Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Resumo

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Resumo

A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) está presente em quase um terço da população idosa. O espessamento, o enrijecimento e a calcificação da válvula aórtica causam estenose aórtica e contribuem para a insuficiência cardíaca e o acidente vascular cerebral. A patogênese da doença é multifatorial, e estresses como inflamação, remodelamento da matriz extracelular, fluxo turbulento e estresse mecânico e deformação contribuem para a diferenciação osteogênica das células endoteliais e intersticiais valvares. No entanto, os fatores iniciais precisos que impulsionam a transição osteogênica de uma célula saudável para uma célula calcificante não estão totalmente definidos. Além disso, a única terapia atual para estenose aórtica induzida por CAVD é a substituição da válvula aórtica, pela qual a válvula nativa é removida (substituição cirúrgica da válvula aórtica, SAVR) ou uma válvula de substituição totalmente dobrável é inserida através de um cateter (substituição da válvula aórtica transcateter, TAVR). Esses procedimentos cirúrgicos têm um alto custo e com sérios riscos; portanto, a identificação de novos alvos terapêuticos para a descoberta de medicamentos é imperativa. Para esse fim, o presente estudo desenvolve um fluxo de trabalho em que tecidos removidos cirurgicamente de pacientes e tecidos de cadáveres de doadores são usados para criar linhas primárias específicas do paciente de células valvares para modelagem de doenças in vitro. Este protocolo introduz a utilização de uma solução de armazenamento a frio, comumente utilizada no transplante de órgãos, para reduzir os danos causados pelo tempo de captação muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, com o benefício de estabilizar grandemente as células do tecido excisado. Os resultados do presente estudo demonstram que as células valvares isoladas retêm sua capacidade proliferativa e fenótipos endoteliais e intersticiais em cultura mais de vários dias após a retirada valvar do doador. O uso desses materiais permite a coleta de células de controle e CARD, a partir das quais as linhagens celulares de controle e doença são estabelecidas.

Introdução

A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) é uma patologia crônica caracterizada por inflamação, fibrose e macrocalcificação dos folhetos valvares aórticos. O remodelamento progressivo e a calcificação dos folhetos (denominada esclerose aórtica) podem levar à obstrução do fluxo sanguíneo (estenose aórtica), o que contribui para o acidente vascular cerebral e leva à insuficiência cardíaca. Atualmente, o único tratamento para CAVD é a substituição cirúrgica ou transcateter da valva aórtica (SAVR e TAVR, respectivamente). Não há opção não cirúrgica para interromper ou reverter a progressão da DAV, e sem a troca valvar, as taxas de mortalidade se aproximam de 50% dentro de 2-3 anos ^1,2,3. Definir os mecanismos subjacentes que impulsionam esta patologia identificará potenciais novas abordagens terapêuticas.

Em um adulto saudável, os folhetos valvares aórticos têm aproximadamente um milímetro de espessura, e sua principal função é manter o fluxo unidirecional de sangue para fora do ventrículo esquerdo⁴. Cada um dos três folhetos é composto por uma camada de células endoteliais da válvula (VECs) que reveste a superfície externa do folheto e funciona como uma barreira. Os VECs mantêm a homeostase valvar regulando a permeabilidade, a adesão das células inflamatórias e a sinalização parácrina ^5,6,7. As células intersticiais valvares (VICs) compreendem a maioria das células dentro do folheto valvar⁸. Os VICs estão dispostos em três camadas distintas no folheto. Essas camadas são conhecidas como ventricular, espongiosa e fibrosa⁹. O ventricular está voltado para o ventrículo esquerdo e contém fibras de colágeno e elastina. A camada intermediária, a espongiosa, contém alto teor de proteoglicanos que proporciona flexibilidade de cisalhamento durante o ciclo cardíaco. A camada externa de fibrosa está localizada próxima à superfície de saída no lado aórtico e é rica em colágeno fibrilar Tipo I e Tipo III, que fornecem força para manter a coaptação durante a diástole^10,11,12. As VICs residem em estado quiescente, no entanto, fatores como inflamação, remodelamento da matriz extracelular (MEC) e estresse mecânico podem interromper a homeostase da CIV 8,9,13,14,15,16. Com a perda da homeostase, os VICs ativam e adquirem um fenótipo semelhante ao miofibroblasto capaz de proliferação, contração e secreção de proteínas que remodelam o milieu extracelular¹⁷. VICs ativadas podem fazer a transição para células calcificantes que lembram a diferenciação de uma célula-tronco mesenquimal (CTM) em um osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

