JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, cerrahi aort kapak replasman prosedürleri sırasında veya kadavra dokusundan ekstrakte edilen insan aort kapaklarının toplanmasını ve ardından hastaya özgü primer kapak endotel ve interstisyel hücrelerinin izolasyonunu, genişlemesini ve karakterizasyonunu tanımlar. Hücre canlılığını ve fenotip spesifikliğini sağlamak için gereken süreçlerle ilgili önemli detaylar dahildir.

Özet

Kalsifik aort kapak hastalığı (KAVD) yaşlı nüfusun yaklaşık üçte birinde mevcuttur. Aort kapağının kalınlaşması, sertleşmesi ve kalsifikasyonu aort darlığına neden olur ve kalp yetmezliği ve felce katkıda bulunur. Hastalık patogenezi multifaktöriyeldir ve inflamasyon, hücre dışı matriks remodelingi, türbülanslı akış, mekanik stres ve gerinim gibi gerilmeler kapak endotel ve kapak interstisyel hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sağlıklı bir hücrenin kalsifiye edici bir hücreye osteojenik geçişini yönlendiren kesin başlatıcı faktörler tam olarak tanımlanmamıştır. Ayrıca, CAVD'ye bağlı aort darlığı için tek güncel tedavi, doğal kapağın çıkarıldığı (cerrahi aort kapak replasmanı, SAVR) veya bir kateter (transkateter aort kapak replasmanı, TAVR) yoluyla tamamen katlanabilir bir yedek kapağın yerleştirildiği aort kapağı replasmanıdır. Bu cerrahi prosedürler yüksek maliyetle ve ciddi risklerle birlikte gelir; Bu nedenle, ilaç keşfi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi zorunludur. Bu amaçla, bu çalışma, hastalardan cerrahi olarak çıkarılan dokuların ve donör kadavra dokularının, in vitro hastalık modellemesi için hastaya özgü birincil kapak hücresi hatları oluşturmak için kullanıldığı bir iş akışı geliştirmektedir. Bu protokol, organ naklinde yaygın olarak kullanılan bir soğuk hava deposu çözeltisinin, eksize edilen dokunun hücrelerini büyük ölçüde stabilize etme yararıyla, doku eksizyonu ve laboratuvar işlemleri arasındaki genellikle uzun tedarik süresinin neden olduğu hasarı azaltmak için kullanılmasını sağlar. Bu çalışmanın sonuçları, izole kapak hücrelerinin proliferatif kapasitelerini ve kültürdeki endotel ve interstisyel fenotiplerini, donörden kapak çıkarıldıktan birkaç gün sonra koruduklarını göstermektedir. Bu materyallerin kullanılması, hem kontrol hem de hastalık hücre hatlarının oluşturulduğu kontrol ve CAVD hücrelerinin toplanmasına izin verir.

Giriş

Kalsifik aort kapak hastalığı (KAVD), aort kapak broşürlerinin inflamasyonu, fibrozisi ve makrokalsifikasyonu ile karakterize kronik bir patolojidir. Broşürlerin ilerleyici yeniden şekillenmesi ve kalsifikasyonu (aort skleroz olarak adlandırılır), inmeye katkıda bulunan ve kalp yetmezliğine yol açan kan akışının tıkanmasına (aort darlığı) yol açabilir. Günümüzde KAVD'nin tek tedavisi cerrahi veya transkateter aort kapak replasmanıdır (sırasıyla SAVR ve TAVR). KAVD progresyonunu durdurmak veya tersine çevirmek için cerrahi olmayan bir seçenek yoktur ve kapak replasmanı olmadan mortalite oranları 2-3 yıl içinde %50'ye yaklaşır 1,2,3. Bu patolojiyi yönlendiren altta yatan mekanizmaların tanımlanması, potansiyel yeni terapötik yaklaşımları tanımlayacaktır.

