分离人原代瓣膜细胞进行体外疾病建模

摘要

该协议描述了在外科主动脉瓣置换手术期间或从尸体组织中提取的人主动脉瓣的收集，以及随后对患者特异性原发性瓣膜内皮和间质细胞的分离、扩增和表征。其中包括有关确保细胞活力和表型特异性所需过程的重要细节。

摘要

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）存在于近三分之一的老年人口中。主动脉瓣增厚、变硬和钙化会导致主动脉瓣狭窄，并导致心力衰竭和卒中。疾病发病机制是多因素的，炎症、细胞外基质重塑、湍流、机械应力和应变等应激有助于瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞的成骨分化。然而，驱动健康细胞向钙化细胞成骨转变的精确起始因素尚未完全确定。此外，CAVD诱导的主动脉瓣狭窄目前唯一的治疗方法是主动脉瓣置换术，即切除自体瓣膜（外科主动脉瓣置换术，SAVR）或通过导管插入完全可塌陷的置换瓣膜（经导管主动脉瓣置换术，TAVR）。这些外科手术成本高，风险严重;因此，确定药物发现的新治疗靶点势在必行。为此，本研究开发了一种工作流程，其中手术从患者和供体尸体组织中取出的组织用于创建患者特异性的瓣膜细胞原系，用于体外疾病建模。该协议引入了通常用于器官移植的冷藏解决方案的利用，以减少组织切除和实验室处理之间通常很长的获取时间造成的损害，从而大大稳定了切除组织的细胞。本研究的结果表明，分离的瓣膜细胞在从供体中取出瓣膜后数天以上在培养物中保留其增殖能力以及内皮和间质表型。使用这些材料可以收集对照细胞和CAVD细胞，从中建立对照细胞系和疾病细胞系。

引言

钙化性主动脉瓣疾病 （CAVD） 是一种以炎症、纤维化和主动脉瓣叶大钙化为特征的慢性病理学。小叶的进行性重塑和钙化（称为主动脉硬化症）可导致血流受阻（主动脉瓣狭窄），从而导致中风并导致心力衰竭。目前CAVD的唯一治疗方法是手术或经导管主动脉瓣置换术（分别为SAVR和TAVR）。没有非手术选择来阻止或逆转CAVD进展，如果不进行瓣膜置换，死亡率在2-3年内接近50%¹，^2，3。定义驱动这种病理学的潜在机制将确定潜在的新型治疗方法。

在健康的成人中，主动脉瓣叶的厚度约为1毫米，其主要功能是维持血液单向流出左心室⁴。三个小叶中的每一个都由一层瓣膜内皮细胞（VEC）组成，该细胞排列在小叶的外表面并起到屏障的作用。VEC通过调节通透性、炎症细胞粘附和旁分泌信号来维持瓣膜稳态⁵，^6，7。瓣膜间质细胞（VIC）包括瓣叶⁸内的大部分细胞。VIC在传单中排列成三个不同的层次。这些层被称为脑室、海绵和纤维^9。脑室面向左心室，含有胶原和弹性蛋白纤维。中间层，海绵状体，含有高蛋白多糖含量，可在心动周期内提供剪切灵活性。外纤维层位于主动脉侧靠近流出面的位置，富含I型和III型原纤维胶原蛋白，可提供在舒张^10，11，12期间维持凝结的强度。VIC处于静止状态，然而，炎症，细胞外基质（ECM）重塑和机械应力等因素可能会破坏VIC稳态⁸，^9，13，¹⁴，^15，16。随着体内平衡的丧失，VIC激活并获得肌成纤维细胞样表型，能够增殖，收缩和分泌重塑细胞外millieu¹⁷的蛋白质。活化的VIC可以转变为钙化细胞，这让人联想到间充质干细胞（MSC）分化为成骨细胞15，¹⁷，¹⁸，¹⁹，20，²¹，²²，²³，^24，25。