A calcificação parece iniciar-se na camada fibrosa rica em colágeno a partir de contribuições de VECs e VICs, mas se expande e invade as demais camadas do folheto⁸. Assim, fica claro que tanto os VECs quanto os VICs respondem a estímulos para regular positivamente a expressão de genes osteogênicos, no entanto, os eventos precisos que impulsionam a ativação de genes osteogênicos, bem como a complexa interação entre as células e a matriz extracelular do folheto, permanecem mal definidos. Os modelos murinos não são uma fonte ideal para estudar os fatores não genéticos da patogênese da DACD, pois camundongos não desenvolvem CAVD de novo^26,27, portanto^, o uso de tecidos humanos primários e das linhagens celulares primárias isoladas desses tecidos é necessário. Em particular, a obtenção dessas células em grande número e boa qualidade é imperativa, pois o campo das culturas de células 3D e modelagem organoide está se expandindo e provavelmente se tornará uma alternativa humana ex vivo aos modelos murinos.

O objetivo do presente método é compartilhar um fluxo de trabalho que estabeleceu as condições para isolar e cultivar de forma eficiente VECs e VICs obtidos de válvulas removidas cirurgicamente de doadores humanos. Estudos anteriores mostraram o isolamento bem-sucedido de VECs e VICs de válvulas suínas²⁸ e murinas²⁹, até onde sabemos, este é o primeiro a descrever o isolamento dessas células em tecidos humanos. O protocolo descrito aqui é aplicável a válvulas excisadas humanas e contorna e melhora grandemente os danos causados pelo tempo de colheita muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, introduzindo a utilização de uma solução de armazenamento a frio, uma solução tamponada clinicamente utilizada em transplantes de órgãos que estabiliza grandemente as células do tecido excisado. O protocolo aqui descrito também mostra como determinar o fenótipo celular e garantir alta eficiência da sobrevivência celular com o mínimo de contaminação cruzada celular.

Protocolo

Todas as amostras de pacientes são coletadas de indivíduos inscritos em estudos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh, de acordo com a Declaração de Helsinque. Os tecidos cadavéricos obtidos através do Centro de Recuperação e Educação de Órgãos (CORE) foram aprovados pelo Comitê de Supervisão de Pesquisa e Treinamento Clínico Envolvendo Decedentes da Universidade de Pittsburgh (CORID).

1. Homologação e segurança

1. Obter a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) ou um memorando isento para qualquer coleta de amostras de pacientes ou tecidos cadavéricos de acordo com a Declaração de Helsinque.
2. Faça o treinamento institucional necessário para trabalhar com tecidos humanos, como Treinamento de Patógenos Transmitidos pelo Sangue, Pesquisa de Sujeitos Humanos Biomédicos, Privacidade e Segurança da Informação e Transporte e Transporte de Materiais Biológicos.

2. Logística e preparação

1. Amostras Cirúrgicas
   1. Certifique-se de que um refrigerador esteja disponível e localizado perto da sala de cirurgia. Mantenha 50 mL de tubos cônicos pré-rotulados com nomenclatura desidentificada contendo 40 mL de alíquotas estéreis de solução de armazenamento a frio neste refrigerador para uso pela equipe cirúrgica. Estes tubos mantêm-se estáveis a 4 °C até à data de validade na embalagem original.
   2. Após a extração, coloque o tecido da válvula nesses tubos. Coloque os tubos em um recipiente secundário selado, como um saco plástico à prova de vazamentos ou um recipiente de plástico rotulado com um rótulo de risco biológico. Os tecidos são captados e transportados no gelo de acordo com os protocolos institucionais para o transporte de riscos biológicos.
2. Amostras cadavéricas
   1. Submergir órgãos recuperados em solução de armazenamento a frio, colocar em um recipiente de contenção secundário selado e transportá-los no gelo de acordo com protocolos institucionais para o transporte de riscos biológicos.