Sağlıklı bir yetişkinde, aort kapak broşürleri yaklaşık bir milimetre kalınlığındadır ve ana işlevleri sol ventrikülden tek yönlü kan akışını sağlamaktır4. Üç broşürün her biri, broşürün dış yüzeyini kaplayan ve bir bariyer görevi gören bir valf endotel hücreleri (VEC) tabakasından oluşur. DEB'ler geçirgenliği, inflamatuar hücre yapışmasını ve parakrin sinyalinidüzenleyerek kapak homeostazını korur 5,6,7. Valf interstisyel hücreleri (VIC'ler), kapak broşürü8'deki hücrelerin çoğunluğunu oluşturur. VIC'ler broşürde üç farklı katman halinde düzenlenmiştir. Bu tabakalar ventrikülaris, spongiosa ve fibroza9 olarak bilinir. Ventrikülis sol ventriküle bakar ve kollajen ve elastin lifleri içerir. Orta tabaka olan spongiosa, kalp döngüsü sırasında kesme esnekliği sağlayan yüksek proteoglikan içeriği içerir. Dış fibroza tabakası aort tarafındaki çıkış yüzeyine yakın bir yerde bulunur ve diyastol10,11,12 sırasında koaptasyonu sürdürmek için güç sağlayan Tip I ve Tip III fibriller kollajen bakımından zengindir. VIC'ler sessiz bir durumda bulunur, ancak iltihaplanma, hücre dışı matrisin (ECM) yeniden şekillenmesi ve mekanik stres gibi faktörler VIC homeostazınıbozabilir 8,9,13,14,15,16. Homeostaz kaybı ile VIC'ler, hücre dışı milieu17'yi yeniden şekillendiren proteinlerin çoğalması, kasılması ve salgılanması yeteneğine sahip miyofibroblast benzeri bir fenotipi aktive eder ve kazanır. Aktif VIC'ler, bir mezenkimal kök hücrenin (MSC) bir osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25'e farklılaşmasını hatırlatan kalsifiye edici hücrelere geçebilir.

Kalsifikasyon, kollajen bakımından zengin fibroza tabakasında hem VEC'lerin hem de VIC'lerin katkılarından başlamış gibi görünmektedir, ancak broşür8'in diğer katmanlarını genişletir ve istila eder. Bu nedenle, hem VEC'lerin hem de VIC'lerin osteojenik genlerin ekspresyonunu yükseltmek için uyaranlara yanıt verdiği açıktır, ancak osteojenik genlerin aktivasyonunu yönlendiren kesin olayların yanı sıra hücreler ile broşürün hücre dışı matrisi arasındaki karmaşık etkileşim kötü tanımlanmıştır. Murin modelleri, CAVD patogenezinin genetik olmayan sürücülerini incelemek için ideal bir kaynak değildir, çünkü fareler CAVD de novo26,27'yi geliştirmez, bu nedenle birincil insan dokularının ve bu dokulardan izole edilen birincil hücre hatlarının kullanılması gereklidir. Özellikle, bu hücrelerin yüksek sayılarda ve iyi kalitede elde edilmesi zorunludur, çünkü 3D hücre kültürleri ve organoid modelleme alanı genişlemektedir ve murin modellerine ex vivo insan bazlı bir alternatif haline gelmesi muhtemeldir.

Mevcut yöntemin amacı, insan donörlerinden cerrahi olarak çıkarılan valflerden elde edilen VEC'leri ve VIC'leri verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için koşulları oluşturan bir iş akışını paylaşmaktır. Önceki çalışmalar, VEC'lerin ve VIC'lerin domuz28 ve murin kapakçıkları29'dan başarılı bir şekilde izole edildiğini göstermiştir, bildiğimiz kadarıyla bu, bu hücrelerin insan dokularındaki izolasyonunu tanımlayan ilk kişidir. Burada açıklanan protokol, insan eksize edilmiş valfleri için geçerlidir ve eksize edilen dokunun hücrelerini büyük ölçüde stabilize eden organ nakillerinde klinik olarak kullanılan tamponlu bir çözelti olan soğuk hava deposu çözeltisinin kullanımını tanıtarak, doku eksizyonu ile laboratuvar işlemleri arasındaki genellikle uzun tedarik süresinin neden olduğu hasarı büyük ölçüde atlatır ve iyileştirir. Burada açıklanan protokol ayrıca hücre fenotipinin nasıl belirleneceğini ve minimum hücre çapraz kontaminasyonu ile hücre sağkalımının yüksek verimliliğini garanti ettiğini göstermektedir.

Protokol

Tüm hasta örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak Pittsburgh Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan çalışmalara kayıtlı kişilerden toplanır. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi (CORE) aracılığıyla elde edilen kadavra dokuları, Pittsburgh Üniversitesi Aldatıcıları İçeren Araştırma ve Klinik Eğitimin Gözetimi Komitesi (CORID) tarafından onaylanmıştır.

