Isolement de cellules valvulaires primaires humaines pour la modélisation in vitro de maladies

Résumé

Ce protocole décrit la collecte de valves aortiques humaines extraites au cours de procédures chirurgicales de remplacement de valve aortique ou de tissu cadavérique, ainsi que l’isolement, l’expansion et la caractérisation ultérieurs de cellules endothéliales et interstitielles valvulaires primaires spécifiques au patient. Sont inclus des détails importants concernant les processus nécessaires pour assurer la viabilité cellulaire et la spécificité du phénotype.

Résumé

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est présente chez près d’un tiers de la population âgée. L’épaississement, le raidissement et la calcification de la valve aortique provoquent une sténose aortique et contribuent à l’insuffisance cardiaque et aux accidents vasculaires cérébraux. La pathogenèse de la maladie est multifactorielle et les stress tels que l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire, l’écoulement turbulent et le stress et la tension mécaniques contribuent à la différenciation ostéogénique des cellules endothéliales valvulaires et interstitielles valvulaires. Cependant, les facteurs initiateurs précis qui conduisent la transition ostéogénique d’une cellule saine dans une cellule calcifiante ne sont pas entièrement définis. De plus, le seul traitement actuel pour la sténose aortique induite par la CAVD est le remplacement valvulaire aortique, par lequel la valve native est retirée (remplacement chirurgical de la valve aortique, SAVR) ou une valve de remplacement entièrement repliable est insérée via un cathéter (remplacement transcathéter de la valve aortique, TAVR). Ces interventions chirurgicales ont un coût élevé et comportent des risques graves; Il est donc impératif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de médicaments. À cette fin, la présente étude développe un flux de travail où les tissus prélevés chirurgicalement sur les patients et les tissus de cadavres de donneurs sont utilisés pour créer des lignées primaires de cellules valvulaires spécifiques au patient pour la modélisation in vitro de la maladie. Ce protocole introduit l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique, couramment utilisée dans la transplantation d’organes, pour réduire les dommages causés par le temps d’approvisionnement souvent long entre l’excision tissulaire et le traitement en laboratoire avec l’avantage de stabiliser considérablement les cellules du tissu excisé. Les résultats de la présente étude démontrent que les cellules valvulaires isolées conservent leur capacité proliférative et leurs phénotypes endothéliaux et interstitiels en culture jusqu’à plusieurs jours après le retrait de la valve du donneur. L’utilisation de ces matériaux permet la collecte de cellules témoins et de cellules CAVD, à partir desquelles les lignées cellulaires de contrôle et de maladie sont établies.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est une pathologie chronique caractérisée par une inflammation, une fibrose et une macrocalcification des feuillets valviques aortiques. Le remodelage progressif et la calcification des feuillets (appelé sclérose aortique) peuvent entraîner une obstruction du flux sanguin (sténose aortique) qui contribue à un accident vasculaire cérébral et conduit à une insuffisance cardiaque. Actuellement, le seul traitement de la CAVD est le remplacement chirurgical ou transcathéter de la valve aortique (SAVR et TAVR, respectivement). Il n’y a pas d’option non chirurgicale pour arrêter ou inverser la progression de la CAVD, et sans remplacement valvulaire, les taux de mortalité approchent 50% dans les 2-3 ans ^1,2,3. La définition des mécanismes sous-jacents à l’origine de cette pathologie permettra d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques potentielles.

Chez un adulte en bonne santé, les feuillets valviques aortiques ont une épaisseur d’environ un millimètre et leur fonction principale est de maintenir le flux sanguin unidirectionnel hors du ventricule gauche⁴. Chacun des trois feuillets est composé d’une couche de cellules endothéliales valvulaires (CVE) qui tapisse la surface externe du feuillet et fonctionne comme une barrière. Les CVE maintiennent l’homéostasie valvulaire en régulant la perméabilité, l’adhésion cellulaire inflammatoire et la signalisation paracrine ^5,6,7. Les cellules interstitielles valvulaires (CIV) constituent la majorité des cellules de la notice valvulaire⁸. Les CIV sont disposés en trois couches distinctes dans la notice. Ces couches sont connues sous le nom de ventricularis, de spongiosa et de fibrosa⁹. Le ventricule fait face au ventricule gauche et contient des fibres de collagène et d’élastine. La couche intermédiaire, la spongiose, contient une teneur élevée en protéoglycane qui offre une flexibilité de cisaillement pendant le cycle cardiaque. La couche externe de fibrose est située près de la surface d’écoulement du côté aortique et est riche en collagène fibrillaire de type I et de type III qui fournit la force nécessaire pour maintenir la coaptation pendant la diastole^10,11,12. Les CIV résident dans un état de repos, cependant, des facteurs tels que l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et le stress mécanique peuvent perturber l’homéostasie VIC 8,9,13,14,15,16. Avec la perte d’homéostasie, les CIV activent et acquièrent un phénotype de type myofibroblaste capable de prolifération, de contraction et de sécrétion de protéines qui remodèlent le millieu^{extracellulaire 17}. Les CIV activés peuvent se transformer en cellules calcifiantes, ce qui rappelle la différenciation d’une cellule souche mésenchymateuse (CSM) en un ostéoblaste 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