3. Preparação de reagentes

1. Faça placas revestidas de colágeno pelo menos no dia anterior.
   1. Em um tubo cônico de 50 mL, misture 5 mL de álcool isopropílico, 8,7 mL de ácido acético e 0,5 μg de colágeno I em pó. Traga até 50 mL com água estéril. Misture e filtre através de um filtro de 0,45 μm.
   2. Sob um exaustor de cultura de células estéreis, adicione solução de colágeno suficiente a 6 pratos de poço e pratos de 10 cm para cobrir todo o fundo. Cubra a placa e deixe descansar por 4-6 h à temperatura ambiente. Remova o excesso de solução com uma pipeta estéril, coloque num novo tubo cónico estéril de 50 ml e guarde a 4 °C para fazer placas adicionais. A solução pode ser conservada a 4 °C durante vários meses.
   3. Secar as placas numa incubadora a 37 °C durante a noite e, subsequentemente, armazená-las num saco resselável a 4 °C. Pratos e pratos revestidos de colágeno podem ser armazenados por vários meses.
2. Autoclave os seguintes itens: pinça de tecido, tesoura de tecido, cotonetes e compressas de gaze.
3. Meios de crescimento VEC: Preparar e usar meio de crescimento de células endoteliais de acordo com os protocolos do fabricante. Conservar no escuro a 4 °C. Aqueça a 37 °C imediatamente antes do uso nas células, não deixe o meio em banho de aquecimento por mais tempo do que o necessário (10-15 min é suficiente). Use a mídia dentro de um mês após a preparação.
4. Meios de crescimento VIC: Meio base DMEM suplementar (glicose de 4,5 g/L, suplemento de L-glutamina, piruvato de sódio 110 mg/L)30 com FBS inativado pelo calor a ¹⁰ % e 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Conservar no escuro a 4 °C durante um período máximo de 3 meses. Aqueça a 37 °C imediatamente antes do uso nas células, não deixe o meio em banho de aquecimento por mais tempo do que o necessário (10-15 min é suficiente).
5. Faça a solução de enxágue estéril imediatamente antes do uso. Suplementar PBS estéril com fungicida de 2,5 μg/mL, gentamicina de 0,05 mg/mL e bactericida de 5 μg/mL.
6. Faça uma solução estéril de colagenase pouco antes do uso. Adicione 5 mg de colagenase II a 5 mL de meio de base DMEM fresco estéril. Misture bem e esterilize a solução passando por um filtro de 0,45 μm. Mantenha no gelo até o uso.

4. Preparação e processamento de tecidos

NOTA: A aprovação institucional para a utilização de tecidos de origem humana deve ser obtida antes do início dos trabalhos. Durante o manuseamento de tecidos, devem ser utilizados os seguintes equipamentos de proteção individual (EPI): um vestido de barreira de líquido descartável ou um jaleco frontal de botão dedicado com um envoltório de barreira de líquido em torno do avental e trevos de manga descartáveis; um escudo facial completo, ou óculos de segurança com uma máscara cirúrgica; luvas duplas; sapatos fechados; e roupas para cobrir as pernas. Diagramas de fluxo de trabalho abrangentes da preparação tecidual para avaliação da calcificação (secção 5) e isolamento celular (secções 6 e 7) são ilustrados na Figura 1A,B, respectivamente.

