Aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro

Resumen

Este protocolo describe la colección de válvulas aórticas humanas extraídas durante procedimientos quirúrgicos de reemplazo de válvula aórtica o de tejido cadavérico, y el posterior aislamiento, expansión y caracterización de células endoteliales e intersticiales de válvula primaria específicas del paciente. Se incluyen detalles importantes sobre los procesos necesarios para garantizar la viabilidad celular y la especificidad del fenotipo.

Resumen

La valvulopatía aórtica calcificante (CAVD) está presente en casi un tercio de la población de edad avanzada. El engrosamiento, endurecimiento y calcificación de la válvula aórtica causa estenosis aórtica y contribuye a la insuficiencia cardíaca y al accidente cerebrovascular. La patogénesis de la enfermedad es multifactorial, y tensiones como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular, el flujo turbulento y el estrés mecánico y la tensión contribuyen a la diferenciación osteogénica de las células endoteliales valvulares e intersticiales valvulares. Sin embargo, los factores iniciadores precisos que impulsan la transición osteogénica de una célula sana a una célula calcificante no están completamente definidos. Además, la única terapia actual para la estenosis aórtica inducida por CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica, mediante el cual se extrae la válvula nativa (reemplazo quirúrgico de la válvula aórtica, SAVR) o se inserta una válvula de reemplazo totalmente plegable a través de un catéter (reemplazo de la válvula aórtica transcatéter, TAVR). Estos procedimientos quirúrgicos tienen un alto costo y con graves riesgos; Por lo tanto, es imperativo identificar nuevos objetivos terapéuticos para el descubrimiento de fármacos. Con ese fin, el presente estudio desarrolla un flujo de trabajo en el que los tejidos extirpados quirúrgicamente de pacientes y tejidos de cadáveres de donantes se utilizan para crear líneas primarias específicas del paciente de células valvulares para el modelado de enfermedades in vitro. Este protocolo introduce la utilización de una solución de almacenamiento en frío, comúnmente utilizada en el trasplante de órganos, para reducir el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio con el beneficio de estabilizar en gran medida las células del tejido extirpado. Los resultados del presente estudio demuestran que las células valvulares aisladas conservan su capacidad proliferativa y los fenotipos endoteliales e intersticiales en cultivo más de varios días después de la extracción de la válvula del donante. El uso de estos materiales permite la recolección de células de control y CAVD, a partir de las cuales se establecen líneas celulares de control y enfermedad.

Introducción

La valvulopatía aórtica calcificada (CAVD) es una patología crónica caracterizada por inflamación, fibrosis y macrocalcificación de las valvas valvulares aórticas. La remodelación progresiva y la calcificación de las valvas (denominada esclerosis aórtica) pueden conducir a la obstrucción del flujo sanguíneo (estenosis aórtica) que contribuye al accidente cerebrovascular y conduce a la insuficiencia cardíaca. Actualmente, el único tratamiento para la CAVD es el reemplazo quirúrgico o transcatéter de la válvula aórtica (SAVR y TAVR, respectivamente). No existe una opción no quirúrgica para detener o revertir la progresión de la CAVD, y sin reemplazo valvular, las tasas de mortalidad se acercan al 50% en 2-3 años ^1,2,3. La definición de los mecanismos subyacentes que impulsan esta patología identificará posibles enfoques terapéuticos novedosos.

