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要約

このプロトコルは、外科的大動脈弁置換術中または死体組織から抽出されたヒト大動脈弁の収集、およびその後の患者特異的一次弁内皮細胞および間質細胞の分離、拡張、および特性評価について説明しています。細胞生存率と表現型特異性を確保するために必要なプロセスに関する重要な詳細が含まれています。

要約

石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、高齢者人口のほぼ3分の1に存在します。大動脈弁の肥厚、硬化、石灰化は大動脈弁狭窄を引き起こし、心不全や脳卒中の一因となります。疾患の病因は多因子であり、炎症、細胞外マトリックスリモデリング、乱流、機械的ストレスおよびひずみなどのストレスは、弁内皮細胞および弁間質細胞の骨形成分化に寄与する。ただし、健康な細胞の石灰化細胞への骨形成移行を促進する正確な開始因子は完全には定義されていません。さらに、CAVD誘発性大動脈弁狭窄症の唯一の現在の治療法は大動脈弁置換術であり、それによってネイティブ弁が除去されるか(外科的大動脈弁置換術、SAVR)、または完全に折りたたみ可能な置換弁がカテーテルを介して挿入される(経カテーテル大動脈弁置換術、TAVR)。これらの外科的処置は高額で、深刻なリスクが伴います。したがって、創薬のための新しい治療標的を特定することが不可欠です。そのために、本研究では、患者から外科的に除去された組織とドナーの死体組織を使用して、in vitro疾患モデリングのための患者固有の弁膜細胞の一次ラインを作成するワークフローを開発します。このプロトコルでは、臓器移植で一般的に利用される冷蔵ソリューションを利用して、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を軽減し、切除された組織の細胞を大幅に安定化させるという利点をもたらします。本研究の結果は、単離された弁細胞が、ドナーからの弁除去後数日以上の培養において、それらの増殖能力および内皮および間質表現型を保持することを示している。これらの材料を使用すると、コントロール細胞とCAVD細胞の収集が可能になり、そこからコントロール細胞株と疾患細胞株の両方が確立されます。

概要

石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、大動脈弁尖の炎症、線維症、および肉眼石灰化を特徴とする慢性病理です。リーフレットの進行性のリモデリングと石灰化(大動脈硬化症と呼ばれる)は、血流の閉塞(大動脈弁狭窄症)を引き起こし、脳卒中の一因となり、心不全を引き起こす可能性があります。現在、CAVDの唯一の治療法は、外科的または経カテーテル的大動脈弁置換術(それぞれSAVRおよびTAVR)です。CAVDの進行を停止または逆転させる非外科的選択肢はなく、弁置換術を行わないと、死亡率は2〜3年以内に50%に近づきます1,2,3。この病態を駆動する根本的なメカニズムを定義することで、潜在的な新しい治療アプローチが特定されます。

健康な成人では、大動脈弁尖の厚さは約1ミリメートルであり、その主な機能は左心室4からの一方向の血流を維持することです。3つのリーフレットのそれぞれは、リーフレットの外面を裏打ちし、バリアとして機能する弁内皮細胞(VEC)の層で構成されています。VECは、透過性、炎症性細胞接着、およびパラクリンシグナル伝達を調節することにより、弁の恒常性を維持します5,6,7。弁間質細胞(VIC)は、弁尖8内の細胞の大部分を構成する。VICは、リーフレットの3つの特徴的な層に配置されています。これらの層は、心室、海綿状筋、および線維症として知られています9。心室は左心室に面しており、コラーゲンとエラスチン繊維を含んでいます。中間層である海綿状菌には、心周期中にせん断の柔軟性を提供する高いプロテオグリカン含有量が含まれています。外側の線維層は大動脈側の流出面の近くに位置し、拡張期10,11,12の間に共離力を維持する強度を提供するI型およびIII型繊維状コラーゲンが豊富です。VICは静止状態にありますが、炎症、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、機械的ストレスなどの要因により、VICの恒常性が破壊される可能性があります8、9、13、14、15、16。恒常性が失われると、VICは細胞外ミリエウをリモデリングするタンパク質の増殖、収縮、分泌が可能な筋線維芽細胞様表現型を活性化して獲得します17。活性化されたVICは、間葉系幹細胞(MSC)の骨芽細胞への分化を連想させる石灰化細胞に移行することができる15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。

