בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את איסוף המסתמים האאורטליים האנושיים המופקים במהלך הליכים כירורגיים להחלפת מסתם אבי העורקים או מרקמה קדבורית, ואת הבידוד, ההרחבה והאפיון שלאחר מכן של תאי אנדותל ותאי אינטרסטיציאליים ספציפיים למטופל. כלולים פרטים חשובים לגבי התהליכים הדרושים כדי להבטיח את הכדאיות של התא ואת הספציפיות הפנוטיפית.

Abstract

מחלת מסתם אבי העורקים (CAVD) קיימת בכמעט שליש מאוכלוסיית הקשישים. עיבוי, התקשות והסתיידות של מסתם אבי העורקים גורמים להיצרות אבי העורקים ותורמים לאי ספיקת לב ולשבץ. פתוגנזה של מחלות היא רב-גורמית, ולחצים כגון דלקת, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית, זרימה טורבולנטית ולחץ מכני ומתח תורמים להתמיינות אוסטאוגנית של תאי אנדותל ומסתם אינטרסטיציאליים. עם זאת, הגורמים היוזמים המדויקים המניעים את המעבר האוסטיאוגני של תא בריא לתא מסתנן אינם מוגדרים במלואם. יתר על כן, הטיפול הנוכחי היחיד להיצרות אבי העורקים המושרה על ידי CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים, לפיה מסירים את המסתם המקורי (החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי, SAVR) או מוחדר מסתם חלופי הניתן לכיווץ מלא באמצעות קטטר (החלפת מסתם אבי העורקים, TAVR). הליכים כירורגיים אלה באים בעלות גבוהה ועם סיכונים חמורים; לפיכך, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות לגילוי תרופות הוא הכרחי. לשם כך, המחקר הנוכחי מפתח זרימת עבודה שבה רקמות שהוסרו בניתוח מחולים ורקמות של תורמים משמשות ליצירת קווים ראשוניים ספציפיים למטופל של תאים valvular עבור מודלים של מחלות חוץ גופיות. פרוטוקול זה מציג את השימוש בתמיסת אחסון קרה, המשמשת בדרך כלל בהשתלת איברים, כדי להפחית את הנזק הנגרם על ידי זמן הרכש הממושך לעתים קרובות בין כריתת רקמות לעיבוד במעבדה עם היתרון של ייצוב רב של התאים של הרקמה שנכרתה. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי תאי מסתמים מבודדים שומרים על יכולת ההתרבות שלהם ועל פנוטיפים אנדותליאליים ואינטרסטיציאליים בתרבית למעלה מכמה ימים לאחר הסרת המסתם מהתורם. השימוש בחומרים אלה מאפשר איסוף של תאי בקרה ו-CAVD, שמהם נקבעים קווי תאי בקרה וחולי.

Introduction

מחלת מסתם אבי העורקים קלציפית (CAVD) היא פתולוגיה כרונית המאופיינת בדלקת, פיברוזיס ומקרוקלציפיקציה של עלוני מסתם אבי העורקים. שיפוץ מתקדם והסתיידות של העלונים (המכונים טרשת אבי העורקים) עלולים להוביל לחסימת זרימת הדם (היצרות אבי העורקים) התורמת לשבץ מוחי ומובילה לאי ספיקת לב. כיום הטיפול היחיד ב- CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי או טרנסקטטר (SAVR ו- TAVR, בהתאמה). אין אפשרות לא ניתוחית לעצור או להפוך את התקדמות CAVD, וללא החלפת מסתם, שיעורי התמותה מתקרבים ל -50% תוך 2-3 שנים ^1,2,3. הגדרת המנגנונים הבסיסיים המניעים פתולוגיה זו תזהה גישות טיפוליות חדשניות פוטנציאליות.