1. Após o recebimento do espécime de órgão cadavérico, extirpar a raiz aórtica e submergir em um tubo cônico de 50 mL de solução de enxágue estéril. Após o recebimento da peça cirúrgica, retirar dos vasos de transporte e submergir em um tubo cônico de 50 mL de solução de enxágue estéril. Coloque o tubo contendo o tecido no balde de gelo no balancim e misture por 10 min à temperatura ambiente (RT).
   NOTA: O processamento de tecidos o mais próximo possível do momento da extração produzirá a melhor recuperação celular, no entanto, células viáveis podem ser coletadas acima de 61 h após a excisão, e os dados mostram que os VICs são mais robustos que os VECs à medida que o tempo aumenta. Se o tecido não puder ser processado imediatamente, sempre que possível, remova o tecido, execute o passo 4.1 e, em seguida, volte a colocar o tecido em solução fresca de armazenamento a frio estéril e mantenha-o a 4 °C até estar pronto para prosseguir. As válvulas coletadas durante cirurgias noturnas ou de fim de semana podem ser armazenadas em solução de armazenamento a frio de 40 mL a 4 °C e ainda são capazes de produzir células viáveis mais de 2 dias após a extração.
2. Pulverize os tubos com etanol a 70% e mova-se para um exaustor estéril. Remover o tecido e extirpar dois folhetos valvares (Figura 2A). Coloque um folheto num frasco para injetáveis criogénico (ou 2-3 frascos para injetáveis se forem necessárias várias peças mais pequenas para análises futuras) e congele por gota de azoto líquido e, em seguida, conservar a -80 °C.
   1. Se a válvula for bicúspide, excique apenas um folheto. Usando uma tesoura, corte o folheto ao meio do nódulo até a dobradiça. Use uma metade do folheto para congelamento instantâneo e a outra metade para a etapa 4.3.
3. Processe o segundo folheto para incorporação de parafina para avaliar o teor de calcificação, cortando-o ao meio do nódulo para a dobradiça. Coloque ambas as peças em uma fita que esteja submersa em paraformaldeído a 4% (PFA) e, em seguida, coloque em um balancim no RT por um período mínimo de 2 h, mas não mais de 4 h.
   NOTA: Tempos de fixação mais longos criam mais fundo com coloração imunofluorescente. Depois que as etapas 4.2 e 4.3 forem executadas, mova imediatamente para a Seção 6 e volte para a etapa 4.4 após a etapa 6.12.
4. Após a fixação, lave os tecidos submergindo em PBS fresco por 1 h 3-4 vezes. Após essas lavagens, as amostras podem permanecer em PBS a 4 °C por vários meses, se necessário. Prossiga para a próxima etapa antes da incorporação.
5. Mudança gradual de PBS para etanol a 70%. Lave 30-60 min cada passo com 1:4 70% de etanol: PBS; 1:1 70% etanol: PBS, 4:1 70% etanol: PBS; 70% etanol.
6. Incorpore o tecido de modo que as seções revelem as três camadas do folheto (Figura 1A) de acordo com os protocolos estabelecidos³¹. Alternativamente, e se disponível, traga o tecido para um núcleo de patologia para incorporação e corte.
7. Depois de manusear os tecidos, descarte ou armazene os EPIs conforme apropriado e lave as mãos imediatamente. Descontaminar todos os equipamentos, superfícies e resíduos sólidos e líquidos com uma diluição 1:10 de água sanitária ou detergente desinfetante. Aguarde 20 minutos para a descontaminação, em seguida, siga com um enxágue de etanol a 70%. Trate o exaustor de cultura celular com spray de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante.

5. Coloração de Von Kossa para o teor de cálcio

NOTA: Isso pode ser feito bem após o isolamento celular e o estabelecimento da linhagem, mas certifique-se de vincular o nível de calcificação do tecido a documentos relativos à linhagem celular primária estabelecida.

1. Cortar fatias de parafina de 5 ou 10 μm de espessura em lâminas de vidro e assar as lâminas a 65 °C durante 1 h, arrefecer depois para RT.
2. Usando soluções frescas, desparafinizar lâminas submergindo da seguinte forma: 100% xileno por 30 min, 2x; 100% etanol por 3 min, 2x; etanol a 90% por 3 min; 80% de etanol por 3 min; etanol a 70% por 3 min; 50% de etanol por 3 min; água ultrapura por 3 min; manter em água ultrapura até os próximos passos.
   NOTA: Os tempos acima são mínimos, cada etapa pode ser mais longa.
3. Prossiga com a coloração de Von Kossa de acordo com os protocolos do fabricante.
4. Avaliar microscopicamente a área valvar completa e atribuir um tecido controle (sem sinal de calcificação) ou CAVD (qualquer evidência de calcificação, Figura 2B).