钙化似乎在富含胶原蛋白的纤维层中从VEC和VIC的贡献开始，但扩张并侵入小叶的其他层⁸。因此，很明显，VEC和VICs都对刺激做出反应以上调成骨基因的表达，然而，驱动成骨基因激活的精确事件，以及细胞和小叶细胞外基质之间的复杂相互作用，仍然不清楚。小鼠模型不是研究CAVD发病机制的非遗传驱动因素的理想来源，因为小鼠不会从头发展CAVD^{26，27，因此}使用原代人体组织和从这些组织中分离的原代细胞系是必要的。特别是，随着3D细胞培养和类器官建模领域正在扩大，并且很可能成为鼠模型的离体人类替代品，因此获得大量和高质量的这些细胞势在必行。

本方法的目的是共享一个工作流程，该工作流程已经建立了有效分离和生长从人类供体的手术切除瓣膜中获得的 VEC 和 VIC 的条件。以前的研究表明，从猪²⁸和鼠瓣²⁹中成功分离了VEC和VIC，据我们所知，这是第一个描述这些细胞在人体组织中的分离。这里描述的方案适用于人切除瓣膜，并通过引入冷存储溶液的使用，极大地规避和改善了组织切除和实验室处理之间通常很长的采购时间造成的损害，冷储存溶液是一种临床用于器官移植的缓冲溶液，极大地稳定了切除组织的细胞。此处描述的方案还展示了如何确定细胞表型并保证细胞存活的高效率，同时最大限度地减少细胞交叉污染。

研究方案

所有患者样本均来自匹兹堡大学机构审查委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的研究的个体。通过器官恢复和教育中心（CORE）获得的尸体组织得到了匹兹堡大学涉及死者的研究和临床培训监督委员会（CORID）的批准。

1. 批准和安全

1. 根据《赫尔辛基宣言》，获得机构审查委员会 （IRB） 的批准或对任何患者样本或尸体组织收集的豁免备忘录。
2. 参加必要的机构培训以处理人体组织，例如血源性病原体培训，生物医学人类受试者研究，隐私和信息安全以及生物材料的运输和运输。

2. 后勤和准备

1. 手术样本
   1. 确保冰箱可用且位于手术室附近。将装有 40 mL 无菌等分试样冷藏溶液的 50 mL 锥形管预先贴有去识别命名法，供手术人员使用。这些管在4°C下稳定，直到原始包装上的有效期。
   2. 拔出后，将瓣膜组织放入这些管中。将试管放入密封的二级容器中，例如防漏塑料袋或标有生物危害标签的塑料容器。组织根据运输生物危害的机构协议在冰上拾取和运输。
2. 尸体样本
   1. 将回收的器官浸入冷藏溶液中，放入密封的二级安全壳中，并根据运输生物危害的机构协议在冰上运输。

3. 试剂制备

1. 至少在前一天制作涂有胶原蛋白的板。
   1. 在 50 mL 锥形管中，混合 5 mL 异丙醇、8.7 mL 乙酸和 0.5 μg 胶原蛋白 I 粉。用无菌水加热至 50 mL。混合并通过0.45μm过滤器过滤。
   2. 在无菌细胞培养罩下，将足够的胶原蛋白溶液添加到 6 孔板和 10 cm 培养皿中，以覆盖整个底部。盖上板，在室温下静置4-6小时。用无菌移液器除去多余的溶液，放入新的无菌50mL锥形管中，并在4°C下保存以制作额外的板。溶液可在4°C下储存数月。
   3. 将板在37°C培养箱中干燥过夜，随后将它们储存在4°C的可重新密封袋中。 涂有胶原蛋白的盘子和培养皿可以存放几个月。
2. 高压灭菌以下物品:组织钳，组织剪刀，棉签和纱布垫。
3. VEC生长培养基:根据制造商的方案制备和使用内皮细胞生长培养基。在4°C的黑暗中储存。 在细胞上使用前加热至37°C，不要将培养基留在温浴中超过必要的时间（10-15分钟就足够了）。在准备后的一个月内使用培养基。
4. VIC生长培养基:补充DMEM基础培养基（4.5 g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺补充剂，110 mg / L丙酮酸钠）³⁰ 与10%热灭活FBS和100 I.U./mL青霉素和100 μg/mL链霉素。在4°C的黑暗中储存长达3个月。在细胞上使用前加热至37°C，不要将培养基留在温浴中超过必要的时间（10-15分钟就足够了）。
5. 使用前制作无菌冲洗液。用 2.5 μg/mL 杀菌剂、0.05 mg/mL 庆大霉素和 5 μg/mL 杀菌剂补充无菌 PBS。
6. 使用前制作无菌胶原酶溶液。将 5 mg 胶原酶 II 加入 5 mL 无菌新鲜 DMEM 基础培养基中。充分混合并通过0.45μm过滤器对溶液进行灭菌。在冰上保持使用。