石灰化は、VECとVICの両方の寄与からコラーゲンに富む線維症層で開始されるように見えますが、リーフレット8の他の層を拡大して侵入します。したがって、VECとVICの両方が骨形成遺伝子の発現をアップレギュレートする刺激に応答することは明らかですが、骨形成遺伝子の活性化を引き起こす正確なイベント、および細胞とリーフレットの細胞外マトリックスとの間の複雑な相互作用は、明確に定義されていないままです。マウスはCAVD de novo26,27を発症しないため、マウスモデルはCAVD病因の非遺伝的ドライバーを研究するための理想的な情報源ではなく、したがって、初代ヒト組織およびこれらの組織から分離された初代細胞株の使用が必要である。特に、3D細胞培養やオルガノイドモデリングの分野が拡大しており、マウスモデルに代わるex vivoヒトベースの代替となる可能性が高いため、これらの細胞を大量かつ高品質で取得することが不可欠です。

本手法の目的は、ヒトドナーから外科的に除去された弁から得られたVECおよびVICを効率的に分離および成長させるための条件を確立したワークフローを共有することである。以前の研究では、ブタ28およびマウス弁29からのVECおよびVICの分離に成功したことが示されており、我々の知る限り、これはヒト組織におけるこれらの細胞の単離を説明する最初のものである。ここで説明するプロトコルは、ヒト切除弁に適用可能であり、切除された組織の細胞を大幅に安定化させる臓器移植で臨床的に利用される緩衝液である低温保存溶液の利用を導入することにより、組織切除と実験室処理の間のしばしば長い調達時間によって引き起こされる損傷を大幅に回避および改善します。ここで説明するプロトコルは、細胞表現型を決定し、細胞交差汚染を最小限に抑えて細胞生存の高効率を保証する方法も示しています。

プロトコル

すべての患者サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認された研究に登録された個人から収集されます。臓器回復教育センター(CORE)を介して得られた死体組織は、故人が関与する研究および臨床訓練の監視のためのピッツバーグ大学委員会(CORID)によって承認されました。

1.承認と安全性

  1. ヘルシンキ宣言に従って、治験審査委員会(IRB)の承認または患者サンプルまたは死体組織の収集に関する免除メモを取得します。
  2. 血液媒介病原体トレーニング、生物医学ヒト被験者研究、プライバシーと情報セキュリティ、生物学的物質の輸送と輸送など、人間の組織を扱うために必要な制度的トレーニングを受けてください。

2.ロジスティクスと準備

  1. 手術サンプル
    1. 冷蔵庫が利用可能で、手術室の近くにあることを確認してください。外科スタッフが使用するために、この冷蔵庫に40 mLの滅菌アリコートの冷蔵液を含む匿名化された命名法で事前にラベル付けされた50 mLのコニカルチューブを保管してください。これらのチューブは、元のパッケージの有効期限まで4°Cで安定しています。
    2. 抽出したら、これらのチューブにバルブ組織を入れます。チューブを、漏れ防止のビニール袋やバイオハザードラベルが付いたプラスチック容器などの密閉された二次容器に入れます。組織は、バイオハザードを輸送するための制度的プロトコルに従って、氷上でピックアップおよび輸送されます。
  2. 死体サンプル
    1. 回収した臓器を冷蔵液に浸し、密閉された二次格納容器に入れ、バイオハザードを輸送するための制度的プロトコルに従って氷上で輸送します。