La calcification semble s’initier dans la couche de fibrose riche en collagène à partir des contributions des CVÉ et des VIC, mais se dilate et envahit les autres couches de la foliole⁸. Ainsi, il est clair que les CVÉ et les CIV répondent aux stimuli pour réguler positivement l’expression des gènes ostéogéniques, mais les événements précis conduisant à l’activation des gènes ostéogéniques, ainsi que l’interaction complexe entre les cellules et la matrice extracellulaire du feuillet, restent mal définis. Les modèles murins ne sont pas une source idéale pour étudier les facteurs non génétiques de la pathogenèse de la CAVD, car les souris ne développent pas de CAVD^{de novo 26,27,} d’où la nécessité d’utiliser des tissus humains primaires et des lignées cellulaires primaires isolées de ces tissus. En particulier, l’obtention de ces cellules en grand nombre et de bonne qualité est impérative, car le domaine des cultures cellulaires 3D et de la modélisation organoïde est en pleine expansion et est susceptible de devenir une alternative humaine ex vivo aux modèles murins.

Le but de la présente méthode est de partager un flux de travail qui a établi les conditions pour isoler et cultiver efficacement les CVÉ et les CIV obtenus à partir de valves prélevées chirurgicalement de donneurs humains. Des études antérieures ont montré l’isolement réussi des CVÉ et des CIV à partir de valves porcines²⁸ et murines²⁹, à notre connaissance, c’est la première à décrire l’isolement de ces cellules dans les tissus humains. Le protocole décrit ici est applicable aux valves excisées humaines et contourne et améliore considérablement les dommages causés par le temps d’approvisionnement souvent long entre l’excision tissulaire et le traitement en laboratoire en introduisant l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique, une solution tamponnée cliniquement utilisée dans les transplantations d’organes qui stabilise considérablement les cellules du tissu excisé. Le protocole décrit ici montre également comment déterminer le phénotype cellulaire et garantir une efficacité élevée de la survie cellulaire avec une contamination croisée cellulaire minimale.

Protocole

Tous les échantillons de patients sont prélevés auprès de personnes inscrites à des études approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Pittsburgh conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les tissus cadavériques obtenus par l’intermédiaire du Center for Organ Recovery and Education (CORE) ont été approuvés par le Comité de surveillance de la recherche et de la formation clinique impliquant des défunts (CORID) de l’Université de Pittsburgh.

1. Homologation et sécurité

1. Obtenir l’approbation du Comité d’examen institutionnel (CISR) ou une note de service exemptée pour toute collecte d’échantillons de patients ou de tissus cadavériques conformément à la Déclaration d’Helsinki.
2. Suivre la formation institutionnelle requise pour travailler avec les tissus humains, comme la formation sur les pathogènes transmissibles par le sang, la recherche biomédicale sur des sujets humains, la protection de la vie privée et la sécurité de l’information, ainsi que le transport et l’expédition de matériel biologique.