אצל מבוגר בריא, עלוני שסתום אבי העורקים הם בעובי של כמילימטר אחד, ותפקידם העיקרי הוא לשמור על זרימה חד כיוונית של הדם מתוך החדר השמאלי⁴. כל אחד משלושת העלונים מורכב משכבה של תאי אנדותל (VECs) המרפדת את פני השטח החיצוניים של העלון ומתפקדת כמחסום. VECs שומרים על הומאוסטזיס של המסתם על ידי ויסות החדירות, הידבקות תאי דלקת ואיתות פראקריני ^5,6,7. תאים אינטרסטיציאליים של שסתומים (VICs) מהווים את רוב התאים בתוך עלון המסתם⁸. VICs מסודרים בשלוש שכבות ייחודיות בעלון. שכבות אלה ידועות בשם החדר, הספונגיוזה והפיברוזה⁹. החדר פונה לחדר השמאלי ומכיל סיבי קולגן ואלסטין. השכבה האמצעית, הספונגיוסה, מכילה תוכן פרוטאוגליקני גבוה המספק גמישות גזירה במהלך מחזור הלב. שכבת הפיברוסה החיצונית ממוקמת קרוב למשטח הזרימה בצד אבי העורקים והיא עשירה בקולגן פיברילרי מסוג I ו-III המספקים חוזק לשמירה על קואפטציה במהלך^{דיאסטולה 10,11,12}. עם זאת, תאי VICs חיים במצב שקט, גורמים כגון דלקת, שיפוץ של המטריצה החוץ-תאית (ECM) ולחץ מכני עלולים לשבש את הומאוסטזיס VIC 8,9,13,14,15,16. עם אובדן הומאוסטזיס, תאי גזע וירטואליים מפעילים ורוכשים פנוטיפ דמוי מיופיברובלסט המסוגל להתרבות, התכווצות והפרשה של חלבונים המעצבים מחדש את המיליאו¹⁷ החוץ-תאי. תאי VICs מופעלים יכולים לעבור לתאי סידן המזכירים התמיינות של תא גזע מזנכימלי (MSC) לאוסטאובלסט 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

נראה כי ההסתיידות מתחילה בשכבת הפיברוסה העשירה בקולגן מתרומות של VECs ו-VICs, אך מתרחבת ופולשת לשכבות האחרות של העלון⁸. לפיכך, ברור כי הן VECs והן VICs מגיבים לגירויים כדי לווסת את הביטוי של גנים אוסטאוגניים, עם זאת, האירועים המדויקים המניעים את ההפעלה של גנים אוסטאוגניים, כמו גם את יחסי הגומלין המורכבים בין התאים לבין המטריצה החוץ תאית של העלון, נשארים לא מוגדרים. מודלים של מורין אינם מקור אידיאלי לחקר מניעים לא גנטיים של פתוגנזה של CAVD, מכיוון שעכברים אינם מפתחים CAVD de^{novo 26,27,} ולכן השימוש ברקמות אנושיות ראשוניות ובקווי התאים הראשוניים שבודדו מרקמות אלה הוא הכרחי. בפרט, השגת תאים אלה במספרים גבוהים ובאיכות טובה היא הכרחית, שכן תחום תרביות התאים התלת-ממדיות והמודלים האורגנואידיים מתרחב וצפוי להפוך לחלופה מבוססת אדם ex vivo למודלים של מורין.

מטרת השיטה הנוכחית היא לשתף זרימת עבודה שקבעה את התנאים לבידוד יעיל ולגידול VECs ו- VICs המתקבלים משסתומים שהוסרו בניתוח מתורמים אנושיים. מחקרים קודמים הראו בידוד מוצלח של VECs ו- VICs משסתומי חזיר²⁸ ומורין²⁹, למיטב ידיעתנו זהו הראשון המתאר את הבידוד של תאים אלה ברקמות אנושיות. הפרוטוקול המתואר כאן ישים על שסתומים שנכרתו על ידי בני אדם ועוקף ומשפר מאוד את הנזק הנגרם על ידי זמן הרכש הממושך לעתים קרובות בין כריתת רקמות לעיבוד במעבדה על ידי החדרת שימוש בתמיסת אחסון קרה, תמיסת מאגר המשמשת קלינית בהשתלות איברים המייצבת מאוד את תאי הרקמה שנכרתה. הפרוטוקול המתואר כאן מראה גם כיצד לקבוע פנוטיפ של תאים ולהבטיח יעילות גבוהה של הישרדות התא עם זיהום צולב מינימלי של התא.