1. Onay ve güvenlik

  1. Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hasta örneklerinin veya kadavra dokularının herhangi bir şekilde toplanması için Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı veya muaf bir not alın.
  2. Kan Yoluyla Bulaşan Patojenler Eğitimi, Biyomedikal İnsan Denekleri Araştırması, Gizlilik ve Bilgi Güvenliği ve Biyolojik Malzemelerin Taşınması ve Nakliyesi gibi insan dokularıyla çalışmak için gerekli kurumsal eğitimi alın.

2. Lojistik ve hazırlık

  1. Cerrahi Örnekler
    1. Buzdolabının mevcut olduğundan ve ameliyathanenin yakınında bulunduğundan emin olun. 50 mL konik tüpleri, cerrahi personel tarafından kullanılmak üzere bu buzdolabında 40 mL steril alikot soğuk hava deposu çözeltisi içeren tanımlanmamış isimlendirme ile önceden etiketlenmiş olarak saklayın. Bu tüpler, orijinal paketteki son kullanma tarihine kadar 4 ° C'de kararlıdır.
    2. Ekstraksiyon üzerine, valf dokusunu bu tüplere yerleştirin. Tüpleri, sızdırmaz plastik torba veya biyolojik tehlike etiketi ile etiketlenmiş plastik bir kap gibi kapalı bir ikincil kaba yerleştirin. Dokular, biyolojik tehlikelerin taşınması için kurumsal protokollere göre buz üzerinde toplanır ve taşınır.
  2. Kadavra örnekleri
    1. Geri kazanılan organları soğuk hava deposu çözeltisine batırın, kapalı bir ikincil muhafaza kabına yerleştirin ve biyolojik tehlikelerin taşınması için kurumsal protokollere göre buz üzerinde taşıyın.

3. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Kollajen kaplı plakaları en az bir gün önce yapın.
    1. 50 mL'lik bir konik tüpte, 5 mL izopropil alkol, 8.7 mL asetik asit ve 0.5 μg kollajen I tozu karıştırın. Steril su ile 50 mL'ye kadar getirin. 0,45 μm'lik bir filtreyle karıştırın ve süzün.
    2. Steril bir hücre kültürü başlığı altında, 6 kuyucuk plakasına ve 10 cm'lik tabaklara tüm tabanı kaplayacak kadar kolajen çözeltisi ekleyin. Plakayı örtün ve oda sıcaklığında 4-6 saat bekletin. Fazla çözeltiyi steril bir pipetle çıkarın, yeni bir steril 50 mL konik tüpe yerleştirin ve ek plakalar yapmak için 4 °C'de tasarruf edin. Çözelti birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
    3. Plakaları gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde kurutun ve daha sonra 4 ° C'de yeniden kapatılabilir bir torbada saklayın. Kollajen kaplı tabaklar ve tabaklar birkaç ay saklanabilir.
  2. Aşağıdaki maddeleri otoklav edin: doku forsepsleri, doku makasları, pamuklu çubuklar ve gazlı bez pedleri.
  3. VEC büyüme ortamı: Endotel hücre büyüme ortamını üreticinin protokollerine göre hazırlayın ve kullanın. Karanlıkta 4 °C'de saklayın. Hücrelerde kullanılmadan hemen önce 37 ° C'ye kadar ılık, ortamları ısınma banyosunda gerekenden daha uzun süre bırakmayın (10-15 dakika yeterlidir). Medyayı hazırlandıktan sonraki bir ay içinde kullanın.
  4. VIC büyüme ortamı: Ek DMEM baz ortamı (4.5 g / L glikoz, L-glutamin takviyesi, 110 mg / L sodyum piruvat)30% 10 ısı-inaktive FBS ve 100 I.U. / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin. Karanlıkta 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın. Hücrelerde kullanılmadan hemen önce 37 ° C'ye kadar ılık, ortamları ısınma banyosunda gerekenden daha uzun süre bırakmayın (10-15 dakika yeterlidir).
  5. Kullanmadan hemen önce steril durulama çözeltisi yapın. 2.5 μg / mL mantar ilacı, 0.05 mg / mL gentamisin ve 5 μg / mL bakterisit ile steril PBS takviyesi.
  6. Kullanmadan hemen önce steril kollajenaz çözeltisi yapın. 5 mg kollajenaz II ila 5 mL steril taze DMEM baz ortamı ekleyin. İyice karıştırın ve 0,45 μm'lik bir filtreden geçerek çözeltiyi sterilize edin. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.