6. Isolamento, expansão e confirmação da célula endotelial da válvula (VEC)

1. Em um exaustor de cultura de células estéreis, abra o tubo cônico contendo o folheto valvar restante e coloque-o em um novo tubo cônico de 50 mL preenchido com PBS gelado. Tampa do tubo e inverta suavemente ou coloque em um balancim por 2 min no RT.
2. Remova o tecido para um prato de 60 mm preenchido com 5-7 mL de solução fria de colagenase. Usando fórceps, mergulhe ambos os lados do folheto na solução 3-4 vezes. Incubar o tecido por 5-10 min na incubadora de cultura de células a 37 °C, balançando o tecido suavemente a cada 2 min 3-4 vezes.
3. Retire 2 mL da solução do prato e coloque em um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque a pinça no nódulo e use um cotonete seco estéril para deslizar da pinça para a dobradiça, girando o cotonete enquanto o move ao longo do folheto. Entre cada deslize, agite o cotonete na solução no tubo cônico de 15 mL para remover as células. Repita para esfregar completamente a superfície do tecido, depois vire e repita do outro lado.
4. Segurando o folheto da válvula com pinça em uma mão e uma pipeta de 1 mL na outra, lave as superfícies do folheto com a solução no prato. Uma vez enxaguado, transfira toda a solução contendo os VECs no prato para o mesmo tubo cônico de 15 mL com as células do cotonete e prossiga para a Etapa 6.5. Coloque o tecido valvar restante em um novo tubo cônico de 15 mL com 7 mL de solução estéril de colagenase e prossiga para a Etapa 7.1.
5. Centrifugar o tubo que contém os VECs a 180 x g durante 5 min para peletizar os VECs isolados. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 3 mL de meio de crescimento VEC. Centrifugar mais uma vez e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de crescimento e determine o número de células usando um hemocitômetro e azul de tripano.
6. Ressuspeite o pellet VEC em 2 mL de meio de crescimento VEC e pratique as células em um poço pré-revestido de colágeno de uma placa de 6 poços em aproximadamente 5 x 10⁵ células/cm². Deixe as células crescerem pelo menos 3-4 dias, depois remova a mídia e reabasteça com mídias frescas. Repita a mudança de mídia a cada 4 dias. Os VECs crescerão em manchas em forma de paralelepípedos (Figura 3B, painéis à esquerda).
7. Quando os adesivos VEC cobrem >80% da placa, as células divididas em cerca de 1,3 x 10⁴ células/cm 2, dependendo da rapidez com que crescem (se atingirem 80% em menos de 1 semana, dividindo-se a um número ligeiramente menor de células/cm²).
8. Para dividir, lave as células duas vezes com 2 mL de DPBS e, em seguida, adicione reagente de dissociação suficiente para cobrir apenas a superfície das células. Incubar durante 2-3 min a 37 °C, verificando se as células não estão excessivamente incubadas. Pare a digestão adicionando volume igual de meios de crescimento VEC e transfira o líquido para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 180 x g por 5 min, remover o sobrenadante e ressuspender em volume apropriado de meio para o número de poços/placas necessários.
   NOTA: Uma vez expandidos em uma placa de 10 cm, os VECs podem, às vezes, perder sua morfologia e alterar o fenótipo à medida que proliferam. Isso tende a ocorrer quando os VECs são semeados em uma baixa confluência durante o estabelecimento e expansão da linhagem celular.
9. Para garantir uma cultura pura, considere a utilização de contas superparamagnéticas CD31 + a cada divisão.
10. Para 1 x 10⁸ ou menos células (uma prato de 10 cm ou menos), prepare 25 μL de contas superparamagnéticas lavando de acordo com os protocolos do fabricante.
    NOTA: Recomenda-se que a etapa 6.10 seja executada antes da tripsinização dos VECs.
11. Desprenda as células como na etapa 6.8, mas ressuspenda em 500 μL de PBS com BSA a 0,1%, pH 7,4 e coloque em um tubo de centrífuga de 2 mL. Adicionar 500 μL de grânulos lavados e ressuspensos ao tubo de 2 ml de células e incubar num rotador durante 20 minutos a 4 °C.
12. Coloque os tubos no ímã por 2 min. Enquanto o tubo ainda estiver no ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo do ímã, adicione 1 mL de PBS fresco com 0,1% BSA, pipeta suavemente 2-3 vezes, em seguida, coloque de volta no ímã por 2 min. Repita mais 2 vezes. Após a remoção final do tampão, ressuspender as células no meio de crescimento em volume necessário para o replating.
    NOTA: As células ainda terão contas, mas estas não afetarão o crescimento e serão removidas nas passagens subsequentes.
13. Uma vez expandidas as células, além da morfologia, confirme o fenótipo VEC por coloração positiva para marcadores imunofluorescentes como fator de von Willebrand (FvW), caderina 5 (CDH5) ou PECAM-1/CD31, e coloração negativa para marcadores VIC como calponina 1 (CNN) ou alfa-2 actina do músculo liso (αSMA, Figura 4, painéis esquerdos).