En un adulto sano, las valvas valvulares aórticas tienen aproximadamente un milímetro de grosor, y su función principal es mantener el flujo unidireccional de sangre fuera del ventrículo izquierdo⁴. Cada uno de los tres foliolos se compone de una capa de células endoteliales valvulares (VEC) que recubre la superficie externa de la valva y funciona como una barrera. Los VEC mantienen la homeostasis valvular regulando la permeabilidad, la adhesión celular inflamatoria y la señalización paracrina ^5,6,7. Las células intersticiales valvulares (CIV) comprenden la mayoría de las células dentro de la valva^{valvular 8}. Los CIV están dispuestos en tres capas distintivas en el folleto. Estas capas se conocen como ventricular, espongiosa y fibrosa⁹. El ventrículo se enfrenta al ventrículo izquierdo y contiene fibras de colágeno y elastina. La capa media, la espongiosa, contiene un alto contenido de proteoglicanos que proporciona flexibilidad de cizallamiento durante el ciclo cardíaco. La capa externa de fibrosa se encuentra cerca de la superficie de salida en el lado aórtico y es rica en colágeno fibrilar tipo I y tipo III que proporciona fuerza para mantener la coaptación durante la diástole^10,11,12. Las CIC residen en un estado quiescente, sin embargo, factores como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y el estrés mecánico pueden alterar la homeostasis de la CIV 8,9,13,14,15,16. Con la pérdida de la homeostasis, los CIC activan y adquieren un fenotipo similar a los miofibroblastos capaz de proliferar, contraer y secar proteínas que remodelan el milieu extracelular¹⁷. Los CIC activados pueden convertirse en células calcificantes, lo que recuerda la diferenciación de una célula madre mesenquimal (MSC) en un osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

La calcificación parece iniciarse en la capa fibrosa rica en colágeno a partir de las contribuciones de los VEC y los CIV, pero se expande e invade las otras capas del folioto⁸. Por lo tanto, está claro que tanto los VEC como los CIC responden a estímulos para regular al alza la expresión de genes osteogénicos, sin embargo, los eventos precisos que impulsan la activación de genes osteogénicos, así como la compleja interacción entre las células y la matriz extracelular de la valva, permanecen mal definidos. Los modelos murinos no son una fuente ideal para estudiar los impulsores no genéticos de la patogénesis de la CAVD, ya que los ratones no desarrollan CAVD de novo^26,27, por lo que es necesario el uso de tejidos humanos primarios y las líneas celulares primarias aisladas de estos tejidos. En particular, es imperativo obtener estas células en grandes cantidades y de buena calidad, ya que el campo de los cultivos celulares 3D y el modelado de organoides se está expandiendo y es probable que se convierta en una alternativa ex vivo basada en humanos a los modelos murinos.

El propósito del presente método es compartir un flujo de trabajo que ha establecido las condiciones para aislar y cultivar eficientemente VEC y CIC obtenidos de válvulas extirpadas quirúrgicamente de donantes humanos. Estudios previos han demostrado el aislamiento exitoso de VEC y VICs de válvulas porcinas²⁸ y murinas²⁹, hasta donde sabemos, este es el primero en describir el aislamiento de estas células en tejidos humanos. El protocolo descrito aquí es aplicable a las válvulas extirpadas humanas y evita y mejora en gran medida el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio mediante la introducción de la utilización de una solución de almacenamiento en frío, una solución tamponada utilizada clínicamente en trasplantes de órganos que estabiliza en gran medida las células del tejido extirpado. El protocolo descrito aquí también muestra cómo determinar el fenotipo celular y garantizar una alta eficiencia de la supervivencia celular con una contaminación cruzada celular mínima.

Protocolo

Todas las muestras de pacientes se recogen de individuos inscritos en estudios aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los tejidos cadavéricos obtenidos a través del Centro para la Recuperación y Educación de Órganos (CORE) fueron aprobados por el Comité de Supervisión de Investigación y Capacitación Clínica con Difuntos (CORID) de la Universidad de Pittsburgh.

1. Homologación y seguridad

1. Obtener la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) o un memorando exento para cualquier recolección de muestras de pacientes o tejidos cadavéricos de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
2. Tome la capacitación institucional requerida para trabajar con tejidos humanos, como capacitación en patógenos transmitidos por la sangre, investigación biomédica con sujetos humanos, privacidad y seguridad de la información, y transporte y envío de materiales biológicos.

2. Logística y preparación

1. Muestras quirúrgicas
   1. Asegúrese de que haya un refrigerador disponible y ubicado cerca de la sala de operaciones. Mantenga en este refrigerador los tubos cónicos de 50 ml preetiquetados con una nomenclatura no identificable que contenga 40 ml de alícuotas estériles de solución de almacenamiento en frío para uso del personal quirúrgico. Estos tubos son estables a 4 °C hasta la fecha de caducidad en el envase original.
   2. Tras la extracción, coloque tejido valvular en estos tubos. Coloque los tubos en un recipiente secundario sellado, como una bolsa de plástico a prueba de fugas o un recipiente de plástico que esté etiquetado con una etiqueta de riesgo biológico. Los tejidos se recogen y transportan en hielo de acuerdo con los protocolos institucionales para el transporte de riesgos biológicos.
2. Muestras cadavéricas
   1. Sumergir los órganos recuperados en una solución de almacenamiento en frío, colocarlos en un recipiente de contención secundario sellado y transportarlos en hielo de acuerdo con los protocolos institucionales para el transporte de riesgos biológicos.