4. 组织制备和加工

注意:在开始工作之前，必须获得使用人体组织的机构批准。处理纸巾时，必须穿戴以下个人防护装备 （PPE）:一次性液体屏障环绕式防护服，或带有液体屏障包裹围裙和一次性袖子三叶草的专用纽扣前实验室外套;全面罩或带外科口罩的安全眼镜;双层手套;近趾鞋;和遮盖腿的衣服。用于钙化评估（第5节）和细胞分离（第6节和第7节）的组织制备的综合工作流程图分别如图 1A，B 所示。

1. 收到尸体器官标本后，切除主动脉根部并浸没在 50 mL 锥形管无菌冲洗溶液中。收到手术标本后，从运输容器中取出并浸没在无菌冲洗溶液的 50 mL 锥形管中。将装有组织的管放在摇杆上的冰桶中，并在室温（RT）下混合10分钟。
   注意:尽可能接近提取时间处理组织将产生最佳的细胞回收率，但是可以在切除后61小时以上收集活细胞，并且数据显示随着时间的增加，VICs比VECs更健壮。如果组织不能立即处理，在可能的情况下，取出组织，执行步骤4.1，然后将组织放回新鲜的无菌冷藏溶液中并保持在4°C直至准备继续。在夜间或周末手术期间收集的瓣膜可以储存在4°C的40mL冷储存溶液中，并且在提取后2天以上仍然能够产生活细胞。
2. 用70%乙醇喷洒试管并移至无菌罩。取出组织并切除两个瓣叶（图2A）。将一张小叶放入低温小瓶中（如果需要几个较小的小块用于将来的分析，则为2-3个小瓶），并通过滴入液氮快速冷冻，然后储存在-80°C。
   1. 如果瓣膜是二叶式的，则仅切除一个小叶。用剪刀将小叶从结节到铰链切成两半。使用传单的一半进行快速冷冻，另一半用于步骤4.3。
3. 处理用于石蜡包埋的第二份小叶，通过将结节到铰链切成两半来评估钙化含量。将两块都放入浸没在4%多聚甲醛（PFA）中的盒中，然后在室温下放在摇杆上至少2小时，但不超过4小时。
   注意:较长的固定时间会产生更多的免疫荧光染色背景。执行步骤 4.2 和 4.3 后，立即转到第 6 节，并在步骤 6.12 之后返回步骤 4.4。
4. 固定后，通过将浸入新鲜PBS中3-4次1小时来洗涤组织。这些洗涤后，如果需要，样品可以在4°C的PBS中停留数月。在嵌入之前继续执行下一步。
5. 逐渐从PBS改为70%乙醇。每一步用1:4 70%乙醇:PBS洗涤30-60分钟;1:1 70% 乙醇:PBS， 4:1 70% 乙醇:PBS;70%乙醇。
6. 根据既定的协议³¹嵌入组织，使切片将揭示传单的三层（图1A）。或者，如果可用，将组织带到病理学核心进行包埋和切割。
7. 处理纸巾后，酌情丢弃或存放个人防护用品并立即洗手。用漂白剂或洗涤剂消毒剂 1:10 稀释度对所有设备、表面以及固体和液体废物进行净化。等待 20 分钟进行净化，然后用 70% 乙醇冲洗。根据制造商的说明用支原体喷雾剂处理细胞培养罩。