2. Logistique et préparation

1. Échantillons chirurgicaux
   1. Assurez-vous qu’un réfrigérateur est disponible et situé près de la salle d’opération. Conservez dans ce réfrigérateur des tubes coniques préétiquetés de 50 mL avec une nomenclature anonymisée contenant 40 mL d’aliquotes stériles de solution d’entreposage frigorifique à l’usage du personnel chirurgical. Ces tubes sont stables à 4 °C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’emballage d’origine.
   2. Lors de l’extraction, placez le tissu valvulaire dans ces tubes. Placez les tubes dans un contenant secondaire scellé, comme un sac de plastique étanche ou un contenant en plastique étiqueté avec une étiquette de risque biologique. Les tissus sont ramassés et transportés sur la glace conformément aux protocoles institutionnels de transport des risques biologiques.
2. Échantillons cadavériques
   1. Immerger les organes récupérés dans une solution frigorifique, les placer dans une enceinte de confinement secondaire scellée et les transporter sur la glace conformément aux protocoles institutionnels de transport des risques biologiques.

3. Préparation des réactifs

1. Faites des assiettes enduites de collagène au moins la veille.
   1. Dans un tube conique de 50 mL, mélanger 5 mL d’alcool isopropylique, 8,7 mL d’acide acétique et 0,5 μg de poudre de collagène I. Porter jusqu’à 50 ml avec de l’eau stérile. Mélanger et filtrer à travers un filtre de 0,45 μm.
   2. Sous une hotte de culture cellulaire stérile, ajouter suffisamment de solution de collagène dans les assiettes de 6 puits et les boîtes de 10 cm pour couvrir tout le fond. Couvrir la plaque et laisser reposer pendant 4-6 h à température ambiante. Retirer l’excès de solution à l’aide d’une pipette stérile, placer dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml et conserver à 4 °C pour faire des plaques supplémentaires. La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs mois.
   3. Sécher les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant une nuit, puis les conserver dans un sac refermable à 4 °C. Les assiettes et les plats enduits de collagène peuvent être conservés pendant plusieurs mois.
2. Autoclaver les articles suivants: pinces à tissu, ciseaux à tissu, cotons-tiges et compresses de gaze.
3. Milieu de croissance VEC : Préparer et utiliser le milieu de croissance des cellules endothéliales conformément aux protocoles du fabricant. Conserver à l’obscurité à 4 °C. Chauffer à 37 °C juste avant utilisation sur les cellules, ne pas laisser le média dans un bain chauffant plus longtemps que nécessaire (10-15 min suffisent). Utilisez le support dans le mois suivant la préparation.
4. Milieu de croissance VIC : Supplément DMEM milieu de base (4,5 g/L de glucose, supplément de L-glutamine, 110 mg/L de pyruvate de sodium)³⁰ avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 3 mois. Chauffer à 37 °C juste avant utilisation sur les cellules, ne pas laisser le média dans un bain chauffant plus longtemps que nécessaire (10-15 min suffisent).
5. Préparer une solution de rinçage stérile juste avant utilisation. Complétez le PBS stérile avec 2,5 μg/mL de fongicide, 0,05 mg/mL de gentamicine et 5 μg/mL de bactéricide.
6. Préparer une solution de collagénase stérile juste avant utilisation. Ajouter 5 mg de collagénase II à 5 mL de milieu de base DMEM frais stérile. Bien mélanger et stériliser la solution en passant à travers un filtre de 0,45 μm. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.

4. Préparation et traitement des tissus

REMARQUE : L’approbation de l’établissement pour l’utilisation de tissus humains doit être obtenue avant le début des travaux. Lors de la manipulation de mouchoirs, l’équipement de protection individuelle (EPI) suivant doit être porté : une blouse enveloppante jetable à barrière liquide ou une blouse de laboratoire à boutons spéciaux avec un tablier enveloppant à barrière liquide et des trèfles jetables; un écran facial complet ou des lunettes de sécurité avec un masque chirurgical; gants doubles; chaussures fermées; et des vêtements pour couvrir les jambes. Des diagrammes de flux de travail complets de la préparation tissulaire pour l’évaluation de la calcification (section 5) et l’isolement cellulaire (sections 6 et 7) sont illustrés respectivement à la figure 1A, B .