3. Preparación de reactivos

1. Haga placas recubiertas de colágeno al menos el día anterior.
   1. En un tubo cónico de 50 ml, mezcle 5 ml de alcohol isopropílico, 8,7 ml de ácido acético y 0,5 μg de colágeno I en polvo. Llevar hasta 50 mL con agua estéril. Mezclar y filtrar a través de un filtro de 0,45 μm.
   2. Bajo una campana de cultivo celular estéril, agregue suficiente solución de colágeno a 6 platos de pocillos y platos de 10 cm para cubrir todo el fondo. Cubra el plato y deje reposar durante 4-6 h a temperatura ambiente. Retirar el exceso de solución con una pipeta estéril, colocar en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml y guardar a 4 °C para hacer placas adicionales. La solución puede conservarse a 4 °C durante varios meses.
   3. Secar las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche y, posteriormente, almacenarlas en una bolsa resellable a 4 °C. Los platos y platos recubiertos de colágeno se pueden almacenar durante varios meses.
2. Autoclave los siguientes elementos: pinzas de tejido, tijeras de tejido, hisopos de algodón y gasas.
3. Medios de crecimiento VEC: Prepare y use el medio de crecimiento de células endoteliales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Conservar en la oscuridad a 4 °C. Calentar a 37 °C justo antes de usar en las células, no dejar los medios en el baño caliente más tiempo del necesario (10-15 min es suficiente). Use los medios dentro de un mes de la preparación.
4. Medios de crecimiento VIC: Suplemento DMEM base medio (4,5 g/L de glucosa, suplemento de L-glutamina, 110 mg/L de piruvato de sodio)³⁰ con 10% de FBS inactivado por calor y 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Conservar en la oscuridad a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Calentar a 37 °C justo antes de usar en las células, no dejar los medios en el baño caliente más tiempo del necesario (10-15 min es suficiente).
5. Haga una solución de enjuague estéril justo antes de usar. Suplementar PBS estéril con fungicida de 2,5 μg/ml, 0,05 mg/ml de gentamicina y 5 μg/ml bactericida.
6. Haga una solución estéril de colagenasa justo antes de usar. Añadir 5 mg de colagenasa II a 5 ml de medio base DMEM fresco estéril. Mezclar bien y esterilizar la solución pasando por un filtro de 0,45 μm. Mantener en hielo hasta su uso.

4. Preparación y procesamiento de tejidos

NOTA: La aprobación institucional para el uso de tejidos humanos debe obtenerse antes de comenzar a trabajar. Al manipular pañuelos desechables, se debe usar el siguiente equipo de protección personal (EPP): una bata envolvente desechable de barrera líquida o una bata de laboratorio frontal de botón dedicada con una envoltura de barrera líquida alrededor del delantal y tréboles desechables para mangas; un protector facial completo o gafas de seguridad con una máscara quirúrgica; guantes dobles; zapatos cerrados; y ropa para cubrir las piernas. Los diagramas completos de flujo de trabajo de la preparación tisular para la evaluación de calcificación (Sección 5) y el aislamiento celular (Secciones 6 y 7) se ilustran en la Figura 1A, B, respectivamente.