3. 試薬の調製

  1. 少なくとも前日にコラーゲンコーティングされたプレートを作ります。
    1. 50 mLのコニカルチューブに、5 mLのイソプロピルアルコール、8.7 mLの酢酸、および0.5 μgのコラーゲンI粉末を混合します。滅菌水で最大50 mLを持参してください。混合し、0.45 μmのフィルターでろ過します。
    2. 滅菌細胞培養フードの下で、底全体を覆うのに十分なコラーゲン溶液を6ウェルプレートと10 cmディッシュに加えます。プレートを覆い、室温で4〜6時間放置します。滅菌ピペットで余分な溶液を取り除き、新しい滅菌50 mLコニカルチューブに入れ、4°Cで保存して追加のプレートを作成します。溶液は4°Cで数ヶ月間保存できます。
    3. プレートを37°Cのインキュベーターで一晩乾燥させた後、4°Cで再封可能なバッグに保管します。 コラーゲンコーティングされたプレートと皿は数ヶ月間保存することができます。
  2. 次のアイテムをオートクレーブします:組織鉗子、組織ハサミ、綿棒、ガーゼパッド。
  3. VEC増殖培地:メーカーのプロトコルに従って内皮細胞増殖培地を調製して使用します。4°Cの暗所で保管してください。 細胞に使用する直前に37°Cに温め、必要以上に長く培地を温浴に放置しないでください(10〜15分で十分です)。準備後1ヶ月以内に培地を使用してください。
  4. VIC 増殖培地:DMEM ベース培地 (4.5 g/L グルコース、L-グルタミンサプリメント、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム) 30 に 10% 熱不活化 FBS と 100 IU/mL ペニシリンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシンを補充します。4°Cの暗所で最大3か月間保管してください。細胞に使用する直前に37°Cに温め、必要以上に長く培地を温浴に放置しないでください(10〜15分で十分です)。
  5. 使用直前に滅菌すすぎ液を作ります。滅菌PBSに2.5 μg/mLの殺菌剤、0.05 mg/mLのゲンタマイシン、および5 μg/mLの殺菌剤を補給します。
  6. 使用直前に滅菌コラゲナーゼ溶液を作ります。5 mgのコラゲナーゼIIを5 mLの滅菌済み新鮮なDMEMベース培地に加えます。よく混合し、0.45μmのフィルターを通過させて溶液を滅菌します。使用するまで氷の上に保管してください。

4.組織の準備と処理

注:作業を開始する前に、人間の組織の使用に関する機関の承認を取得する必要があります。ティッシュを取り扱うときは、次の個人用保護具(PPE)を着用する必要があります:使い捨ての液体バリアラップアラウンドガウン、またはエプロンと使い捨てスリーブクローバーの周りに液体バリアラップが付いた専用のボタンフロントラボコート。フルフェイスシールド、またはサージカルマスク付きの安全メガネ。二重手袋;つま先の近い靴;そして足を覆うための服。石灰化評価のための組織調製物(セクション5)および細胞単離(セクション6および7)の包括的なワークフロー図を それぞれ図1A、B に示す。