5. 冯·科萨染色钙含量

注意:这可以在细胞分离和细胞系建立后很好地完成，但一定要将组织的钙化水平与与建立的原代细胞系有关的文件联系起来。

1. 将5或10μm厚的石蜡切片切到载玻片上，并在65°C下烘烤载玻片1小时，然后冷却至室温。
2. 使用新鲜溶液，通过浸没如下方式对载玻片进行脱蜡:100%二甲苯30分钟，2x;100%乙醇3分钟，2x;90%乙醇3分钟;80%乙醇3分钟;70%乙醇3分钟;50%乙醇3分钟;超纯水3分钟;保存在超纯水中，直到下一步。
   注意:以上时间是最短时间，每一步可能会更长。
3. 根据制造商的方案进行冯·科萨染色。
4. 显微镜下评估整个瓣膜面积，并分配对照组织（无钙化迹象）或CAVD（任何钙化证据， 图2B）。

6. 瓣膜内皮细胞 （VEC） 分离、扩增和确认

1. 在无菌细胞培养罩中，打开包含剩余瓣叶的锥形管，并将小叶放入装有冰冷PBS的新50 mL锥形管中。盖上管子，在室温下轻轻倒置或放在摇杆上2分钟。
2. 将组织转移到装有 5-7 mL 冷胶原酶溶液的 60 mm 培养皿中。使用镊子将小叶的两侧浸入溶液中3-4次。将组织在37°C的细胞培养箱中孵育5-10分钟，每2分钟轻轻摇动组织3-4次。
3. 从培养皿中取出 2 mL 溶液，放入无菌 15 mL 锥形管中。将镊子放在结节上，然后使用干燥的无菌棉签从镊子滑动到铰链，旋转拭子，同时沿着小叶移动拭子。在每次滑动之间，在 15 mL 锥形管中的溶液中漱拭拭拭子以去除细胞。重复以完全擦拭组织表面，然后翻转并在另一侧重复。
4. 一只手拿着镊子握住瓣膜小叶，另一只手拿着1 mL移液管，用培养皿中的溶液冲洗小叶的表面。冲洗后，将培养皿中含有VEC的所有溶液与拭子中的细胞转移到相同的15 mL锥形管中，然后继续步骤6.5。将剩余的瓣膜组织放入装有7 mL无菌胶原酶溶液的新15 mL锥形管中，然后继续步骤7.1。
5. 将含有 VEC 的管以 180 x g 离心 5 分钟以沉淀分离的 VEC。吸出上清液并重悬于 3 mL VEC 生长培养基中。再次离心一次并除去上清液。将细胞重悬于1 mL生长培养基中，并使用血细胞计数器和台盼蓝确定细胞数量。
6. 将 VEC 沉淀重悬于 2 mL VEC 生长培养基中，并将细胞接种在 6 孔板的胶原蛋白预包被孔中，浓度约为 5 x 10⁵ 细胞/cm²。让细胞生长至少3-4天，然后取出培养基并补充新鲜培养基。每 4 天重复更换一次介质。VEC将在鹅卵石形状的斑块中生长（图3B，左图）。
7. 当VEC贴片覆盖板的>80%时，根据细胞生长的速度以约1.3 x 10⁴个细胞/ cm 2分裂细胞（如果它们在不到1周的时间内达到80%，细胞数略低/ cm²）。
8. 分裂时，用 2 mL DPBS 洗涤细胞两次，然后加入足够的解离试剂以覆盖细胞表面。在37°C孵育2-3分钟，检查以确保细胞没有过度孵育。通过向 15 mL 管中加入等体积的 VEC 生长培养基和转移液体来停止消化。以 180 x g 离心 5 分钟，除去上清液，并根据所需的孔/板数重悬于适当体积的培养基中。
   注意:一旦扩增成 10 厘米板，VEC 有时可能会在增殖时失去其形态并改变表型。当VEC在细胞系的建立和扩增过程中以低汇合度接种时，往往会发生这种情况。
9. 为了保证纯培养，请考虑在每次分裂时使用CD31+超顺磁珠。
10. 对于 1 x 10⁸ 个或更少的细胞（一个 10 cm 或更少的培养皿），根据制造商的方案通过洗涤制备 25 μL 超顺磁性磁珠。
    注意:建议在VEC胰蛋白酶消化之前执行步骤6.10。
11. 按照步骤 6.8 分离细胞，但重悬于 500 μL PBS 中，0.1% BSA，pH 7.4，并置于 2 mL 离心管中。将 500 μL 洗涤和重悬的珠子加入 2 mL 细胞管中，并在 4 °C 下在旋转器上孵育 20 分钟。
12. 将管子放在磁铁上2分钟。当管仍在磁铁中时，小心地除去上清液。从磁铁上取下试管，加入 1 mL 新鲜 PBS 和 0.1% BSA，轻轻移液 2-3 次，然后放回磁铁上 2 分钟。再重复 2 次。最终去除缓冲液后，将细胞重悬于重新铺板所需的体积生长培养基中。
    注意:细胞仍然有珠子，但这些珠子不会影响生长，并将在随后的传代中去除。
13. 细胞扩增后，除形态外，还可通过免疫荧光标志物（如血管性血友病因子 （vWF）、钙粘蛋白 5 （CDH5） 或 PECAM-1/CD31）的阳性染色以及 VIC 标志物（如钙钙蛋白 1 （CNN） 或 α-2 平滑肌肌动蛋白）的阴性染色来确认 VEC 表型（αSMA，图 4，左 图）。