1. Al recibir la muestra de órgano cadavérico, extirpar la raíz aórtica y sumergirla en un tubo cónico de 50 ml de solución de enjuague estéril. Al recibir la muestra quirúrgica, retirar de los recipientes de transporte y sumergir en un tubo cónico de 50 ml de solución de enjuague estéril. Coloque el tubo que contiene el pañuelo en un cubo de hielo en un balancín y mezcle durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: El procesamiento de los tejidos lo más cerca posible del momento de la extracción producirá la mejor recuperación celular, sin embargo, las células viables se pueden recolectar más de 61 h después de la escisión, y los datos muestran que los CIV son más robustos que los VEC a medida que aumenta el tiempo. Si el tejido no puede procesarse inmediatamente, cuando sea posible, extraer el tejido, realizar el paso 4.1 y, a continuación, volver a colocar el tejido en una solución fresca estéril de almacenamiento en frío y conservar a 4 °C hasta que esté listo para continuar. Las válvulas recolectadas durante cirugías nocturnas o de fin de semana se pueden almacenar en una solución de almacenamiento en frío de 40 ml a 4 ° C y aún pueden producir células viables más de 2 días después de la extracción.
2. Rocíe los tubos con etanol al 70% y muévalos a una campana estéril. Extraer el tejido y extirpar dos valvas valvulares (Figura 2A). Coloque un prospecto en un vial criogénico (o 2-3 viales si se necesitan varias piezas más pequeñas para futuros análisis) y congele rápidamente introduciendo nitrógeno líquido y luego guárdelo a -80 °C.
   1. Si la válvula es bicúspide, extirpe solo una valva. Con unas tijeras, corte la valva por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra. Utilice una mitad del prospecto para la congelación rápida y la otra mitad para el paso 4.3.
3. Procese el segundo prospecto para la incrustación de parafina para evaluar el contenido de calcificación cortándolo por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra. Coloque ambas piezas en un casete que esté sumergido en paraformaldehído al 4% (PFA), luego colóquelas en un balancín a RT durante un mínimo de 2 h pero no más de 4 h.
   NOTA: Los tiempos de fijación más largos crean más fondo con la tinción inmunofluorescente. Una vez realizados los pasos 4.2 y 4.3, vaya inmediatamente a la Sección 6 y vuelva al paso 4.4 después del paso 6.12.
4. Después de la fijación, lavar los pañuelos sumergiéndolos en PBS fresco durante 1 h 3-4 veces. Después de estos lavados, las muestras pueden permanecer en PBS a 4 °C durante varios meses si es necesario. Continúe con el siguiente paso justo antes de incrustar.
5. Cambie gradualmente de PBS a etanol al 70%. Lavar 30-60 min cada paso con 1:4 70% etanol:PBS; 1:1 70% etanol:PBS, 4:1 70% etanol:PBS; 70% etanol.
6. Incrustar el tejido de tal manera que las secciones revelen las tres capas del foliolo (Figura 1A) de acuerdo con los protocolos establecidos³¹. Alternativamente, y si está disponible, lleve el tejido a un núcleo de patología para incrustarlo y cortarlo.
7. Después de manipular pañuelos desechables, deseche o guarde el EPP según corresponda y lávese las manos inmediatamente. Descontamine todos los equipos, superficies y desechos sólidos y líquidos con una dilución 1:10 de cloro o desinfectante detergente. Deje 20 minutos para la descontaminación, luego siga con un enjuague con etanol al 70%. Trate la campana de cultivo celular con spray de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Tinción de Von Kossa para el contenido de calcio

NOTA: Esto se puede hacer bien después del aislamiento celular y el establecimiento de la línea, pero asegúrese de vincular el nivel de calcificación del tejido con los documentos relacionados con la línea celular primaria establecida.

1. Cortar rodajas de parafina de 5 o 10 μm de espesor en portaobjetos de vidrio y hornear portaobjetos a 65 °C durante 1 h, luego enfriar a RT.
2. Usando soluciones frescas, desparafinar los portaobjetos sumergiéndolos de la siguiente manera: 100% xileno durante 30 min, 2x; 100% etanol durante 3 min, 2x; 90% etanol durante 3 min; 80% etanol durante 3 min; 70% etanol durante 3 min; 50% etanol durante 3 min; agua ultrapura durante 3 min; Mantener en agua ultrapura hasta los próximos pasos.
   NOTA: Los tiempos anteriores son mínimos, cada paso puede durar más.
3. Proceda con la tinción de Von Kossa de acuerdo con los protocolos del fabricante.
4. Evaluar microscópicamente el área completa de la válvula y asignar un tejido de control (sin signos de calcificación) o CAVD (cualquier evidencia de calcificación, Figura 2B).