1. À la réception du spécimen d’organe cadavérique, exciser la racine aortique et l’immerger dans un tube conique de 50 ml de solution de rinçage stérile. À la réception de l’échantillon chirurgical, retirer des récipients de transport et l’immerger dans un tube conique de 50 ml de solution de rinçage stérile. Placer le tube contenant le tissu dans un seau à glace sur la bascule et mélanger pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Le traitement des tissus aussi près que possible du moment de l’extraction donnera la meilleure récupération cellulaire, mais les cellules viables peuvent être prélevées plus de 61 heures après l’excision, et les données montrent que les CVI sont plus robustes que les CVÉ à mesure que le temps augmente. Si le tissu ne peut pas être traité immédiatement, si possible, retirez le tissu, effectuez l’étape 4.1, puis remettez le tissu dans une solution fraîche stérile d’entreposage frigorifique et maintenez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à commencer. Les valves recueillies pendant les chirurgies de nuit ou de fin de semaine peuvent être stockées dans une solution d’entreposage frigorifique de 40 ml à 4 °C et peuvent encore produire des cellules viables plus de 2 jours après l’extraction.
2. Vaporiser des tubes avec de l’éthanol à 70% et passer à une hotte stérile. Retirer les mouchoirs et exciser deux feuillets de valve (figure 2A). Placer une notice dans un flacon cryogénique (ou 2-3 flacons si plusieurs petits morceaux sont nécessaires pour une analyse future) et congeler en laissant tomber de l’azote liquide, puis conserver à -80 °C.
   1. Si la valve est bicuspide, ne couper qu’une seule notice. À l’aide de ciseaux, couper le feuillet en deux du nodule à la charnière. Utilisez la moitié de la notice pour la congélation instantanée et l’autre moitié pour l’étape 4.3.
3. Traiter la deuxième notice pour l’incorporation de paraffine afin d’évaluer la teneur en calcification en la coupant en deux du nodule à la charnière. Placer les deux morceaux dans une cassette immergée dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, puis placer sur une bascule à TA pendant au moins 2 h mais pas plus de 4 h.
   REMARQUE: Des temps de fixation plus longs créent plus de fond avec la coloration immunofluorescente. Une fois les étapes 4.2 et 4.3 effectuées, passez immédiatement à la section 6 et revenez à l’étape 4.4 après l’étape 6.12.
4. Après la fixation, laver les tissus en les immergeant dans du PBS frais pendant 1 h 3-4 fois. Après ces lavages, les échantillons peuvent rester dans du PBS à 4 °C pendant plusieurs mois si nécessaire. Passez à l’étape suivante juste avant l’intégration.
5. Passez progressivement du PBS à l’éthanol à 70%. Laver 30-60 min à chaque étape avec 1:4 70% éthanol:PBS; 1:1 70% éthanol:PBS, 4:1 70% éthanol:PBS; 70% d’éthanol.
6. Encastrer le tissu de manière à ce que les coupes révèlent les trois couches de la notice (figure 1A) conformément aux protocoles établis³¹. Alternativement, et si disponible, amener le tissu à un noyau pathologique pour l’encastrement et la coupe.
7. Après avoir manipulé des mouchoirs, jetez ou entreposez l’EPI au besoin et lavez-vous les mains immédiatement. Décontaminez tout l’équipement, les surfaces et les déchets solides et liquides avec une dilution de 1:10 d’eau de Javel ou de désinfectant détergent. Laisser agir 20 min pour la décontamination, puis rincer à 70 % à l’éthanol. Traiter la hotte de culture cellulaire avec un spray de mycoplasme conformément aux instructions du fabricant.

5. Coloration de Von Kossa pour la teneur en calcium

REMARQUE: Cela peut être fait bien après l’isolement cellulaire et l’établissement de la ligne, mais assurez-vous de relier le niveau de calcification du tissu aux documents relatifs à la lignée cellulaire primaire établie.

1. Couper des tranches de paraffine de 5 ou 10 μm d’épaisseur sur des lames de verre et cuire les lames à 65 °C pendant 1 h, puis laisser refroidir à TA.
2. À l’aide de solutions fraîches, déparaffiniser les lames en les immergeant comme suit : 100 % xylène pendant 30 min, 2x ; 100% éthanol pendant 3 min, 2x; 90% d’éthanol pendant 3 min; 80% d’éthanol pendant 3 min; 70% d’éthanol pendant 3 min; 50% d’éthanol pendant 3 min; eau ultrapure pendant 3 min; Conserver dans de l’eau ultrapure jusqu’aux prochaines étapes.
   REMARQUE: Les temps ci-dessus sont minimaux, chaque étape peut durer plus longtemps.
3. Procéder à la coloration Von Kossa selon les protocoles du fabricant.
4. Évaluer la zone valvulaire complète au microscope et attribuer un tissu témoin (aucun signe de calcification) ou un CAVD (tout signe de calcification, Figure 2B).