Protocol

כל דגימות המטופלים נאספות מאנשים שנרשמו למחקרים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פיטסבורג בהתאם להצהרת הלסינקי. רקמות קדבוריות שהושגו באמצעות המרכז להתאוששות איברים וחינוך (CORE) אושרו על ידי הוועדה לפיקוח על מחקר והכשרה קלינית של אוניברסיטת פיטסבורג המערבת נפטרים (CORID).

1. אישור ובטיחות

1. קבל אישור של מועצת הביקורת המוסדית (IRB) או תזכיר פטור לכל אוסף של דגימות מטופלים או רקמות קדבוריות בהתאם להצהרת הלסינקי.
2. קח הכשרה מוסדית נדרשת כדי לעבוד עם רקמות אנושיות כגון אימון פתוגנים הנישאים בדם, מחקר ביו-רפואי בנושאים אנושיים, פרטיות ואבטחת מידע, והובלה ומשלוח של חומרים ביולוגיים.

2. לוגיסטיקה והכנה

1. דגימות כירורגיות
   1. ודאו כי מקרר זמין וממוקם בסמוך לחדר הניתוח. שמור 50 מ"ל צינורות חרוטיים מסומנים מראש עם מינוח לא מזוהה המכיל 40 מ"ל של aliquots סטרילי של תמיסת אחסון קר במקרר זה לשימוש על ידי צוות כירורגי. צינורות אלה יציבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד תאריך התפוגה באריזה המקורית.
   2. עם החילוץ, מניחים רקמת שסתום בצינורות אלה. הניחו את הצינורות במיכל משני אטום כגון שקית ניילון חסינת דליפות או מיכל פלסטיק המסומן בתווית biohazard. רקמות נאספות ומועברות על קרח על פי פרוטוקולים מוסדיים להובלת ביו-האזרדים.
2. דוגמאות קדבוריות
   1. לטבול איברים משוחזרים בתמיסת אחסון קרה, להניח בכלי בלימה משני אטום, ולהוביל על קרח על פי פרוטוקולים מוסדיים להובלת biohazards.

3. הכנת ריאגנטים

1. הכינו צלחות מצופות קולגן לפחות יום קודם לכן.
   1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, יש לערבב 5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל, 8.7 מ"ל של חומצה אצטית ו-0.5 מיקרוגרם של אבקת קולגן I. הביאו עד 50 מ"ל עם מים סטריליים. מערבבים ומסננים דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
   2. מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, הוסיפו מספיק תמיסת קולגן ל-6 צלחות באר וכלים בגודל 10 ס"מ כדי לכסות את כל החלק התחתון. מכסים את הצלחת ומשהים 4-6 שעות בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה העודפת עם פיפטה סטרילית, הנח בצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל, וחסוך ב -4 מעלות צלזיוס כדי ליצור צלחות נוספות. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 °C במשך מספר חודשים.
   3. ייבשו את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן אחסנו אותן בשקית הניתנת לסגירה חוזרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן צלחות וכלים מצופים קולגן במשך מספר חודשים.
2. Autoclave את הפריטים הבאים: מלקחיים רקמות, מספריים רקמות, צמר גפן רפידות גזה.
3. מדיית גידול VEC: הכן והשתמש במדיום צמיחת תאי אנדותל בהתאם לפרוטוקולי היצרן. יש לאחסן בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש בתאים, אין להשאיר את המדיה באמבט החימום זמן רב מהנדרש (10-15 דקות מספיקות). יש להשתמש במדיה תוך חודש מיום ההכנה.
4. מדיית גידול VIC: תוסף DMEM בסיס בינוני (4.5 גרם/ל' גלוקוז, תוסף L-גלוטמין, 110 מ"ג/ל' נתרן פירובט)³⁰ עם 10% FBS מומת בחום ו-100 I.U./מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש בתאים, אין להשאיר את המדיה באמבט החימום זמן רב מהנדרש (10-15 דקות מספיקות).
5. הכינו תמיסת שטיפה סטרילית ממש לפני השימוש. תוסף PBS סטרילי עם קוטל פטריות 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין וקוטל חיידקים 5 מיקרוגרם/מ"ל.
6. הכינו תמיסת קולגן סטרילית ממש לפני השימוש. יש להוסיף 5 מ"ג של קולגןאז II ל-5 מ"ל של מדיום בסיס DMEM סטרילי טרי. מערבבים היטב ומעקרים את התמיסה על ידי מעבר דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. יש לשמור על הקרח עד לשימוש.