4. Doku hazırlama ve işleme

NOT: İnsan dokularının kullanımı için kurumsal onay, çalışmaya başlamadan önce alınmalıdır. Mendilleri tutarken, aşağıdaki kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir: tek kullanımlık bir sıvı bariyeri sarma elbisesi veya önlük ve tek kullanımlık kollu yoncaların etrafına sıvı bariyerli bir sargılı özel bir düğmeli ön laboratuvar önlüğü; tam bir yüz kalkanı veya cerrahi maskeli güvenlik gözlükleri; çift eldiven; yakın parmaklı ayakkabılar; ve bacakları örtmek için kıyafetler. Kalsifikasyon değerlendirmesi (Bölüm 5) ve hücre izolasyonu (Bölüm 6 ve 7) için doku hazırlığının kapsamlı iş akışı diyagramları sırasıyla Şekil 1A,B'de gösterilmiştir.

  1. Kadavra organ örneği alındıktan sonra, aort kökünü eksize edin ve 50 mL'lik bir konik steril durulama çözeltisi tüpüne batırın. Cerrahi numune alındıktan sonra, taşıma kaplarından çıkarın ve 50 mL'lik konik bir steril durulama çözeltisi tüpüne batırın. Dokuyu içeren tüpü rocker üzerindeki buz kovasına yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika karıştırın.
    NOT: Dokuların ekstraksiyon zamanına mümkün olduğunca yakın işlenmesi en iyi hücre geri kazanımını sağlayacaktır, ancak canlı hücreler eksizyon sonrası 61 saatten fazla toplanabilir ve veriler VIC'lerin zaman arttıkça VEC'lerden daha sağlam olduğunu göstermektedir. Doku hemen işlenemezse, mümkün olduğunda, dokuyu çıkarın, adım 4.1'i uygulayın ve ardından dokuyu taze steril soğuk depo çözeltisine geri koyun ve ilerlemeye hazır olana kadar 4 ° C'de tutun. Gece veya hafta sonu ameliyatları sırasında toplanan valfler, 4 ° C'de 40 mL soğuk hava deposu çözeltisinde saklanabilir ve yine de ekstraksiyondan sonraki 2 günden fazla canlı hücreler üretebilir.
  2. Tüpleri% 70 etanol ile püskürtün ve steril bir davlumbaza geçin. Dokuyu çıkarın ve iki valf broşürünü çıkarın (Şekil 2A). Bir broşürü kriyojenik bir şişeye (veya gelecekteki analizler için birkaç küçük parçaya ihtiyaç duyulursa 2-3 şişeye) yerleştirin ve sıvı azota bırakarak dondurun, ardından -80 ° C'de saklayın.
    1. Vana biküspid ise, sadece bir broşürü tüketin. Makas kullanarak, broşürü nodülden menteşeye kadar ikiye bölün. Broşürün bir yarısını çıtçıtlı dondurma için, diğer yarısını ise adım 4.3 için kullanın.
  3. Parafin gömme için ikinci broşürü, kalsifikasyon içeriğini nodülden menteşeye ikiye bölerek değerlendirmek için işleyin. Her iki parçayı da% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırılmış bir kasete yerleştirin, ardından RT'de bir rocker'a en az 2 saat, ancak en fazla 4 saat boyunca yerleştirin.
    NOT: Daha uzun sabitleme süreleri, immünofloresan boyama ile daha fazla arka plan oluşturur. Adım 4.2 ve 4.3 uygulandıktan sonra, hemen Bölüm 6'ya geçin ve adım 6.12'den sonra adım 4.4'e geri dönün.
  4. Fiksasyondan sonra, dokuları taze PBS'ye 1 saat 3-4 kez batırarak yıkayın. Bu yıkamalardan sonra, numuneler gerekirse PBS'de 4 ° C'de birkaç ay kalabilir. Katıştırmadan hemen önce bir sonraki adıma geçin.
  5. PBS'den yavaş yavaş% 70 etanol'e değiştirin. Her adımda 30-60 dakika 1:4% 70 etanol:PBS ile yıkayın; 1:1 %70 etanol:PBS, 4:1 %70 etanol:PBS; % 70 etanol.
  6. Dokuyu, bölümlerin broşürün üç katmanını ortaya çıkaracak şekilde gömün (Şekil 1A) yerleşik protokoller31'e göre. Alternatif olarak ve eğer varsa, dokuyu gömmek ve kesmek için bir patoloji çekirdeğine getirin.
  7. Dokuları kullandıktan sonra, KKD'leri uygun şekilde atın veya saklayın ve derhal ellerinizi yıkayın. Tüm ekipmanı, yüzeyleri ve katı ve sıvı atıkları 1:10 seyreltilmiş çamaşır suyu veya deterjan dezenfektanı ile dekontamine edin. Dekontaminasyon için 20 dakika bekleyin, ardından% 70 etanol durulama ile takip edin. Hücre kültürü davlumbazını, üreticinin talimatlarına göre mikoplazma spreyi ile tedavi edin.