7. Isolamento, expansão e armazenamento de células intersticiais valvares (VIC)

1. Como indicado na etapa 6.4, após a remoção dos VECs do tecido valvar, o folheto é colocado em um tubo cônico de 15 mL com 7 mL de solução de colagenase. Incubar por 12 h na incubadora de cultura celular com a tampa ligeiramente aberta para permitir a troca gasosa. O isolamento bem-sucedido de VICs ainda pode ocorrer com até 18 h em solução de colagenase.
2. Após a incubação, em um exaustor de cultura de células estéreis, misture o tecido suavemente pipetando com uma pipeta sorológica para garantir a liberação de VICs do tecido do folheto.
3. Remova a suspensão da célula e passe através de um filtro de 0,70 μm para um tubo cônico de 50 mL.
4. Adicionar 7 mL de meio de crescimento VIC ao tubo de 50 mL e centrifugar a 180 x g por 5 min. Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de crescimento VIC e determinar o número de células. Chapear os VICs em um prato tratado com cultura de tecidos de 60 mm a 1,3 x 10⁴ células/cm².
5. Deixe as células crescerem pelo menos 1-2 dias antes de substituir a mídia. Remova o meio e lave duas vezes o DPBS para remover os detritos residuais e substitua por um meio de crescimento fresco. Reabasteça o meio a cada 2-3 dias. Os VICs crescerão em forma de fibroblastos (Figura 3B, painéis à direita).
6. Quando os VICs atingirem uma confluência de >90%, lave duas vezes com DPBS para remover o excesso de meio e desprenda as células adicionando volume apropriado de reagente de dissociação pré-aquecido para cobrir a placa (ou seja, 2-3 mL por prato de 10 cm). Incubar o prato numa incubadora a 37 °C. VICs se desprenderão do prato após 2-3 min de incubação. Adicione 4-6 mL de meio pré-aquecido.
   NOTA: Se as células demorarem mais de 3 minutos a levantar da placa, o reagente de dissociação pode ter perdido potência. Se necessário, um raspador de células pode ser usado para levantar suavemente as células.
7. Transfira a suspensão da célula para um tubo e centrifugar suavemente a 180 x g por 5 min. Depois de remover o sobrenadante, ressuscite suavemente o pellet celular em meios de crescimento VIC pré-aquecidos e determine o número de células viáveis usando um hemocitômetro e azul de tripano. Semeia as células viáveis a uma densidade de 1:2 do prato original (ou seja, ~ 1 × 10⁶ células por prato de 10 cm ou 1,3 x 10⁴ células / cm²).
8. Avalie o fenótipo VIC por coloração positiva para marcadores imunofluorescentes como αSMA, CNN ou SM22α e coloração negativa para marcadores VEC como CD31, CDH5 ou vWF (Figura 4, painéis direitos).
   NOTA: O fluxo de trabalho do protocolo apresentado aqui seleciona imparcialmente um folheto para isolamento de VECs e VICs, enquanto os folhetos restantes são utilizados para coloração de Von Kossa (Seção 5) e congelamento instantâneo.