  1. 死体臓器標本を受け取ったら、大動脈根を切除し、滅菌すすぎ液の50mLコニカルチューブに沈めます。手術検体を受け取ったら、輸送容器から取り出し、滅菌すすぎ液の50 mLコニカルチューブに浸します。ティッシュの入ったチューブをロッカーのアイスバケットに入れ、室温(RT)で10分間混合します。
    注:抽出時にできるだけ近い組織を処理すると、最良の細胞回収が得られますが、生細胞は切除後61時間以上で収集でき、データによると、時間が長くなるにつれてVICはVECよりも堅牢になります。組織をすぐに処理できない場合は、可能であれば組織を取り除き、手順4.1を実行してから、組織を新しい滅菌冷蔵溶液に戻し、続行する準備ができるまで4°Cに保ちます。夜間または週末の手術中に収集された弁は、4°Cの40 mLの冷蔵溶液に保存でき、抽出後2日以上経過しても生細胞を得ることができます。
  2. チューブに70%エタノールをスプレーし、滅菌フードに移動します。組織を取り除き、2つの弁冊を切除します(図2A)。1枚のリーフレットを極低温バイアル(または将来の分析のためにいくつかの小さな断片が必要な場合は2〜3バイアル)に入れ、液体窒素を滴下してスナップ凍結し、-80°Cで保存します。
    1. 弁が二尖の場合は、リーフレットを1つだけ切除してください。はさみを使用して、結節からヒンジまでリーフレットを半分に切ります。リーフレットの半分をスナップフリーズに使用し、残りの半分をステップ4.3に使用します。
  3. パラフィン包埋用の2番目のリーフレットを処理して、結節からヒンジまで半分に切断して石灰化含有量を評価します。両方のピースを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に沈めたカセットに入れ、RTのロッカーに最低2時間、4時間以内置きます。
    注:固定時間を長くすると、免疫蛍光染色でより多くのバックグラウンドが作成されます。手順 4.2 と 4.3 を実行したら、すぐにセクション 6 に進み、手順 6.12 の後に手順 4.4 に戻ります。
  4. 固定後、新鮮なPBSに1時間3〜4回沈めて組織を洗浄します。これらの洗浄後、サンプルは必要に応じて4°CのPBSに数ヶ月間留まることができます。埋め込む直前の次のステップに進みます。
  5. PBSから70%エタノールに徐々に変更します。各ステップを1:4 70%エタノール:PBSで30〜60分洗浄します。1:1 70%エタノール:PBS, 4:1 70%エタノール:PBS;70%エタノール。
  6. 確立されたプロトコル31に従って切片がリーフレットの3層(図1A)を明らかにするように組織を埋め込む。あるいは、可能であれば、埋め込みおよび切断のために組織を病理コアに持ってくる。
  7. ティッシュを取り扱った後は、必要に応じてPPEを廃棄または保管し、すぐに手を洗ってください。すべての機器、表面、および固体および液体廃棄物を、漂白剤または洗剤消毒剤の1:10希釈で除染します。除染に20分待ってから、70%エタノールリンスを行います。細胞培養フードをマイコプラズマスプレーで処理します 製造元の指示に従って。

5.カルシウム含有量のフォンコッサ染色

注:これは、細胞の分離とラインの確立後にうまく行うことができますが、組織の石灰化レベルを、確立された初代細胞株に関連する文書にリンクしてください。

  1. 厚さ5または10 μmのパラフィンスライスをスライドガラスにカットし、スライドを65°Cで1時間焼き、RTまで冷却します。
  2. 新鮮な溶液を使用して、次のように沈めてスライドを脱パラフィンします:100%キシレンを30分間、2回;100%エタノールで3分間、2回;90%エタノールを3分間;80%エタノールを3分間;70%エタノールを3分間;50%エタノールを3分間;超純水3分間;次のステップまで超純水に保管してください。
    注:上記の時間は最小であり、各ステップは長くなる可能性があります。
  3. メーカーのプロトコルに従ってフォンコッサ染色を進めます。
  4. 弁の全領域を顕微鏡で評価し、対照組織(石灰化の兆候なし)またはCAVD(石灰化の証拠、 図2B)を割り当てます。