5. Kalsiyum içeriği için Von Kossa boyama

NOT: Bu, hücre izolasyonu ve hat oluşumundan sonra iyi yapılabilir, ancak dokunun kalsifikasyon seviyesini, kurulan birincil hücre hattına ait belgelere bağladığınızdan emin olun.

  1. 5 veya 10 μm kalınlığındaki parafin dilimlerini cam slaytlar üzerine kesin ve slaytları 65 °C'de 1 saat pişirin, ardından RT'ye soğutun.
  2. Taze çözeltiler kullanarak, slaytları aşağıdaki gibi suya batırarak ayrıştırın: 30 dakika boyunca% 100 ksilen, 2x; 3 dakika, 2x için% 100 etanol; 3 dakika boyunca% 90 etanol; 3 dakika boyunca% 80 etanol; 3 dakika boyunca% 70 etanol; 3 dakika boyunca% 50 etanol; 3 dakika boyunca ultra saf su; sonraki adımlara kadar ultra saf suda tutun.
    NOT: Yukarıdaki süreler minimumdur, her adım daha uzun sürebilir.
  3. Üreticinin protokollerine göre Von Kossa boyama işlemine devam edin.
  4. Tam kapak alanını mikroskobik olarak değerlendirin ve bir kontrol dokusu (kalsifikasyon belirtisi yok) veya CAVD (herhangi bir kalsifikasyon kanıtı, Şekil 2B) atayın.