8. Armazenamento celular a longo prazo

1. Uma vez expandida, congele as células para armazenamento a longo prazo. Lave as células duas vezes com 2-5 mL de DPBS e, em seguida, adicione reagente de dissociação suficiente para desanexar as células, como nas etapas 6.8 e 7.6. Pare a digestão adicionando volume igual de meios de crescimento VEC ou VIC e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
2. Determine o número de células viáveis usando um hemocitômetro e azul de tripano.
3. Centrífuga a 180 x g durante 5 min.
4. Ressuspeite as células em meios de crescimento condicionados resfriados para uma densidade celular de ~ 3 × 10⁶ células/mL.
5. Suavemente com o redemoinho, adicione um volume igual de meio de criopreservação refrigerado 2x. Isso levará a concentração celular a ~ 1,5 × 10⁶ células / mL.
6. Aliquot 1 mL em frascos de criopreservação. Coloque os frascos para injetáveis num recipiente de congelamento celular, feche e inverta 5-6 vezes para garantir que as células permaneçam suspensas. Coloque o recipiente a -80 °C por 6-72 h ou de acordo com o protocolo do recipiente de congelamento. Remova os frascos para injetáveis de -80 °C e transfira para azoto líquido para armazenamento a longo prazo.

Resultados

O protocolo acima descreve as etapas necessárias para o manuseio de tecidos valvares humanos e o isolamento e estabelecimento de linhagens celulares viáveis a partir desses tecidos. Os folhetos da valva aórtica são processados para incorporação de parafina, congelados para armazenamento a longo prazo para análise bioquímica ou genética e digeridos para o isolamento de VECs e VICs (Figura 1). Enquanto os espécimes cirúrgicos provavelmente terão diagnóstico clínico de estenose a?...

Discussão

A obtenção de tecidos de controle e doenças de seres humanos é fundamental para a modelagem de doenças in vitro e ex vivo; no entanto, enquanto muitas vezes se fala sobre os desafios de preencher a lacuna entre o banco à beira do leito, a ordem inversa - indo da suíte cirúrgica para o banco - é muitas vezes tão assustadora quanto uma lacuna. Essencial para um cientista básico obter espécimes de tecido humano primário é uma colaboração com um cientista cirurgião investido que tem uma equipe de enfermeiros...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Thermo Scientific	7211345	Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate	Greiner Bio-One	664160	Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet	Fisher	14955234	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips	VWR	76322-154	Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips	VWR	76322-132	Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339650	Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710S	Tissue and cell fixative
190 proof ethanol	Decon	2801	Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium	Gibco	14190250	Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS	Fisher	BP2944100	Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips	VWR	76322-134	Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol	Decon	2701	Deparaffinizing tissue samples
2-propanol	Fisher	A416P 4	Making collagen coated plates
5 mL serological pipet	Fisher	14955233	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish	GenClone	25-260	VEC isolation
6-well cell culture plate	Corning	3516	Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial	Fisher	BP2401 500	Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g	Bioworld	220700233	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody	Abcam	ab46794	Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5	Cell Signaling	2500	Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores	Corning	431751	VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein	Gibco	A1048301	Making collagen coated plates
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray	Decon	4101	Disinfection
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	A27977	Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips	Invitrogen	2026h	Automated cell counter required slide cover
Coverslips	Fisher	125485E	Mounting valve samples
Cryogenic vials	Olympus Plastics	24-202	Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula	Clorox	N/A	Disinfection
DMEM	Gibco	10569044	Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500	Lonza Walkersville	CC3129	Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Model Number: AME3300	Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D Systems	S11550	VIC expansion
Fine scissors	Fine Science Tools	14088-10	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	VIC expansion
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides	Globe Scientific Inc	1358L	mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488	Invitrogen	A11001	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594	Invitrogen	A11005	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594	Invitrogen	A11012	Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide	Invitrogen	A25750	Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Frozen cell storage
Mounting Medium	Fisher Chemical Permount	SP15-100	Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container	Nalgene	51000001	Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Disinfection
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody	Abcam	ab14106	Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors	Fine Science Tools	14001-14	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab	Puritan	25806 10WC	VEC isolation
Swingsette human tissue cassette	Simport Scientific	M515-2	Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061	cell counting solution
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit	Polysciences	246331	Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody	Abcam	ab68545	Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes	Fisher Chemical	X3S-4	Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody	Abcam	ab7817	Primary antibody (VIC positive stain)