6.弁内皮細胞(VEC)の分離、拡張、および確認

  1. 滅菌細胞培養フードで、残りのバルブリーフレットを含む円錐形チューブを開き、氷冷PBSで満たされた新しい50 mLコニカルチューブにリーフレットを置きます。チューブにキャップをして、RTで2分間静かに反転またはロッカーに置きます。
  2. 5〜7 mLの冷たいコラゲナーゼ溶液で満たされた60 mmディッシュに組織を取り除きます。鉗子を使用して、リーフレットの両側を溶液に3〜4回浸します。組織を37°Cの細胞培養インキュベーター内で5〜10分間インキュベートし、2分ごとに組織を3〜4回穏やかに揺り動かします。
  3. 皿から2 mLの溶液を取り出し、滅菌済みの15 mLコニカルチューブに入れます。結節に鉗子を置き、乾いた滅菌綿棒を使用して鉗子からヒンジまでスワイプし、リーフレットに沿って移動しながら綿棒を回転させます。各スワイプの間に、15 mLコニカルチューブ内の溶液中の綿棒を振り回して、細胞を除去します。繰り返して組織の表面を完全に拭き取り、次に裏返して反対側で繰り返します。
  4. 片手に鉗子で弁尖を持ち、もう片方の手に1mLピペットを持って、皿の中の溶液で弁尖の表面を洗い流します。すすぎが終わったら、皿内のVECを含むすべての溶液を綿棒からの細胞と同じ15 mLコニカルチューブに移し、ステップ6.5に進みます。残りの弁組織を、7 mLの滅菌コラゲナーゼ溶液を入れた新しい15 mLコニカルチューブに入れ、ステップ7.1に進みます。
  5. VECを含むチューブを180 x g で5分間遠心分離し、単離されたVECをペレット化します。上清を吸引し、3 mLのVEC増殖培地に再懸濁します。もう一度遠心分離し、上清を取り除きます。細胞を1 mLの増殖培地に再懸濁し、血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞数を決定します。
  6. VECペレットを2 mLのVEC増殖培地に再懸濁し、細胞を6ウェルプレートのコラーゲンプレコートウェルに約5 x 105 細胞/cm2でプレートします。細胞を少なくとも3〜4日間成長させてから、培地を取り除き、新鮮な培地を補充します。4日ごとにメディア交換を繰り返します。VECは石畳のパッチで成長します(図3B、左パネル)。
  7. VECパッチがプレートの>80%をカバーする場合、細胞の成長速度に応じて、細胞を約1.3 x 104細胞/ cm 2で分割します(1週間以内に80%に達する場合、わずかに少ない細胞数/ cm2で分割します)。
  8. 分割するには、2 mL DPBSで細胞を2回洗浄し、細胞の表面を覆うのに十分な解離試薬を加えます。37°Cで2〜3分間インキュベートし、細胞が過剰にインキュベートされていないことを確認します。等量のVEC増殖培地を加えて消化を停止し、液体を15 mLチューブに移します。180 x g で5分間遠心分離し、上清を除去し、必要な数のウェル/プレートに適した量の培地に再懸濁します。
    注:10 cmプレートに拡張されると、VECは増殖するにつれて形態を失い、表現型が変化することがあります。これは、VECが細胞株の確立および増殖中に低いコンフルエントで播種されるときに起こる傾向がある。
  9. 純粋な培養を保証するには、分割するたびにCD31+超常磁性ビーズを利用することを検討してください。
  10. 1×10個以下の8個以下の細胞(10cmディッシュ1枚以下)の場合は、メーカーのプロトコールに従って洗浄し、25μLの超常磁性ビーズを調製します。
    注:VECのトリプシン処理の前に、ステップ6.10を実行することをお勧めします。
  11. ステップ6.8と同様に細胞を剥離しますが、0.1% BSA、pH 7.4を含む500 μLのPBSに再懸濁し、2 mLの遠沈管に入れます。洗浄および再懸濁したビーズ500 μLを2 mLの細胞チューブに加え、ローテーター上で4°Cで20分間インキュベートします。
  12. チューブを磁石に2分間置きます。チューブがまだ磁石に入っている間に、上清を慎重に取り除きます。チューブを磁石から取り出し、0.1%BSAを含む1 mLの新鮮なPBSを加え、2〜3回ピペットで軽く動かしてから、磁石に2分間戻します。さらに2回繰り返します。バッファーを最終的に除去した後、再プレーティングに必要な容量の増殖培地に細胞を再懸濁します。
    注:細胞にはまだビーズがありますが、これらは成長に影響を与えず、その後の継代で除去されます。
  13. 細胞が増殖したら、形態に加えて、フォンビルブランド因子(vWF)、カドヘリン5(CDH5)、PECAM-1/CD31などの免疫蛍光マーカーの陽性染色、カルポニン1(CNN)やα-2平滑筋アクチンなどのVICマーカーの陰性染色により、VEC表現型を確認します(αSMA、 図4、左パネル)。