6. Valf Endotel Hücresi (VEC) izolasyonu, genişlemesi ve doğrulanması

  1. Steril bir hücre kültürü başlığında, kalan valf broşürünü içeren konik tüpü açın ve broşürü buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş yeni bir 50 mL konik tüpe yerleştirin. Kapak tüpünü kapatın ve RT'de 2 dakika boyunca yavaşça ters çevirin veya bir rocker'a yerleştirin.
  2. Dokuyu 5-7 mL soğuk kollajenaz çözeltisi ile doldurulmuş 60 mm'lik bir kaba çıkarın. Forseps kullanarak, broşürün her iki tarafını da çözeltiye 3-4 kez batırın. Dokuyu hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca inkübe edin, dokuyu her 2 dakikada bir 3-4 kez hafifçe sallayın.
  3. Çözeltinin 2 mL'sini tabaktan çıkarın ve steril 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. Forsepsleri nodüllere yerleştirin ve forsepslerden menteşeye kaydırmak için kuru steril bir pamuklu çubuk kullanın, broşür boyunca hareket ettirirken çubuğu döndürün. Her kaydırma arasında, hücreleri çıkarmak için 15 mL konik tüp içindeki çözeltideki çubuğu sürün. Dokunun yüzeyini tamamen temizlemek için tekrarlayın, ardından ters çevirin ve diğer tarafta tekrarlayın.
  4. Valf broşürünü bir elinde forseps ve diğer elinde 1 mL pipet ile tutarak, broşürün yüzeylerini tabaktaki çözelti ile durulayın. Durulandıktan sonra, çanaktaki VEC'leri içeren tüm çözeltiyi, çubuktan gelen hücrelerle aynı 15 mL konik tüpe aktarın ve Adım 6.5'e geçin. Kalan kapak dokusunu 7 mL steril kollajenaz çözeltisi içeren yeni bir 15 mL konik tüpe yerleştirin ve Adım 7.1'e geçin.
  5. İzole edilmiş VEC'leri peletlemek için VEC'leri içeren tüpü 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve 3 mL VEC büyüme ortamını yeniden askıya alın. Bir kez daha santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 1 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın ve bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak hücre sayısını belirleyin.
  6. VEC peletini 2 mL VEC büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri yaklaşık 5 x 105 hücre / cm2'de 6 kuyucuklu bir plakanın önceden kaplanmış bir kollajen kuyucuğunda plakalayın. Hücrelerin en az 3-4 gün büyümesine izin verin, ardından medyayı çıkarın ve taze ortamlarla doldurun. Her 4 günde bir değişen medyayı tekrarlayın. VEC'ler parke taşı şeklindeki yamalarda büyüyecektir (Şekil 3B, sol paneller).
  7. VEC yamaları plakanın% >80'ini kapladığında, hücreleri ne kadar hızlı büyüdüklerine bağlı olarak yaklaşık 1.3 x 104 hücre / cm2'de bölün (1 haftadan kısa bir sürede% 80'e ulaşırlarsa, biraz daha düşük sayıda hücre /cm2'de bölünür).
  8. Bölmek için, hücreleri 2 mL DPBS ile iki kez yıkayın, ardından hücrelerin yüzeyini örtmek için yeterli ayrışma reaktifi ekleyin. 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübe edin, hücrelerin fazla inkübe edilmediğinden emin olun. Eşit hacimde VEC büyüme ortamı ekleyerek sindirimi durdurun ve sıvıyı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 180 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın ve ihtiyaç duyulan kuyu / plaka sayısı için uygun miktarda ortama yeniden askıya alın.
    NOT: 10 cm'lik bir plakaya genişletildikten sonra DEK'ler bazen morfolojilerini kaybedebilir ve çoğaldıkça fenotipi değiştirebilir. Bu eğilim, VEC'ler hücre hattının kurulması ve genişlemesi sırasında düşük bir akıcılıkta tohumlandığında ortaya çıkar.
  9. Saf bir kültürü garanti etmek için, her bölünmede CD31 + süperparamanyetik boncuklar kullanmayı düşünün.
  10. 1 x 108 veya daha az hücre için (bir 10 cm veya daha az tabak), üreticinin protokollerine göre yıkayarak 25 μL süperparamanyetik boncuk hazırlayın.
    NOT: Adım 6.10'un DEK'lerin tripsinizasyonundan önce yapılması önerilir.
  11. Adım 6.8'deki gibi hücreleri ayırın, ancak% 0.1 BSA, pH 7.4 ile 500 μL PBS'de yeniden askıya alın ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 2 mL hücre tüpüne 500 μL yıkanmış ve yeniden askıya alınmış boncuklar ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir rotatör üzerinde inkübe edin.
  12. Tüpleri mıknatısa 2 dakika boyunca yerleştirin. Tüp hala mıknatısın içindeyken, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Tüpü mıknatıstan çıkarın, %0,1 BSA ile 1 mL taze PBS ekleyin, 2-3 kez hafifçe pipet ekleyin, ardından 2 dakika boyunca mıknatısa geri yerleştirin. 2 kez daha tekrarlayın. Tamponun nihai olarak çıkarılmasından sonra, büyüme ortamındaki hücreleri, yeniden kaplama için gereken hacimde yeniden askıya alın.
    NOT: Hücreler hala boncuklara sahip olacak, ancak bunlar büyümeyi etkilemeyecek ve sonraki pasajlarda çıkarılacaktır.
  13. Hücreler genişletildikten sonra, morfolojiye ek olarak, von Willebrand faktörü (vWF), kadherin 5 (CDH5) veya PECAM-1 / CD31 gibi immünofloresan belirteçler için pozitif boyama ve kalponin 1 (CNN) veya alfa-2 düz kas aktinini gibi VIC belirteçleri için negatif boyama ile VEC fenotipini doğrular (αSMA, Şekil 4, sol paneller).