6. Isolement, expansion et confirmation des cellules endothéliales valvulaires (CVE)

1. Dans une hotte de culture cellulaire stérile, ouvrir le tube conique contenant le feuillet valvulaire restant et placer le feuillet dans un nouveau tube conique de 50 ml rempli de PBS glacé. Bouchon tube et retourner doucement ou placer sur une bascule pendant 2 min à TA.
2. Retirer le mouchoir dans un plat de 60 mm rempli de 5 à 7 ml de solution froide de collagénase. À l’aide de forceps, tremper les deux côtés de la notice dans la solution 3-4 fois. Incuber le tissu pendant 5-10 min dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C, en berçant doucement le tissu toutes les 2 minutes 3-4 fois.
3. Retirer 2 mL de la solution de la capsule et placer dans un tube conique stérile de 15 mL. Placez une pince sur le nodule et utilisez un coton-tige sec et stérile pour glisser de la pince à la charnière, en faisant tourner l’écouvillon tout en le déplaçant le long de la notice. Entre chaque balayage, agiter l’écouvillon dans la solution dans le tube conique de 15 ml pour enlever les cellules. Répétez l’opération pour frotter complètement la surface du tissu, puis retournez et répétez de l’autre côté.
4. En tenant le feuillet de la valve avec une pince dans une main et une pipette de 1 ml dans l’autre, rincez les surfaces du feuillet avec la solution dans le plat. Une fois rincé, transférer toute la solution contenant les CVÉ dans la capsule dans le même tube conique de 15 ml avec les cellules de l’écouvillon et passer à l’étape 6.5. Placer le tissu valvulaire restant dans un nouveau tube conique de 15 mL contenant 7 mL de solution de collagénase stérile et passer à l’étape 7.1.
5. Centrifuger le tube contenant les CVÉ à 180 x g pendant 5 min pour granuler les CVÉ isolés. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 3 mL de milieu de culture CEV. Centrifuger une fois de plus et retirer le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de croissance et déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et du bleu de trypan.
6. Resuspendre la pastille de CVE dans 2 mL de milieu de croissance de la CVE et plaquer les cellules dans un puits pré-enduit de collagène d’une plaque de 6 puits à environ 5 x 10⁵ cellules/cm². Laissez les cellules pousser au moins 3-4 jours, puis retirez le milieu et reconstituez-les avec un milieu frais. Répétez le changement de média tous les 4 jours. Les CVÉ pousseront en plaques pavées (figure 3B, panneaux de gauche).
7. Lorsque les patchs VEC couvrent >80% de la plaque, diviser les cellules à environ 1,3 x 10⁴ cellules/cm 2 selon la vitesse à laquelle elles se développent (si elles atteignent 80% en moins de 1 semaine à un nombre légèrement inférieur de cellules/cm²).
8. Pour se diviser, laver les cellules deux fois avec 2 ml de DPBS, puis ajouter suffisamment de réactif de dissociation pour couvrir simplement la surface des cellules. Incuber pendant 2-3 min à 37 °C, en vérifiant que les cellules ne sont pas surincubées. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume égal de milieu de croissance VEC et transférez le liquide dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 180 x g pendant 5 min, enlever le surnageant et remettre en suspension dans le volume approprié de fluide pour le nombre de puits/plaques nécessaires.
   NOTE: Une fois élargis en une plaque de 10 cm, les CVÉ peuvent parfois perdre leur morphologie et changer de phénotype à mesure qu’ils prolifèrent. Cela tend à se produire lorsque les CVÉ sont ensemencés à une faible confluence lors de l’établissement et de l’expansion de la lignée cellulaire.
9. Pour garantir une culture pure, envisagez d’utiliser des perles superparamagnétiques CD31+ à chaque fractionnement.
10. Pour 1 x 10⁸ cellules ou moins (une boîte de 10 cm ou moins), préparer 25 μL de billes superparamagnétiques en les lavant selon les protocoles du fabricant.
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer l’étape 6.10 avant la trypsinisation des CVÉ.
11. Détacher les cellules comme à l’étape 6.8, mais remettre en suspension dans 500 μL de PBS avec 0,1% de BSA, pH 7,4, et placer dans un tube à centrifuger de 2 mL. Ajouter 500 μL de billes lavées et remises en suspension dans le tube de 2 mL de cellules et incuber sur un rotateur pendant 20 min à 4 °C.
12. Placez les tubes sur l’aimant pendant 2 min. Pendant que le tube est encore dans l’aimant, retirez soigneusement le surnageant. Retirer le tube de l’aimant, ajouter 1 mL de PBS frais avec 0,1% de BSA, pipeter doucement 2-3 fois, puis remettre sur l’aimant pendant 2 min. Répétez 2 fois de plus. Après le retrait final du tampon, remettre les cellules en suspension dans le milieu de croissance en volume nécessaire au replatage.
    REMARQUE: Les cellules auront toujours des perles, mais celles-ci n’affecteront pas la croissance et seront éliminées dans les passages suivants.
13. Une fois que les cellules ont été dilatées, en plus de la morphologie, confirmer le phénotype VEC par coloration positive pour les marqueurs immunofluorescents tels que le facteur von Willebrand (vWF), la cadhérine 5 (CDH5) ou PECAM-1 / CD31, et la coloration négative pour les marqueurs VIC tels que la calponine 1 (CNN) ou l’actine du muscle lisse alpha-2 (αSMA, Figure 4, panneaux de gauche).

7. Isolation, expansion et stockage des cellules interstitielles valvulaires (CIV)

1. Comme indiqué à l’étape 6.4, après avoir retiré les CVÉ du tissu valvulaire, la notice est placée dans un tube conique de 15 mL avec une solution de collagénase de 7 mL. Incuber pendant 12 h dans l’incubateur de culture cellulaire avec le bouchon légèrement ouvert pour permettre les échanges gazeux. L’isolement réussi des CIV peut encore se produire jusqu’à 18 heures dans une solution de collagénase.
2. Après l’incubation, dans une hotte de culture cellulaire stérile, mélanger doucement le tissu en le pipetant avec une pipette sérologique pour assurer la libération des CIV du tissu foliole.
3. Retirer la suspension cellulaire et passer à travers un filtre de 0,70 μm dans un tube conique de 50 mL.
4. Ajouter 7 mL de milieu de croissance VIC dans le tube de 50 mL et centrifuger à 180 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de croissance VIC et déterminer le nombre de cellules. Plaquer les CIV dans une capsule traitée par culture tissulaire de 60 mm à 1,3 x 10⁴ cellules/cm².
5. Laissez les cellules se développer au moins 1-2 jours avant de remplacer le milieu. Retirer le média et laver deux fois le DPBS pour éliminer les débris résiduels et le remplacer par un milieu de croissance frais. Réapprovisionner à moyen tous les 2-3 jours. Les CIV se développeront sous forme de fibroblastes (figure 3B, panneaux de droite).
6. Lorsque les CIV atteignent une confluence de >90 %, laver deux fois avec du DPBS pour éliminer l’excès de milieu et détacher les cellules en ajoutant un volume approprié de réactif de dissociation préchauffé pour couvrir la plaque (c.-à-d. 2 à 3 mL par boîte de 10 cm). Incuber le plat dans un incubateur à 37 °C. Les VIC se détacheront du plat après 2-3 minutes d’incubation. Ajouter 4 à 6 mL de média préchauffé.
   REMARQUE: Si les cellules prennent plus de 3 minutes pour se soulever de la plaque, le réactif de dissociation peut avoir perdu de sa puissance. Si nécessaire, un grattoir de cellules peut être utilisé pour soulever doucement les cellules.
7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube et centrifuger doucement à 180 x g pendant 5 min. Après avoir retiré le surnageant, remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de croissance VIC préchauffé et déterminer le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu de trypan. Ensemencer les cellules viables à une densité de 1:2 dans le plat d’origine (c.-à-d. ~ 1 × 10⁶ cellules par plat de 10 cm ou 1,3 x 10⁴ cellules/cm²).
8. Évaluer le phénotype de la CIV par coloration positive pour les marqueurs immunofluorescents tels que αSMA, CNN ou SM22α et par coloration négative pour les marqueurs VEC tels que CD31, CDH5 ou vWF (Figure 4, panneaux de droite).
   REMARQUE: Le flux de travail du protocole présenté ici sélectionne de manière impartiale un dépliant pour l’isolement des CVÉ et des VIC, tandis que les autres dépliants sont utilisés pour la coloration de Von Kossa (section 5) et la congélation instantanée.