6. Aislamiento, expansión y confirmación de células endoteliales valvulares (VEC)

1. En una campana de cultivo celular estéril, abra el tubo cónico que contiene la valva de válvula restante y coloque la valva en un nuevo tubo cónico de 50 ml lleno de PBS helado. Tapa el tubo e invierte suavemente o colócalo en un balancín durante 2 minutos en RT.
2. Retire el tejido a un plato de 60 mm lleno de 5-7 ml de solución fría de colagenasa. Usando fórceps, sumerja ambos lados de la valva en la solución 3-4 veces. Incubar el tejido durante 5-10 min en la incubadora de cultivo celular a 37 °C, meciendo el tejido suavemente cada 2 min 3-4 veces.
3. Retire 2 ml de la solución del plato y colóquela en un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque fórceps en el nódulo y use un hisopo de algodón estéril seco para deslizar desde los fórceps hasta la bisagra, girando el hisopo mientras lo mueve a lo largo de la valva. Entre cada deslizamiento, haga buches con el hisopo en la solución en el tubo cónico de 15 ml para eliminar las células. Repita para frotar completamente la superficie del tejido, luego voltee y repita en el otro lado.
4. Sosteniendo la valva de la válvula con pinzas en una mano y una pipeta de 1 ml en la otra, enjuague las superficies de la valva con la solución en el plato. Una vez enjuagado, transfiera toda la solución que contiene los VEC en el plato al mismo tubo cónico de 15 ml con las células del hisopo y continúe con el paso 6.5. Coloque el tejido valvular restante en un nuevo tubo cónico de 15 ml con 7 ml de solución estéril de colagenasa y continúe con el paso 7.1.
5. Centrifugar el tubo que contiene los VEC a 180 x g durante 5 min para granular los VEC aislados. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 3 mL de medios de crecimiento VEC. Centrifugar una vez más y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de medios de crecimiento y determinar el número de células usando un hemocitómetro y azul de tripano.
6. Resuspender el pellet de VEC en 2 ml de medios de crecimiento VEC y placar las células en un pocillo pre-recubierto de colágeno de una placa de 6 pocillos a aproximadamente 5 x 10⁵ células/cm². Deje que las células crezcan al menos 3-4 días, luego retire los medios y reponga con medios nuevos. Repita el cambio de medios cada 4 días. Los VEC crecerán en parches en forma de adoquines (Figura 3B, paneles izquierdos).
7. Cuando los parches VEC cubren el >80% de la placa, divida las células en aproximadamente 1.3 x 10⁴ células/^cm2 dependiendo de qué tan rápido crezcan (si alcanzan el 80% en menos de 1 semana divididas a un número ligeramente menor de células/cm²).
8. Para dividir, lave las células dos veces con 2 ml de DPBS y luego agregue suficiente reactivo de disociación para cubrir la superficie de las células. Incubar durante 2-3 min a 37 °C, comprobando que las células no estén sobreincubadas. Detenga la digestión agregando el mismo volumen de medios de crecimiento VEC y transfiera líquido a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 x g durante 5 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender en el volumen apropiado de medios para el número de pocillos/placas necesarios.
   NOTA: Una vez expandidos en una placa de 10 cm, los VEC a veces pueden perder su morfología y cambiar de fenotipo a medida que proliferan. Esto tiende a ocurrir cuando los VEC se siembran en una confluencia baja durante el establecimiento y la expansión de la línea celular.
9. Para garantizar un cultivo puro, considere utilizar perlas superparamagnéticas CD31 + con cada división.
10. Para 1 x 10⁸ o menos células (un plato de 10 cm o menos), preparar 25 μL de perlas superparamagnéticas lavándolas de acuerdo con los protocolos del fabricante.
    NOTA: Se recomienda realizar el paso 6.10 antes de la tripsinización de los VEC.
11. Separar las células como en el paso 6.8 pero resuspender en 500 μL de PBS con BSA al 0,1%, pH 7,4, y colocarlas en un tubo de centrífuga de 2 ml. Añadir 500 μL de perlas lavadas y resuspendidas al tubo de células de 2 ml e incubar en un rotador durante 20 min a 4 °C.
12. Coloque los tubos en el imán durante 2 minutos. Mientras el tubo todavía está en el imán, retire con cuidado el sobrenadante. Retire el tubo del imán, agregue 1 ml de PBS fresco con BSA al 0,1%, pipete suavemente 2-3 veces, luego vuelva a colocar el imán durante 2 minutos. Repita 2 veces más. Después de la eliminación final del tampón, resuspenda las células en los medios de crecimiento en el volumen necesario para el rechapado.
    NOTA: Las células seguirán teniendo cuentas, pero éstas no afectarán el crecimiento y se eliminarán en pasajes posteriores.
13. Una vez que las células se han expandido, además de la morfología, confirmar el fenotipo VEC mediante tinción positiva para marcadores inmunofluorescentes como el factor von Willebrand (vWF), cadherina 5 (CDH5) o PECAM-1 / CD31, y tinción negativa para marcadores VIC como calponina 1 (CNN) o actina de músculo liso alfa-2 (αSMA, Figura 4, paneles izquierdos).