7. Valf İnterstisyel Hücre (VIC) izolasyonu, genişlemesi ve depolanması

  1. Adım 6.4'te belirtildiği gibi, VEC'leri kapak dokusundan çıkardıktan sonra, broşür 7 mL kollajenaz çözeltisi ile 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirilir. Gaz değişimine izin vermek için kapağı hafifçe açık olan hücre kültürü inkübatöründe 12 saat boyunca inkübe edin. VIC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi, kollajenaz çözeltisinde 18 saate kadar hala gerçekleşebilir.
  2. Kuluçkadan sonra, steril bir hücre kültürü başlığında, VIC'lerin broşür dokusundan salınmasını sağlamak için pipetle pipetle dokuyu nazikçe karıştırın.
  3. Hücre süspansiyonunu çıkarın ve 0,70 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik konik bir tüpe geçirin.
  4. 50 mL tüpe 7 mL VIC büyüme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 180 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1 mL VIC büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücre sayısını belirleyin. VIC'leri 60 mm doku kültürü ile muamele edilmiş bir tabakta 1.3 x 104 hücre /cm2'de plakalayın.
  5. Ortamın değiştirilmesinden en az 1-2 gün önce hücrelerin büyümesine izin verin. Kalan kalıntıları gidermek ve taze büyüme ortamı ile değiştirmek için medyayı çıkarın ve DPBS'yi iki kez yıkayın. Her 2-3 günde bir ortamı doldurun. VIC'ler fibroblast şeklinde büyüyecektir (Şekil 3B, sağ paneller).
  6. VIC'ler% >90'lık bir akıcılığa ulaştığında, fazla ortamı çıkarmak için DPBS ile iki kez yıkayın ve plakayı örtmek için uygun miktarda önceden ısıtılmış ayrışma reaktifi ekleyerek hücreleri ayırın (yani, 10 cm'lik çanak başına 2-3 mL). Çanağı 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. VIC'ler 2-3 dakikalık inkübasyondan sonra çanaktan ayrılacaktır. 4-6 mL önceden ısıtılmış ortam ekleyin.
    NOT: Hücrelerin plakayı kaldırması 3 dakikadan uzun sürerse, ayrışma reaktifi gücünü kaybetmiş olabilir. Gerekirse, hücreleri nazikçe kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanılabilir.
  7. Hücre süspansiyonunu bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 180 x g'de yavaşça santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini önceden ısıtılmış VIC büyüme ortamında nazikçe yeniden askıya alın ve bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Canlı hücreleri orijinal çanağın 1: 2 yoğunluğunda tohumlayın (yani, 10 cm çanak başına ~ 1 × 106 hücre veya 1.3 x 104 hücre /cm2).
  8. VIC fenotipini, αSMA, CNN veya SM22α gibi immünofloresan belirteçler için pozitif boyama ve CD31, CDH5 veya vWF gibi VEC belirteçleri için negatif boyama ile değerlendirin (Şekil 4, sağ paneller).
    NOT: Burada sunulan protokol iş akışı, VEC'ler ve VIC'lerin izolasyonu için tarafsız bir şekilde bir broşür seçerken, kalan broşürler Von Kossa boyama (Bölüm 5) ve çıtçıtlı dondurma için kullanılır.

8. Uzun süreli hücre depolama

  1. Genişletildikten sonra, uzun süreli depolama için hücreleri dondurun. Hücreleri 2-5 mL DPBS ile iki kez yıkayın, ardından 6.8 ve 7.6. adımlarda olduğu gibi hücreleri ayırmak için yeterli ayrışma reaktifi ekleyin. Eşit hacimde VEC veya VIC büyüme ortamı ekleyerek sindirimi durdurun ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. Bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak canlı hücrelerin sayısını belirleyin.
  3. 5 dakika boyunca 180 x g'de santrifüj.
  4. Soğutulmuş şartlandırılmış büyüme ortamındaki hücreleri ~ 3 × 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğuna geri alın.
  5. Yavaşça dönerek, eşit hacimde soğutulmuş 2x kriyoprezervasyon ortamı ekleyin. Bu, hücre konsantrasyonunu ~ 1.5 × 106 hücre / mL'ye getirecektir.
  6. Aliquot 1 mL kriyoprezervasyon şişelerine. Şişeleri bir hücre dondurma kabına yerleştirin, hücrelerin askıda kalmasını sağlamak için 5-6 kez kapatın ve ters çevirin. Kabı 6-72 saat boyunca -80 ° C'de veya dondurucu kap protokolüne göre yerleştirin. Şişeleri -80 °C'den çıkarın ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokol, insan kapak dokularının taşınması ve bu dokulardan canlı hücre hatlarının izolasyonu ve kurulması için gerekli adımları özetlemektedir. Aort kapağının broşürleri parafin gömülmesi için işlenir, biyokimyasal veya genetik analiz için uzun süreli depolama için dondurulur ve VEC'lerin ve VIC'lerin izolasyonu için sindirilir (Şekil 1). Cerrahi örnekler muhtemelen aort darlığının klinik tanısına sahip olacak ve çıplak gözle görülebilen ...