7.バルブ間質細胞(VIC)の分離、拡張、および保管

  1. ステップ6.4で述べたように、弁組織からVECを除去した後、リーフレットを7mLのコラゲナーゼ溶液を入れた15mLのコニカルチューブに入れる。ガス交換を可能にするためにキャップをわずかに開いた状態で、細胞培養インキュベーターで12時間インキュベートします。VICの単離は、コラゲナーゼ溶液中で最大18時間で成功する可能性があります。
  2. インキュベーション後、滅菌細胞培養フード内で、血清学的ピペットでピペッティングして組織を穏やかに混合し、リーフレット組織からのVICの放出を確実にします。
  3. 細胞懸濁液を取り出し、0.70 μmのフィルターを通過して50 mLのコニカルチューブに入れます。
  4. 7 mLのVIC増殖培地を50 mLチューブに加え、180 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLのVIC増殖培地に再懸濁し、細胞数を決定します。VICを60 mmの組織培養処理皿に1.3 x 104 細胞/cm2でプレートします。
  5. 培地を交換する前に、細胞を少なくとも1〜2日間増殖させます。培地を取り出し、DPBSを2回洗浄して残留破片を取り除き、新しい成長培地と交換します。2〜3日ごとに培地を補充してください。VICは線維芽細胞の形で成長します(図3B、右パネル)。
  6. VICが>90%のコンフルエンシーに達したら、DPBSで2回洗浄して余分な培地を除去し、プレートを覆うように予熱した解離試薬を適量加えて細胞を剥離します(つまり、10 cmディッシュあたり2〜3 mL)。37°Cのインキュベーターで皿をインキュベートします。VICは、2〜3分のインキュベーション後に皿から剥離します。予熱した培地を4〜6mL加えます。
    注:細胞がプレートから持ち上がるのに3分以上かかる場合は、解離試薬が効力を失っている可能性があります。必要に応じて、セルスクレーパーを使用してセルを静かに持ち上げることができます。
  7. 細胞懸濁液をチューブに移し、180 x g で5分間穏やかに遠心分離します。上清を除去した後、細胞ペレットを予め温めたVIC増殖培地に穏やかに再懸濁し、血球計算盤およびトリパンブルーを用いて生細胞数を決定する。生細胞を元のディッシュの1:2密度で播種します(つまり、10 cmディッシュあたり~1×106 細胞または1.3 x 104 細胞/cm2)。
  8. αSMA、CNN、SM22αなどの免疫蛍光マーカーのポジティブ染色、CD31、CDH5、vWFなどのVECマーカーのネガティブ染色により、VIC表現型を評価します(図4の右パネル)。
    注:ここで紹介するプロトコルワークフローは、VECおよびVICの分離用に1つのリーフレットを偏りなく選択し、残りのリーフレットはフォンコッサ染色(セクション5)およびスナップフリーズに使用されます。

8.長期細胞保存

  1. 拡張したら、長期保存のために細胞を凍結します。2〜5 mLのDPBSで細胞を2回洗浄し、手順6.8および7.6のように細胞を剥離するのに十分な解離試薬を追加します。等量のVECまたはVIC増殖培地を加えて消化を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。
  2. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞数を決定します。
  3. 180 x g で5分間遠心分離します。
  4. 細胞を冷やしたコンディショニング増殖培地に再懸濁して、細胞密度を~3 ×10 6 cells/mLにします。
  5. 穏やかに旋回しながら、等量の冷やした2x凍結保存培地を加えます。これにより、細胞濃度は~1.5 ×10 6 細胞/mLになります。
  6. 1 mLを凍結保存バイアルに分注します。バイアルを細胞凍結容器に入れ、閉じて5〜6回反転させて、細胞が浮遊したままになるようにします。容器を-80°Cで6〜72時間、または凍結容器のプロトコルに従って置きます。バイアルを-80°Cから取り出し、液体窒素に移して長期保存します。

結果

上記のプロトコルは、ヒト弁膜組織の取り扱い、ならびにこれらの組織からの生存細胞株の単離および確立に必要なステップを概説している。大動脈弁のリーフレットは、パラフィン包埋のために処理され、生化学的または遺伝子分析のために長期保存のためにスナップ凍結され、VECおよびVICの単離のために消化されます(図1)。手術標本は大動脈弁狭窄症の臨床診断を?...