7. Aislamiento, expansión y almacenamiento de la celda intersticial de la válvula (VIC)

1. Como se indica en el paso 6.4, después de eliminar los VEC del tejido de la válvula, la valva se coloca en un tubo cónico de 15 ml con 7 ml de solución de colagenasa. Incubar durante 12 h en la incubadora de cultivo celular con la tapa ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases. El aislamiento exitoso de los CIV todavía puede ocurrir con hasta 18 h en solución de colagenasa.
2. Después de la incubación, en una campana de cultivo celular estéril, mezclar el tejido suavemente pipeteando con una pipeta serológica para asegurar la liberación de CIV del tejido de la valva.
3. Retire la suspensión celular y pase a través de un filtro de 0,70 μm a un tubo cónico de 50 ml.
4. Añadir 7 ml de medio de crecimiento VIC al tubo de 50 ml y centrifugar a 180 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio de crecimiento VIC y determinar el número celular. Colocar en placa los CIV en una placa tratada con cultivo de tejidos de 60 mm a 1,3 x 10⁴ células/^cm2.
5. Deje que las células crezcan al menos 1-2 días antes de reemplazar los medios. Retire los medios y lave dos veces los DPBS para eliminar los residuos residuales y reemplazarlos con un medio de crecimiento fresco. Reponga el medio cada 2-3 días. Los CIC crecerán en forma de fibroblastos (Figura 3B, paneles derechos).
6. Cuando los CIC alcancen una confluencia del >90%, lávese dos veces con DPBS para eliminar el exceso de medios y desprenda las células agregando el volumen apropiado de reactivo de disociación precalentado para cubrir la placa (es decir, 2-3 ml por plato de 10 cm). Incubar el plato en una incubadora a 37 °C. Los CIC se desprenderán del plato después de 2-3 minutos de incubación. Agregue 4-6 ml de medios precalentados.
   NOTA: Si las células tardan más de 3 minutos en levantarse de la placa, el reactivo de disociación puede haber perdido potencia. Si es necesario, se puede usar un raspador de células para levantar suavemente las células.
7. Transfiera la suspensión celular a un tubo y centrifugar suavemente a 180 x g durante 5 min. Después de retirar el sobrenadante, resuspenda suavemente el pellet celular en medios de crecimiento VIC precalentados y determine el número de células viables utilizando un hemocitómetro y azul de tripano. Siembre las células viables a una densidad de 1:2 del plato original (es decir, ~ 1 × 10⁶ células por plato de 10 cm o 1.3 x 10⁴ células/cm²).
8. Evalúe el fenotipo VIC mediante tinción positiva para marcadores inmunofluorescentes como αSMA, CNN o SM22α y tinción negativa para marcadores VEC como CD31, CDH5 o vWF (Figura 4, paneles derechos).
   NOTA: El flujo de trabajo del protocolo presentado aquí selecciona imparcialmente un folleto para el aislamiento de VEC y VIC, mientras que los folletos restantes se utilizan para la tinción de Von Kossa (Sección 5) y la congelación rápida.