Tartışmalar

İnsanlardan kontrol ve hastalık dokularının elde edilmesi, in vitro ve ex vivo hastalık modellemesi için kritik öneme sahiptir; Bununla birlikte, sık sık tezgahtan başucuna kadar olan boşluğu kapatmanın zorluklarından bahsedilirken, ters sıra - cerrahi süitten tezgaha gitmek - genellikle bir boşluk kadar göz korkutucu olur. Temel bir bilim insanının birincil insan dokusu örneklerini elde etmesi için gerekli olan, hemşireler, cerrahi teknisyenler, doktor asistanları, tıp öğrencileri ve sakinleri...

Açıklamalar

IS, Atricure ve Medtronic'ten kurumsal araştırma desteği almakta ve Medtronic Vascular için danışman olarak hizmet vermektedir. Bu çatışmaların hiçbiri bu işle ilgili değildir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Jason Dobbins'e bu makalenin anlayışlı tartışması ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi'ne yardım ve destekleri için teşekkür eder, doku bağışçılarına ve ailelerine bu çalışmayı mümkün kıldıkları için teşekkür ederiz. Tüm hasta örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak Pittsburgh Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan çalışmalara kayıtlı kişilerden toplanır. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi (CORE) aracılığıyla elde edilen kadavra dokuları, Pittsburgh Üniversitesi Aldatıcıları İçeren Araştırma ve Klinik Eğitimin Gözetimi Komitesi (CORID) tarafından onaylanmıştır.

Biorender.com ile yaratılan bazı figürler.

CSH, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü K22 HL117917 ve R01 HL142932, Amerikan Kalp Derneği 20IPA35260111 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filterThermo Scientific7211345Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plateGreiner Bio-One664160Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipetFisher14955234VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tipsVWR76322-154Cell culture/cell line expansion
10XL filter tipsVWR76322-132Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubesThermo Scientific339650Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy Sciences15710STissue and cell fixative
190 proof ethanolDecon2801Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesiumGibco14190250Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBSFisherBP2944100Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tipsVWR76322-134Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanolDecon2701Deparaffinizing tissue samples
2-propanolFisherA416P 4Making collagen coated plates
5 mL serological pipetFisher14955233VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubesThermo Scientific339652Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dishGenClone25-260VEC isolation
6-well cell culture plateCorning3516Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacialFisherBP2401 500Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidinInvitrogenA12379Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant SolutionBridge to LifeBUW0011LTissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25gBioworld220700233VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody Abcamab46794Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Cell Signaling3528Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ DynabeadsInvitrogen11155DVEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5Cell Signaling2500Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm poresCorning431751VIC isolation
Collagen 1, rat tail proteinGibcoA1048301Making collagen coated plates
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant SprayDecon4101Disinfection
Countess II Automated Cell CounterInvitrogenA27977Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslipsInvitrogen2026hAutomated cell counter required slide cover
CoverslipsFisher125485EMounting valve samples
Cryogenic vialsOlympus Plastics24-202Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula CloroxN/ADisinfection
DMEMGibco10569044Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500Lonza WalkersvilleCC3129Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL MicroscopeLife TechnologiesModel Number: AME3300Fluorescent imaging
EVOS XL MicroscopeLife TechnologiesAMEX1000Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium SelectR&D SystemsS11550VIC expansion
Fine scissorsFine Science Tools14088-10Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell ScrapersFisher08-100-241VIC expansion
FungizoneGibco15290-026Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
GentamicinGibco15710-064Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slidesGlobe Scientific Inc1358Lmounting valve samples
Goat anti-Mouse 488InvitrogenA11001Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594InvitrogenA11005Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488InvitrogenA11008Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594InvitrogenA11012Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable SlideInvitrogenA25750Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)InvitrogenR37606Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cellsHyClone Laboratories, Inc.SR30002Frozen cell storage
Mounting MediumFisher Chemical PermountSP15-100Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing containerNalgene51000001Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Disinfection
Penicillin-StreptomycinGibco15140163Antibiotic. VIC expansion
PlasmocinInvivogenANTMPTAnti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibodyAbcamab14106Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissorsFine Science Tools14001-14Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swabPuritan25806 10WCVEC isolation
Swingsette human tissue cassetteSimport ScientificM515-2Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)Fine Science Tools11016-17Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061cell counting solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Splitting VIC/VECs
Von Kossa kitPolysciences246331Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibodyAbcamab68545Primary antibody (VEC positive stain)
XylenesFisher ChemicalX3S-4Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibodyAbcamab7817Primary antibody (VIC positive stain)

Referanslar

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır