare alla produzione ex vivo di prodotti sanguigni umani e a una ridotta dipendenza da donatori umani. Mentre esistono diversi protocolli per la derivazione di cellule endoteliali progenitrici e primordiali, non è stata descritta la generazione di cellule endoteliali emogeniche ben caratterizzate da cellule staminali umane. Qui viene presentato un metodo per la derivazione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana: un protocollo di differenziazione con cellule striate primitive formate in risposta all'inibitore GSK3β (CHIR99021), quindi induzione della linea mesodermica mediata da bFGF, seguita dallo sviluppo di cellule endoteliali primordiali promosso da BMP4 e VEGF-A, e infine specificazione di cellule endoteliali emogeniche indotte dall'acido retinoico. Questo protocollo produce una popolazione ben definita di cellule endoteliali emogeniche che possono essere utilizzate per comprendere ulteriormente la loro regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica, che ha il potenziale per essere applicata alle applicazioni terapeutiche a valle.

Introduzione

Le cellule endoteliali (ECs) sono una popolazione eterogenea di cellule che svolgono molteplici funzioni in tutto il corpo umano e nei tessuti ingegnerizzati. Oltre a sostenere e regolare altri tipi di cellule (ad esempio, cardiomiociti1, cellule osteoblastiche2), queste funzioni includono la formazione di una barriera selettiva tra sangue e tessuti e l'assistenza nella formazione dei tessuti3. La differenziazione delle EC mature durante lo sviluppo normale richiede diverse vie di segnalazione. Le EC primordiali derivano dai progenitori del mesoderma e sono quindi specificate verso fenotipi arteriosi, venosi, capillari e linfatici maturi4. Inoltre, un piccolo sottogruppo di EC nel sacco vitellino extraembrionale e nella regione embrionale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) sono anche specificati per diventare EC emogeniche, che danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) che migrano verso il fegato fetale e il midollo osseo fetale, dove rimangono postnatali e generano tutti i tipi di cellule del sangue per tutta la vita4. La vasta gamma di fenotipi EC è essenziale per lo sviluppo e il mantenimento di tutti i tessuti.

Pertanto, le EC e i loro derivati sono componenti critiche di studi volti a modellare e chiarire i meccanismi dello sviluppo umano e / o delle malattie, nonché della medicina rigenerativa e delle applicazioni di ingegneria tissutale 5,6,7,8. Tuttavia, la limitazione principale per questi tipi di studi è la mancanza di disponibilità di EC umane primarie nella quantità richiesta. È stato stimato che per la maggior partedelle applicazioni terapeutiche sarebbero necessarie almeno 3 x 108 CE. Per risolvere questo problema, è stato proposto l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) a causa del loro diverso potenziale di lignaggio e della loro capacità di generare un gran numero di progenie 6,9.

Infatti, l'utilità delle cellule derivate da hESCs o hiPSCs è stata dimostrata in molteplici studi incentrati sulla modellizzazione della malattia e sullo screening dei farmaci10,11,12. La tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) è stata utilizzata per ricapitolare più fedelmente la fisiologia del corpo umano integrando cellule e tessuti in scaffold tridimensionali. Inoltre, la connessione di più OOC individuali (un cosiddetto body- o human-on-a-chip, BOC / HOC) può essere realizzata tramite microfluidica per consentire la diafonia tra gli organi di interesse13,14,15. I tessuti di supporto, come il sistema vascolare, sono componenti critici di OOC e BOC / HOC; L'incorporazione della vascolarizzazione consente il trasporto di nutrienti, ossigeno e fattori paracrini in tutti i tessuti, promuovendo così il microambiente tessuto-specifico richiesto 3,12. Pertanto, i metodi per derivare EC umane mature, come le EC arteriose, venose, linfatiche ed emogeniche, sono cruciali per far progredire questi approcci di ingegneria tissutale.

Sono stati pubblicati protocolli multipli che descrivono in dettaglio le fasi per la derivazione di EC primordiali o progenitrici umane da hESC o hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Molti di questi protocolli si basano sulla formazione di corpi embrioidi (EB) o sulla co-coltura di ESCs/iPSCs con uno strato murino di cellule stromali. Queste strategie tendono ad essere difficili e richiedono tempo, con basse rese EC e / o contaminazione di EC umane con cellule murine. I protocolli che si basano strettamente sulla coltura 2D senza l'uso di cellule stromali spesso richiedono lunghe induzioni, utilizzano complesse combinazioni di fattori di crescita e / o inibitori per l'induzione, hanno periodi di espansione prolungati dopo la separazione cellulare o una combinazione di questi fattori. L'avanzamento della conoscenza delle vie di segnalazione e dei fattori coinvolti nella derivazione di tipi maturi di EC in vivo fornisce le basi per un protocollo di differenziazione in vitro semplice e robusto.

In precedenza, sono stati identificati ruoli chiave per le vie di segnalazione di Notch e acido retinoico (RA) nella specifica delle EC arteriose murine ed emogeniche, rispettivamente, durante lo sviluppo. La via di segnalazione di Notch svolge molteplici ruoli nella specificazione e nel mantenimento del fenotipo EC arterioso. Il lavoro che utilizza il modello di vascolarizzazione retinica murina ha identificato un percorso in cui lo stress di taglio del fluido induce un asse di segnalazione Notch-Cx37-p27, promuovendo l'arresto del ciclo cellulare G1, che consente la specifica EC arteriosa27. È stato ipotizzato che gli stati del ciclo cellulare svolgano un ruolo nelle decisioni sul destino cellulare fornendo finestre di opportunità distinte in cui le cellule sono ricettive a determinati segnali che possono indurre espressione genica e cambiamenti fenotipici28. Questo arresto G1 mediato da Notch ha permesso l'espressione di geni arricchiti nelle EC arteriose, tra cui ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (recensito in29,30). È stato anche dimostrato che la specifica EMOGENIC EC è promossa in vivo tramite la segnalazione RA31,32. Ulteriori studi hanno identificato che, a valle della segnalazione RA, l'espressione di c-Kit e Notch upregola p27, che consente la specificazione emogenica nel sacco vitellino murino e AGM33. Le EC emogeniche murine possono essere minimamente identificate dall'espressione di entrambi i marcatori endoteliali (CD31, KDR) ed ematopoietici (c-Kit, CD34)4. Infine, le EC emogeniche subiscono una transizione endoteliale-ematopoietica (EHT) per formare HSPC, che può dare origine a tutti i tipi di cellule del sangue 4,34,35.

Lavori recenti hanno testato se questa stessa gerarchia di segnalazione può promuovere la specifica EC ematogena umana. Per fare ciò, è stato sviluppato un protocollo di coltura 2D privo di siero e alimentatore per derivare EC emogeniche da hESC, e queste EC emogeniche sono state caratterizzate a livello di singola cellula come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Questo studio ha anche sfruttato il reporter FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), che identifica diversi stati del ciclo cellulare, utilizzando H9-hESC che esprimono il costrutto del reporter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Negli studi con queste cellule, è stato dimostrato che l'AR promuove l'arresto precoce del ciclo cellulare G1 nelle EC e lo stato precoce di G1 consente la specifica ematogena in vitro37. Qui viene fornito un protocollo dettagliato per la differenziazione di queste cellule endoteliali emogeniche umane e saggi che confermano la loro identità. Questo semplice metodo fornisce un mezzo utile per generare questo sottoinsieme specializzato di EC per studi futuri sui meccanismi di sviluppo delle cellule del sangue umano.

Protocollo

1. Reagenti e preparazione dei reagenti

NOTA: un elenco dei reagenti è fornito nella tabella dei materiali.

  1. Ottenere le linee di cellule staminali pluripotenti umane: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    NOTA: La generazione di EC emogeniche può essere più efficiente nella linea cellulare H1.
  2. Preparare le scorte di proteine della matrice: Aliquotare la proteina della matrice in provette pre-refrigerate da 1,5 mL (su ghiaccio) in modo che ogni provetta contenga 1 mg di proteine della matrice. 1 mg di proteina della matrice è sufficiente per rivestire tutti i pozzetti di due piastre da 6 pozzetti (12 pozzetti in totale). Conservare le aliquote a -20 °C fino all'uso.
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la proteina della matrice su ghiaccio o a 4 °C. Scongelare il flaconcino congelato di proteine della matrice su ghiaccio a 4 °C durante la notte. Una volta scongelato, ruotare il flaconcino per assicurarsi che il contenuto sia mescolato. Preraffreddare le provette da microcentrifuga da 1,5 mL per almeno 1 ora a -20 °C e trasferirle sul ghiaccio immediatamente prima dell'aliquotazione.
  3. Preparare piastre rivestite di proteine della matrice: scongelare aliquote proteiche della matrice su ghiaccio a 4 °C. Aggiungere 12,5 ml di DMEM:F12 ghiacciato a un tubo conico prerefrigerato su ghiaccio. Utilizzando le punte delle pipette pre-refrigerate, trasferire un'aliquota (1 mg) di proteine della matrice nel tubo conico e mescolare bene mediante pipettaggio su e giù. Aliquot 1 mL di proteina della matrice diluita in ciascun pozzetto di piastre a 6 pozzetti prerefrigerate (su ghiaccio) utilizzando una pipetta sierologica prerefrigerata. Ruotare e scuotere le piastre in modo che l'intero pozzo sia rivestito uniformemente. Incubare le piastre per un minimo di 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alla proteina della matrice di solidificarsi. Avvolgere le piastre con parafilm e conservare a 4 °C fino all'uso. Utilizzare piastre rivestite di proteine della matrice entro 2 settimane dalla preparazione.
    NOTA: Utilizzare le piastre a 6 pozzetti rivestite di proteine della matrice per il passaggio di routine delle cellule e la differenziazione in cellule endoteliali primordiali ed emogeniche. Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio. Pre-raffreddare le piastre a 6 pozzetti, le punte delle pipette, le pipette sierologiche e i tubi conici prima dell'uso per almeno 1 ora a -20 °C. Trasferire questi oggetti sul ghiaccio quando sono pronti per l'uso.
  4. Preparare il terreno di differenziazione di base aggiungendo 5 ml di PFHM a 100 ml di terreno di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti. Conservare a 4 °C.
  5. Preparare lo 0,1% di BSA-PBS sciogliendo 0,1 g di BSA in 100 mL di PBS. Filtrare sterilizzare BSA-PBS passando attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
  6. Preparare 5 mM HCl diluendo il brodo HCl (12 M) 1:2.400 con acqua. Regolare il pH a 3,0 utilizzando NaOH. Filtrare sterilizzare la soluzione passando attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
  7. Preparare le scorte di bFGF, BMP4, VEGF-A, acido retinoico (RA) e DLL4.
    1. bFGF: ricostituire la polvere liofilizzata a 100 μg/mL in BSA-PBS allo 0,1%. Aliquote e conservare a -20 °C. Utilizzare le scorte bFGF entro 3 mesi dalla preparazione. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
    2. BMP4: Ricostituire la polvere liofilizzata a 1 mg/ml in 5mM HCl, pH 3,0. Diluire ulteriormente a 50 μg/mL in BSA-PBS allo 0,1%. Aliquote e conservare a -20 °C. Utilizzare le scorte BMP4 entro 3 mesi dalla preparazione. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
    3. VEGF-A: Ricostituire la polvere liofilizzata a 1 mg/mL in dH2O. Diluire ulteriormente a 100 μg/mL in BSA-PBS allo 0,1%. Aliquote e conservare a -20 °C. Utilizzare le scorte VEGF-A entro 3 mesi dalla preparazione. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
    4. RA: Ricostituire la polvere liofilizzata a 100 mM in DMSO. Aliquote e conservare a -80 °C. Utilizzare le scorte RA entro 1 mese dalla preparazione. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
      NOTA: proteggere le scorte RA dalla luce.
    5. DLL4: Ricostituire la polvere liofilizzata a 1 mg/mL in PBS. Aliquote e conservare a -20 °C. Utilizzare le scorte DLL4 entro 12 mesi dalla preparazione. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
  8. Preparare il mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali immediatamente prima dell'uso diluendo VEGF-A e BMP4 nel mezzo di differenziazione basale (fase 1.4) in modo che le concentrazioni finali siano rispettivamente di 25 ng/ml e 50 ng/ml.
  9. Preparare l'AR di lavoro immediatamente prima dell'uso diluendo 100 mM di stock da 1:1.000 in DMSO a 100 μM.
    NOTA: proteggere RA funzionante dalla luce.
  10. Preparare il mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali emogeniche immediatamente prima dell'uso diluendo VEGF-A, BMP4 e RA funzionante nel mezzo di differenziazione della base (fase 1.4) in modo che le concentrazioni finali siano rispettivamente 25 ng / mL, 50 ng / ml e 0,5 μM.
  11. Preparare il tampone anticorpale producendo HBSS contenente il 10% di FBS e integrare con reagente antimicrobico diluito 1:500. Filtrare sterile il tampone e utilizzare immediatamente.
  12. Preparare il tampone di selezione cellulare facendo HBSS contenente FBS all'1% e integrare con reagente antimicrobico diluito 1:500. Filtrare sterile il tampone e utilizzare immediatamente.
  13. Preparare 1 mg/mL di scorte di fibronectina aggiungendo 5 mL di acqua sterile a 5 mg di fibronectina liofilizzata. Aliquote e conservare a -20 °C. Utilizzare le scorte di fibronectina prima della data di scadenza sull'etichetta del prodotto liofilizzato. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
  14. Preparare i piatti da 35 mm rivestiti di fibronectina. Diluire le scorte di fibronectina (1 mg/ml) a 4 μg/ml in acqua sterile. Aggiungere 1 mL di questa soluzione di rivestimento di fibronectina a ciascun piatto e incubare a 37 °C per 30 minuti a 1 ora. Utilizzare i piatti immediatamente dopo il rivestimento.
  15. Preparare 3 o 4 mL di aliquote di terreno a base di metilcellulosa seguendo le istruzioni del produttore. Conservare le aliquote a -20 °C fino all'uso. Utilizzare le aliquote del mezzo a base di metilcellulosa prima della data di scadenza indicata sull'etichetta del prodotto stock. Scongelare le aliquote immediatamente prima dell'uso.
  16. Preparare la soluzione di rivestimento DLL4 diluendo lo stock di DLL4 umano ricombinante a una concentrazione finale di 10 μg/mL in PBS.
  17. Preparare e conservare il mezzo di crescita delle cellule endoteliali secondo le istruzioni del produttore.
  18. Preparare il tampone di analisi della citometria a flusso producendo PBS contenente lo 0,1% di BSA. Filtrare il tampone sterile e conservare a 4 °C fino all'uso.

2. Coltura cellulare e passaggio di hESCs

  1. Lasciare che le piastre rivestite di proteine della matrice, il mezzo di crescita delle cellule staminali e DMEM: F12 si riscaldino a temperatura ambiente.
  2. Far crescere le linee cellulari hESC in terreno di crescita delle cellule staminali (2 mL/pozzetto) su piastre a 6 pozzetti rivestite di proteine della matrice in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 .
  3. Controllare le celle ogni giorno e rimuovere le cellule differenziate se necessario raschiandole delicatamente dalla piastra con una punta per pipetta p200.
    NOTA: Le cellule differenziate appariranno alla periferia delle colonie. Fare riferimento al manuale del prodotto del terreno di crescita delle cellule staminali per esempi di cellule differenziate in coltura.
  4. Passare le cellule una volta raggiunta la confluenza del 70% -80%. Per passare le celle, attenersi alla seguente procedura.
    NOTA: Le cellule devono essere divise prima di raggiungere il 70% -80% di confluenza se si verifica una maggiore differenziazione.
    1. Rimuovere il mezzo sopra le cellule e lavare delicatamente con 1 mL di DMEM:F12 per pozzetto.
    2. Aggiungere 1 mL di DMEM:F12 per pozzetto.
    3. Aggiungere 160 μL/mL di Dispase per pozzetto e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 45 minuti.
    4. Dopo l'incubazione di Dispase, aggiungere un ulteriore 1 mL di DMEM:F12 per pozzetto e pipettare delicatamente per sollevare le cellule.
      NOTA: Evitare di dissociare le cellule in una sospensione a cella singola. Passare le cellule come piccoli grumi.
    5. Trasferire le cellule in un tubo conico contenente 12 ml di DMEM: F12 e lasciare che le cellule si depositino per gravità (~5-10 min).
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 0,5 ml di terreno di crescita delle cellule staminali per pozzetto di cellule sollevate per ottenere piccoli grumi di cellule.
      NOTA: Evitare di dissociare le cellule in una sospensione a cella singola. Passare le cellule come piccoli grumi.
    7. Aspirare la soluzione di rivestimento proteico della matrice dai pozzetti della piastra rivestita di proteine della matrice preparata e aggiungere 1,5 ml del mezzo di crescita delle cellule staminali per pozzetto.
    8. Aggiungere il volume desiderato di cellule risospese (punto 2.4.6) a ciascun pozzetto della piastra rivestita di proteine della matrice preparata.
    9. Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 . Cambiare il terreno ogni 24 ore in terreno di crescita di cellule staminali fresche.

3. Differenziazione di hESCs in cellule endoteliali primordiali

  1. Giorno -1: Coltura e passaggio delle cellule come descritto sopra nella sezione 2. Seminare le cellule (fase 2.4.6) in piccoli grumi (~50 μm) ad una densità di circa 2 grumi per centimetro quadrato38.
    NOTA: Valutare la densità del seme e perfezionarla empiricamente se necessario.
  2. Giorno 0: 24 ore dopo aver seminato le cellule, aspirare il terreno da ciascun pozzetto e lavare delicatamente le cellule con 1 mL di DMEM:F12 per pozzetto. Aggiungere 1 mL del mezzo di differenziazione di base contenente 5 μM di GSK3i (CHIR99021, aggiunto fresco) a ciascun pozzetto e incubare per 24 ore (37 °C, 5% CO2).
    NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio, aggiungere lentamente il mezzo di lavaggio indicato alla piastra mediante pipettaggio contro la parete del pozzetto della piastra. Ruotare delicatamente la piastra in modo che l'intera superficie del pozzetto sia coperta da mezzi di lavaggio. Inclinare leggermente la piastra in modo che i supporti di lavaggio si trovino a ore sei e aspirare con cura il mezzo di lavaggio.
  3. Giorno 1: aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e lavare delicatamente le cellule con 1 mL di DMEM: F12 per pozzetto. Aggiungere 1 mL del mezzo di differenziazione di base contenente 50 ng/mL di bFGF (aggiunto fresco, 1:2.000 da brodo congelato) in ciascun pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  4. Giorno 2: aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e lavare delicatamente le cellule con 1 mL di DMEM: F12 per pozzetto. Aggiungere 1 mL del mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali a ciascun pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  5. Giorno 3: Sostituire il mezzo sopra le cellule con 1 mL di terreno di differenziazione delle cellule endoteliali appena preparato per pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  6. Giorno 4: Sostituire il terreno sopra le cellule con 1 mL di terreno di differenziazione delle cellule endoteliali appena preparato per pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  7. Giorno 5: Le FACS purificano le cellule per valutare il fenotipo EC (sezioni 4-5) o mantengono in coltura e differenziano verso cellule endoteliali emogene (paragrafo 6).

4. Purificazione FACS delle cellule endoteliali primordiali

  1. Aspirare il mezzo sopra le cellule e lavare delicatamente una volta con 1 mL di DMEM:F12 per pozzetto.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare per pozzetto e incubare le cellule per 12 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 o fino a quando le cellule non si sono dissociate.
  3. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico contenente 12 ml di DMEM:F12 e pellet mediante centrifugazione per 5 minuti, 1.000 x g.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 12 ml di DMEM:F12 per lavare.
  5. Pellettare le celle mediante centrifugazione per 5 minuti, 1.000 x g.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in tampone anticorpale ghiacciato e contare le cellule. Regolare la concentrazione utilizzando un tampone anticorpale ghiacciato a 1 x 105 cellule / ml.
  7. Dividere uniformemente le cellule in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 μL di cellule a 1 x 105 cellule/ml, per la colorazione degli anticorpi.
    NOTA: Sono necessarie quattro provette di cellule per la colorazione delle EC primordiali: controllo non colorato, controllo degli anticorpi singoli CD31, controllo degli anticorpi singoli CD45 e campione contenente anticorpi CD31 e CD45. Le informazioni sugli anticorpi sono fornite nella tabella dei materiali.
  8. Aggiungere anticorpi alle provette contenenti cellule, a seconda dei casi, e incubare su ghiaccio e proteggere dalla luce per 30 minuti.
    1. Controllo non macchiato: Non aggiungere alcun anticorpo.
    2. Controllo degli anticorpi singoli CD31: aggiungere solo l'anticorpo CD31.
    3. Controllo degli anticorpi singoli CD45: aggiungere solo l'anticorpo CD45.
    4. Campione: aggiungere entrambi gli anticorpi CD31 e CD45.
      NOTA: La concentrazione finale di anticorpi nel campione, così come i coniugati fluorescenti, devono essere ottimizzati in base agli anticorpi specifici e al selezionatore cellulare utilizzato.
  9. Pellettare le celle mediante centrifugazione in una microcentrifuga da tavolo a 4 °C per 5 minuti a 1.000 x g.
  10. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 600 μL di tampone di selezione ghiacciato.
  11. Filtrare i campioni attraverso i tappi filtranti a rete di tubi FACS da 5 ml e conservare le celle su ghiaccio, al riparo dalla luce, per un FACS immediato.
  12. Ottenere cellule endoteliali primordiali (CD31+ CD45-), eseguendo i seguenti passaggi.
    1. Identificare la popolazione cellulare CD45-negativa e il gate (CD45-).
    2. All'interno (CD45-), identificare la popolazione cellulare CD31-positiva (CD31+) e ordinare le cellule in 6 mL di buffer di selezione delle cellule ghiacciate. Utilizzare queste celle per applicazioni a valle (vedere paragrafo 5).

5. Saggio per confermare il fenotipo delle cellule endoteliali primordiali

  1. Rivestire tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL/pozzetto di soluzione di rivestimento DLL4 per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 . Come controllo, rivestire gli altri tre pozzetti della piastra con 1 mL/pozzetto di PBS.
  2. Aspirare la soluzione di rivestimento DLL4 e PBS e placcare 25.000 cellule endoteliali primordiali selezionate (vedere punto 4.12) in 2 ml di terreno di crescita delle cellule endoteliali per pozzetto.
  3. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .
  4. Aspirare il mezzo sopra le celle e lavare una volta con 2 mL/pozzetto PBS. Analizzare le cellule mediante qPCR o citometria a flusso (per le cellule che esprimono il costrutto FUCCI).
    1. Per analizzare le celle mediante qPCR, attenersi alla seguente procedura.
      1. Aspirare il liquido sopra le cellule e isolare l'RNA nelle cellule utilizzando un kit di estrazione dell'RNA secondo il protocollo del produttore.
      2. Eseguire reazioni di trascrizione inversa con un master mix di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
      3. Eseguire reazioni qPCR con un master mix SYBR Green secondo il protocollo del produttore.
        NOTA: I primer utilizzati (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) sono elencati nella Tabella 1.
    2. Per analizzare le cellule che esprimono il costrutto FUCCI mediante citometria a flusso, eseguire i seguenti passaggi.
      1. Aspirare il liquido sopra le cellule e aggiungere 500 μL/pozzetto 0,25% tripsina-EDTA.
      2. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 fino a sollevamento, ~5 min.
      3. Trasferire le cellule in un tubo di microcentrifuga e pellettare le celle in una microcentrifuga a 4 °C per 5 minuti a 1.000 x g.
      4. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone per analisi citometrica a flusso ghiacciato.
      5. Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di una provetta FACS da 5 mL e conservare le cellule su ghiaccio, al riparo dalla luce, per un'analisi citometrica a flusso immediata.
      6. Analizza la percentuale di cellule placcate sul controllo DLL4 rispetto al PBS nei primi G1 (nessun colore), G1 tardivo (mCherry + / mVenus-), G1 / S (mCherry + / mVenus +) e S / G2 / M (mCherry-/mVenus +).

6. Differenziamento di hESCs in cellule endoteliali emogeniche

NOTA: Differenziare le cellule in base alle EC primordiali del giorno 4, come descritto sopra nei paragrafi 3.1-3.6.

  1. Giorno 5: aspirare il mezzo sopra le cellule e lavare delicatamente le cellule con 1 mL di DMEM: F12 per pozzetto. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  2. Giorno 6: Sostituire il terreno sopra le cellule con 1 mL di terreno di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  3. Giorno 7: Sostituire il terreno sopra le cellule con 1 mL di terreno di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare 24 ore (37 °C, 5% CO2).
  4. Giorno 8: FACS isola le cellule endoteliali emogeniche (vedere paragrafo 7).

7. FACS-isolamento di cellule endoteliali emogeniche

  1. Sollevare e lavare le celle come descritto sopra nei paragrafi 4.1-4.6.
  2. Dividere uniformemente le cellule in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 μL di cellule a 1 x 105 cellule/ml, per la colorazione degli anticorpi.
    NOTA: Sono necessarie otto provette di cellule per la colorazione anticorpale delle EC emogeniche: controllo non colorato, controllo degli anticorpi singoli CD31, controllo degli anticorpi singoli CD45, controllo degli anticorpi singoli KDR, controllo degli anticorpi singoli c-Kit, controllo degli anticorpi singoli CD34, controllo degli anticorpi singoli VE-caderina e campione contenente tutti e sei gli anticorpi.
    NOTA: le informazioni sugli anticorpi sono fornite nella tabella dei materiali.
  3. Aggiungere anticorpi alle provette contenenti cellule, a seconda dei casi, e incubare su ghiaccio e proteggere dalla luce per 30 minuti.
    1. Controllo non macchiato: non aggiungere anticorpi.
    2. Controllo degli anticorpi singoli CD31: aggiungere solo l'anticorpo CD31.
    3. Controllo degli anticorpi singoli CD45: aggiungere solo l'anticorpo CD45.
    4. Controllo degli anticorpi singoli KDR: aggiungere solo l'anticorpo KDR.
    5. Controllo anticorpale singolo c-Kit: Aggiungere solo l'anticorpo c-Kit.
    6. Controllo anticorpale singolo CD34: aggiungere solo l'anticorpo CD34.
    7. Controllo degli anticorpi VE-caderina singola: aggiungere solo l'anticorpo VE-caderina.
    8. Campione: aggiungere anticorpi CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 e VE-caderina.
      NOTA: La concentrazione finale di anticorpi nel campione, così come i coniugati fluorescenti, devono essere ottimizzati in base agli anticorpi specifici e al selezionatore cellulare utilizzato.
  4. Pellettare le celle mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 4 °C per 5 minuti a 1.000 x g.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 600 μL di tampone di selezione ghiacciato.
  6. Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di tubi FACS da 5 ml e conservare le celle su ghiaccio, al riparo dalla luce, per un FACS immediato.
  7. Per ottenere cellule endoteliali emogeniche (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-), attenersi alla seguente procedura.
    1. Identificare la popolazione cellulare CD45- e il gate (CD45-).
    2. All'interno (CD45-), identificare la popolazione cellulare CD31+ e il gate (CD31+).
    3. All'interno (CD31+), identificare la popolazione cellulare VE-caderina e il gate (CDH5-).
    4. All'interno di (CDH5-), identificare la popolazione cellulare c-Kit+ e il gate (KIT+).
    5. All'interno (KIT+), identificare la popolazione cellulare CD34+ e il gate (CD34+).
    6. All'interno (CD34+), identificare e ordinare le celle KDR+ in 6 mL di buffer di selezione delle celle ghiacciate. Utilizzare queste celle nelle applicazioni a valle (vedere paragrafo 8).

8. Saggio dell'unità formante colonie

  1. Scongelare le aliquote del mezzo a base di metilcellulosa seguendo le istruzioni del fabbricante.
    NOTA: un'aliquota da 3 ml è sufficiente per due campioni e un'aliquota da 4 ml è sufficiente per tre campioni.
  2. Contare le cellule endoteliali emogeniche selezionate ottenute al punto 7.7.
  3. Seguendo le istruzioni del produttore, calcolare il volume di cellule selezionate da aggiungere a ciascuna aliquota di mezzo a base di metilcellulosa in modo che ogni campione contenga un minimo di 1.000 cellule endoteliali emogene.
    NOTA: il numero di celle può essere regolato secondo necessità.
  4. Aggiungere accuratamente il volume calcolato di cellule all'aliquota e al vortice del mezzo a base di metilcellulosa. Lasciare riposare le colture di terreno a base di metilcellulosa a temperatura ambiente per 10 minuti o fino a quando le bolle non si dissipano.
  5. Aspirare la soluzione di rivestimento di fibronectina dai piatti da 35 mm preparati. Seguendo le istruzioni del produttore, erogare 1 mL di coltura di terreno a base di metilcellulosa per capsula da 35 mm. Ruotare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente la cultura.
  6. Posizionare questi piatti da 35 mm, oltre a due piatti aggiuntivi da 35 mm riempiti con acqua sterile, all'interno di un piatto di coltura di tessuto da 15 cm.
  7. Incubare le colture in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e osservare le colture nei giorni 8 e 14.
    1. Il giorno 8, conta le colonie CFU-E e BFU-E.
    2. Il giorno 14, conta le colonie CFU-GM e CFU-GEMM.
      NOTA: Fare riferimento al manuale del mezzo a base di metilcellulosa per l'identificazione morfologica dei tipi di colonia.

Risultati

Uno schema che delinea le specifiche delle EC primordiali e delle EC emogeniche dalle hESC e un'immagine rappresentativa delle cellule 24 ore dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 1. Seguendo le specifiche, le EC primordiali e le EC emogeniche sono FACS purificate rispettivamente nei giorni 5 e 8. Le EC primordiali sono definite come CD31+ CD45- e le EC emogeniche sono definite come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-...

Discussione

Qui, vengono delineati i passaggi per la produzione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana utilizzando un sistema di coltura 2D senza siero e alimentatore murino (Figura 1). Questo protocollo espande un metodo descritto da Sriram et al. (2015) per ottenere EC primordiali38. La natura primordiale e il potenziale di specificazione delle EC CD31+ CD45- sono dimostrate coltivando queste cellule su...

Divulgazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalle sovvenzioni NIH HL128064 e U2EB017103. Un ulteriore supporto è stato fornito dalla sovvenzione CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
15 cm dishesCorning430599tissue culture treated
35 mm dishesCorning430165tissue culture treated
6-well platesCorning3516tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR&D systems233-FB-025use at 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispaseStemcell Technologies7913
DLL4R&D systems1506-D4/CFrecombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		LonzaCC-3162
FACS tubesCorning352235polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinThermoFisher Scientific33016015use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095
Hydrochloric Acid (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		Corning356230Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Retinoic AcidSigma AldrichR2625-50mguse at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		BioRad1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560.25%
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20use at 50 ng/mL
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μg/mL*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μg/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

Riferimenti

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).

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