8. Stockage cellulaire à long terme

1. Une fois développées, congelez les cellules pour un stockage à long terme. Lavez les cellules deux fois avec 2-5 mL de DPBS, puis ajoutez suffisamment de réactif de dissociation pour détacher les cellules comme aux étapes 6.8 et 7.6. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume égal de milieu de croissance VEC ou VIC et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
2. Déterminer le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu de trypan.
3. Centrifuger à 180 x g pendant 5 min.
4. Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance conditionné réfrigéré à une densité cellulaire de ~ 3 × 10⁶ cellules/mL.
5. Doucement en tourbillonnant, ajouter un volume égal de milieu de cryoconservation 2x réfrigéré. Cela portera la concentration cellulaire à ~ 1,5 × 10⁶ cellules / mL.
6. Aliquote 1 mL dans des flacons de cryoconservation. Placez les flacons dans un contenant de congélation de cellules, fermez et inversez 5 à 6 fois pour vous assurer que les cellules restent suspendues. Placer le récipient à -80 °C pendant 6 à 72 h ou selon le protocole de congélation du contenant. Retirer les flacons de -80 °C et les transférer dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Résultats

Le protocole ci-dessus décrit les étapes nécessaires à la manipulation des tissus valvulaires humains et à l’isolement et à l’établissement de lignées cellulaires viables à partir de ces tissus. Les feuillets de la valve aortique sont traités pour l’incorporation de paraffine, congelés pour un stockage à long terme pour analyse biochimique ou génétique et digérés pour l’isolement des CVÉ et des CIV (Figure 1). Alors que les échantillons chirurgicaux auront probablem...

Discussion

L’obtention de tissus témoins et de tissus pathogènes chez l’homme est essentielle pour la modélisation in vitro et ex vivo des maladies; Cependant, alors que l’on parle souvent des défis de combler l’écart entre le banc et le chevet du patient, l’ordre inverse - passer du bloc opératoire au banc - est souvent tout aussi décourageant. Il est essentiel pour un scientifique fondamental d’obtenir des échantillons primaires de tissus humains en collaboration avec un chirurgien scientifique investi qui dis...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Thermo Scientific	7211345	Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate	Greiner Bio-One	664160	Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet	Fisher	14955234	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips	VWR	76322-154	Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips	VWR	76322-132	Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339650	Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710S	Tissue and cell fixative
190 proof ethanol	Decon	2801	Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium	Gibco	14190250	Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS	Fisher	BP2944100	Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips	VWR	76322-134	Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol	Decon	2701	Deparaffinizing tissue samples
2-propanol	Fisher	A416P 4	Making collagen coated plates
5 mL serological pipet	Fisher	14955233	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish	GenClone	25-260	VEC isolation
6-well cell culture plate	Corning	3516	Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial	Fisher	BP2401 500	Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g	Bioworld	220700233	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody	Abcam	ab46794	Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5	Cell Signaling	2500	Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores	Corning	431751	VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein	Gibco	A1048301	Making collagen coated plates
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray	Decon	4101	Disinfection
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	A27977	Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips	Invitrogen	2026h	Automated cell counter required slide cover
Coverslips	Fisher	125485E	Mounting valve samples
Cryogenic vials	Olympus Plastics	24-202	Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula	Clorox	N/A	Disinfection
DMEM	Gibco	10569044	Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500	Lonza Walkersville	CC3129	Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Model Number: AME3300	Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D Systems	S11550	VIC expansion
Fine scissors	Fine Science Tools	14088-10	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	VIC expansion
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides	Globe Scientific Inc	1358L	mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488	Invitrogen	A11001	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594	Invitrogen	A11005	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594	Invitrogen	A11012	Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide	Invitrogen	A25750	Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Frozen cell storage
Mounting Medium	Fisher Chemical Permount	SP15-100	Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container	Nalgene	51000001	Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Disinfection
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody	Abcam	ab14106	Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors	Fine Science Tools	14001-14	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab	Puritan	25806 10WC	VEC isolation
Swingsette human tissue cassette	Simport Scientific	M515-2	Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061	cell counting solution
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit	Polysciences	246331	Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody	Abcam	ab68545	Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes	Fisher Chemical	X3S-4	Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody	Abcam	ab7817	Primary antibody (VIC positive stain)