7. 瓣膜间质细胞 （VIC） 隔离、扩增和储存

1. 如步骤6.4所述，从瓣膜组织中去除VECS后，将小叶置于具有7mL胶原酶溶液的15mL锥形管中。在细胞培养箱中孵育12小时，盖子略微打开以允许气体交换。在胶原酶溶液中长达18小时仍可成功分离VIC。
2. 孵育后，在无菌细胞培养罩中，用血清移液管轻轻混合组织，以确保VIC从小叶组织中释放。
3. 去除细胞悬液并通过 0.70 μm 过滤器进入 50 mL 锥形管。
4. 将 7 mL VIC 生长培养基加入 50 mL 管中，并以 180 x g 离心 5 分钟。吸出上清液并将细胞沉淀重悬于1mL VIC生长培养基中并确定细胞数。将VIC接种在60 mm组织培养处理的培养皿中，浓度为1.3 x 10⁴ 细胞/ cm²。
5. 在更换培养基之前让细胞生长至少 1-2 天。取出培养基并洗涤两次DPBS以去除残留的碎屑并更换为新鲜的生长培养基。每 2-3 天补充一次培养基。VIC将以成纤维细胞形状生长（图3B，右图）。
6. 当VIC达到>90%的汇合度时，用DPBS洗涤两次以去除多余的培养基，并通过添加适当体积的预热解离试剂覆盖板（即每10厘米培养皿2-3mL）来分离细胞。将培养皿在37°C培养箱中孵育。孵育2-3分钟后，VIC将从培养皿中分离。加入 4-6 mL 预热培养基。
   注意:如果细胞需要超过3分钟才能从板上取出，则解离试剂可能已失去效力。如果需要，可以使用细胞刮刀轻轻提起细胞。
7. 将细胞悬液转移到管中，并以180× g 轻轻离心5分钟。除去上清液后，将细胞沉淀轻轻重悬于预热的VIC生长培养基中，并使用血细胞计数器和台盼蓝确定活细胞的数量。以原始培养皿的 1:2 密度接种活细胞（即，每 10 cm 培养皿 ~ 1 × 10 个⁶ 个细胞或 1.3 x 10⁴ 个细胞/cm²）。
8. 通过免疫荧光标志物（如 αSMA、CNN 或 SM22α）的阳性染色和 VEC 标志物（如 CD31、CDH5 或 vWF）的阴性染色来评估 VIC 表型（图 4，右图）。
   注意:此处介绍的方案工作流程无偏地选择一份传单用于 VEC 和 VIC 分离，而其余传单用于 Von Kossa 染色（第 5 节）和快速冷冻。