8. Almacenamiento celular a largo plazo

1. Una vez expandidas, congele las células para su almacenamiento a largo plazo. Lave las células dos veces con 2-5 ml de DPBS y luego agregue suficiente reactivo de disociación para separar las células como en los pasos 6.8 y 7.6. Detenga la digestión agregando el mismo volumen de medios de crecimiento VEC o VIC y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml.
2. Determine el número de células viables mediante el uso de un hemocitómetro y azul de tripano.
3. Centrifugar a 180 x g durante 5 min.
4. Resuspender las células en medios de crecimiento acondicionados refrigerados a una densidad celular de ~ 3 × 10⁶ células/ml.
5. Suavemente con remolinos, agregue un volumen igual de medio de criopreservación 2x refrigerado. Esto llevará la concentración celular a ~ 1.5 × 10⁶ células / ml.
6. Alícuota 1 ml en viales de criopreservación. Coloque los viales en un recipiente de congelación celular, ciérrelos e invierta 5-6 veces para asegurarse de que las celdas permanezcan suspendidas. Coloque el envase a -80 °C durante 6-72 h o según el protocolo del envase de congelación. Retirar los viales a -80 °C y transferirlos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Resultados

El protocolo anterior describe los pasos necesarios para el manejo de tejidos valvulares humanos y el aislamiento y establecimiento de líneas celulares viables a partir de estos tejidos. Las valvas de la válvula aórtica se procesan para la incrustación de parafina, se congelan a presión para su almacenamiento a largo plazo para análisis bioquímicos o genéticos y se digieren para el aislamiento de VEC y CIV (Figura 1). Mientras que las muestras quirúrgicas probablemente tendrán un d...

Discusión

La obtención de tejidos de control y enfermedades de los seres humanos es fundamental para el modelado de enfermedades in vitro y ex vivo; Sin embargo, mientras que a menudo se habla de los desafíos de cerrar la brecha entre el banco y la cabecera, el orden inverso, pasar de la sala quirúrgica al banco, a menudo es una brecha igual de desalentadora. Esencial para que un científico básico obtenga muestras primarias de tejido humano es una colaboración con un científico cirujano invertido que tenga un equipo de enfe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Thermo Scientific	7211345	Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate	Greiner Bio-One	664160	Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet	Fisher	14955234	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips	VWR	76322-154	Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips	VWR	76322-132	Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339650	Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710S	Tissue and cell fixative
190 proof ethanol	Decon	2801	Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium	Gibco	14190250	Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS	Fisher	BP2944100	Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips	VWR	76322-134	Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol	Decon	2701	Deparaffinizing tissue samples
2-propanol	Fisher	A416P 4	Making collagen coated plates
5 mL serological pipet	Fisher	14955233	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish	GenClone	25-260	VEC isolation
6-well cell culture plate	Corning	3516	Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial	Fisher	BP2401 500	Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g	Bioworld	220700233	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody	Abcam	ab46794	Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5	Cell Signaling	2500	Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores	Corning	431751	VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein	Gibco	A1048301	Making collagen coated plates
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray	Decon	4101	Disinfection
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	A27977	Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips	Invitrogen	2026h	Automated cell counter required slide cover
Coverslips	Fisher	125485E	Mounting valve samples
Cryogenic vials	Olympus Plastics	24-202	Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula	Clorox	N/A	Disinfection
DMEM	Gibco	10569044	Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500	Lonza Walkersville	CC3129	Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Model Number: AME3300	Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D Systems	S11550	VIC expansion
Fine scissors	Fine Science Tools	14088-10	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	VIC expansion
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides	Globe Scientific Inc	1358L	mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488	Invitrogen	A11001	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594	Invitrogen	A11005	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594	Invitrogen	A11012	Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide	Invitrogen	A25750	Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Frozen cell storage
Mounting Medium	Fisher Chemical Permount	SP15-100	Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container	Nalgene	51000001	Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Disinfection
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody	Abcam	ab14106	Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors	Fine Science Tools	14001-14	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab	Puritan	25806 10WC	VEC isolation
Swingsette human tissue cassette	Simport Scientific	M515-2	Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061	cell counting solution
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit	Polysciences	246331	Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody	Abcam	ab68545	Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes	Fisher Chemical	X3S-4	Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody	Abcam	ab7817	Primary antibody (VIC positive stain)