ディスカッション

ヒトから対照組織および疾患組織を取得することは、in vitroおよびex vivo疾患モデリングにとって重要です。しかし、ベンチとベッドサイドの間のギャップを埋めることの課題についてよく話しますが、手術室からベンチへの逆の順序は、多くの場合、同じように気が遠くなるようなギャップです。基礎科学者が一次ヒト組織標本を入手するために不可欠なのは、看護師、外科技術者、医師助?...

開示事項

ISは、AtricureとMedtronicから機関研究支援を受けており、Medtronic Vascularのコンサルタントを務めています。これらの競合はいずれもこの作業とは関係ありません。他のすべての著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この原稿の洞察に満ちた議論と批判的な読書をしてくれたジェイソン・ドビンズに感謝します。臓器回復教育センターの支援と支援に感謝し、この研究を可能にしてくれた組織提供者とその家族に感謝します。すべての患者サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認された研究に登録された個人から収集されます。臓器回復教育センター(CORE)を介して得られた死体組織は、故人が関与する研究および臨床訓練の監視のためのピッツバーグ大学委員会(CORID)によって承認されました。

Biorender.com で作成されたいくつかの図。

CSHは、National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917およびR01 HL142932、American Heart Association 20IPA35260111によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filterThermo Scientific7211345Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plateGreiner Bio-One664160Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipetFisher14955234VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tipsVWR76322-154Cell culture/cell line expansion
10XL filter tipsVWR76322-132Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubesThermo Scientific339650Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy Sciences15710STissue and cell fixative
190 proof ethanolDecon2801Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesiumGibco14190250Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBSFisherBP2944100Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tipsVWR76322-134Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanolDecon2701Deparaffinizing tissue samples
2-propanolFisherA416P 4Making collagen coated plates
5 mL serological pipetFisher14955233VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubesThermo Scientific339652Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dishGenClone25-260VEC isolation
6-well cell culture plateCorning3516Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacialFisherBP2401 500Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidinInvitrogenA12379Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant SolutionBridge to LifeBUW0011LTissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25gBioworld220700233VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody Abcamab46794Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Cell Signaling3528Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ DynabeadsInvitrogen11155DVEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5Cell Signaling2500Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm poresCorning431751VIC isolation
Collagen 1, rat tail proteinGibcoA1048301Making collagen coated plates
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant SprayDecon4101Disinfection
Countess II Automated Cell CounterInvitrogenA27977Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslipsInvitrogen2026hAutomated cell counter required slide cover
CoverslipsFisher125485EMounting valve samples
Cryogenic vialsOlympus Plastics24-202Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula CloroxN/ADisinfection
DMEMGibco10569044Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500Lonza WalkersvilleCC3129Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL MicroscopeLife TechnologiesModel Number: AME3300Fluorescent imaging
EVOS XL MicroscopeLife TechnologiesAMEX1000Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium SelectR&D SystemsS11550VIC expansion
Fine scissorsFine Science Tools14088-10Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell ScrapersFisher08-100-241VIC expansion
FungizoneGibco15290-026Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
GentamicinGibco15710-064Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slidesGlobe Scientific Inc1358Lmounting valve samples
Goat anti-Mouse 488InvitrogenA11001Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594InvitrogenA11005Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488InvitrogenA11008Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594InvitrogenA11012Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable SlideInvitrogenA25750Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)InvitrogenR37606Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cellsHyClone Laboratories, Inc.SR30002Frozen cell storage
Mounting MediumFisher Chemical PermountSP15-100Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing containerNalgene51000001Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Disinfection
Penicillin-StreptomycinGibco15140163Antibiotic. VIC expansion
PlasmocinInvivogenANTMPTAnti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibodyAbcamab14106Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissorsFine Science Tools14001-14Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swabPuritan25806 10WCVEC isolation
Swingsette human tissue cassetteSimport ScientificM515-2Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)Fine Science Tools11016-17Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061cell counting solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Splitting VIC/VECs
Von Kossa kitPolysciences246331Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibodyAbcamab68545Primary antibody (VEC positive stain)
XylenesFisher ChemicalX3S-4Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibodyAbcamab7817Primary antibody (VIC positive stain)

参考文献

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