8. 长期电池储存

1. 一旦扩增，冷冻细胞以进行长期储存。用 2-5 mL DPBS 洗涤细胞两次，然后加入足够的解离试剂以分离细胞，如步骤 6.8 和 7.6 所示。通过加入等体积的 VEC 或 VIC 生长培养基并将细胞悬液转移到 15 mL 管中来停止消化。
2. 使用血细胞计数器和台盼蓝确定活细胞的数量。
3. 以180× g 离心5分钟。
4. 将细胞重悬于冷藏的条件生长培养基中，细胞密度为~3×10⁶ 细胞/mL。
5. 轻轻旋转，加入等体积的冷冻 2x 冷冻保存培养基。这将使细胞浓度达到 ~ 1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
6. 将 1 mL 等分到冷冻保存瓶中。将小瓶放入细胞冷冻容器中，关闭并倒置 5-6 次以确保细胞保持悬浮状态。将容器置于-80°C下6-72小时或根据冷冻容器方案。从-80°C取出小瓶并转移到液氮中长期储存。

结果

上述协议概述了处理人类瓣膜组织以及从这些组织中分离和建立活细胞系所需的步骤。主动脉瓣的小叶被处理用于石蜡包埋，快速冷冻以长期储存以进行生化或遗传分析，并消化以分离VEC和VIC（图1）。虽然手术标本可能具有主动脉瓣狭窄的临床诊断，并且可能表现出肉眼可见的重度钙化结节，但主动脉瓣钙化存在于大量老年人（>65岁）中³²，并且由于这种?...

讨论

从人类获得对照和疾病组织对于体外和离体疾病建模至关重要;然而，虽然人们经常谈到弥合长凳到床边之间的差距的挑战，但相反的顺序 - 从手术室到长凳 - 往往同样令人生畏。对于基础科学家获得原始人体组织标本至关重要的是与投资的外科医生科学家合作，该科学家拥有一支由护士、外科技术人员、医师助理、医学生和住院医师以及临床协议经理组成的团队，他们可以招募和同意患者，参与...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Thermo Scientific	7211345	Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate	Greiner Bio-One	664160	Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet	Fisher	14955234	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips	VWR	76322-154	Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips	VWR	76322-132	Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339650	Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710S	Tissue and cell fixative
190 proof ethanol	Decon	2801	Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium	Gibco	14190250	Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS	Fisher	BP2944100	Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips	VWR	76322-134	Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol	Decon	2701	Deparaffinizing tissue samples
2-propanol	Fisher	A416P 4	Making collagen coated plates
5 mL serological pipet	Fisher	14955233	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish	GenClone	25-260	VEC isolation
6-well cell culture plate	Corning	3516	Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial	Fisher	BP2401 500	Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g	Bioworld	220700233	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody	Abcam	ab46794	Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5	Cell Signaling	2500	Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores	Corning	431751	VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein	Gibco	A1048301	Making collagen coated plates
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray	Decon	4101	Disinfection
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	A27977	Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips	Invitrogen	2026h	Automated cell counter required slide cover
Coverslips	Fisher	125485E	Mounting valve samples
Cryogenic vials	Olympus Plastics	24-202	Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula	Clorox	N/A	Disinfection
DMEM	Gibco	10569044	Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500	Lonza Walkersville	CC3129	Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Model Number: AME3300	Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D Systems	S11550	VIC expansion
Fine scissors	Fine Science Tools	14088-10	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	VIC expansion
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides	Globe Scientific Inc	1358L	mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488	Invitrogen	A11001	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594	Invitrogen	A11005	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594	Invitrogen	A11012	Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide	Invitrogen	A25750	Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Frozen cell storage
Mounting Medium	Fisher Chemical Permount	SP15-100	Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container	Nalgene	51000001	Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Disinfection
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody	Abcam	ab14106	Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors	Fine Science Tools	14001-14	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab	Puritan	25806 10WC	VEC isolation
Swingsette human tissue cassette	Simport Scientific	M515-2	Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061	cell counting solution
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit	Polysciences	246331	Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody	Abcam	ab68545	Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes	Fisher Chemical	X3S-4	Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody	Abcam	ab7817	Primary antibody (VIC positive stain)