4. הכנת רקמות ועיבודן

הערה: יש לקבל אישור מוסדי לשימוש ברקמות אנושיות לפני תחילת העבודה. בעת הטיפול ברקמות, יש ללבוש את ציוד המגן האישי (PPE) הבא: חלוק מעטפת מחסום נוזלי חד פעמי, או מעיל מעבדה קדמי ייעודי עם מחסום נוזלי שעוטף סינר ושרוולים חד פעמיים; מגן פנים מלא, או משקפי בטיחות עם מסכה כירורגית; כפפות כפולות; נעליים סגורות; ובגדים לכיסוי הרגליים. דיאגרמות זרימת עבודה מקיפות של הכנת הרקמה להערכת הסתיידות (סעיף 5) ובידוד תאים (סעיפים 6 ו-7) מתוארות באיור 1A,B בהתאמה.

1. עם קבלת דגימת איברים קדבורית, מוציאים את שורש אבי העורקים ושוקעים בצינור חרוטי של 50 מ"ל של תמיסת שטיפה סטרילית. עם קבלת דגימה כירורגית, להסיר מכלי הובלה לטבול בצינור חרוטי 50 מ"ל של תמיסת שטיפה סטרילית. מניחים את הצינור המכיל את הרקמה בדלי קרח על נדנדה ומערבבים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: עיבוד רקמות קרוב ככל האפשר לזמן המיצוי יניב את התאוששות התאים הטובה ביותר, אולם ניתן לאסוף תאים בני קיימא למעלה מ-61 שעות לאחר הכריתה, והנתונים מראים כי תאי VICs חזקים יותר מ-VECs ככל שהזמן גדל. אם לא ניתן לעבד רקמות באופן מיידי, במידת האפשר, הסר רקמה, בצע את שלב 4.1, ולאחר מכן החזיר את הרקמה לתמיסת אחסון קרה סטרילית טרייה ושמור על 4 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה להמשך. שסתומים שנאספו במהלך ניתוחים בלילה או בסוף השבוע יכולים להיות מאוחסנים בתמיסת אחסון קר של 40 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ועדיין מסוגלים להניב תאים בני קיימא יותר מיומיים לאחר השאיבה.
2. יש לרסס צינורות ב-70% אתנול ולעבור למכסה מנוע סטרילי. הסר רקמה וכרת שני עלוני שסתום (איור 2A). מניחים עלון אחד בבקבוקון קריוגני (או 2-3 בקבוקונים אם יש צורך בכמה חתיכות קטנות יותר לניתוח עתידי) ומצמידים את ההקפאה על ידי הטלת חנקן נוזלי ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   1. אם השסתום הוא bicuspid, הבלו רק עלון אחד. באמצעות מספריים, לחתוך את העלון לשניים מן הגולם אל הציר. השתמש במחצית אחת של העלון להקפאת הצמדה ובחצי השני לשלב 4.3.
3. לעבד את העלון השני להטמעת פרפין כדי להעריך את תכולת ההסתיידות על ידי חיתוך אותו לשניים מגולם לציר. מניחים את שני החלקים בקלטת השקועה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA), ואז מניחים על נדנדה ב-RT למשך שעתיים לפחות, אך לא יותר מ-4 שעות.
   הערה: זמני קיבוע ארוכים יותר יוצרים רקע רב יותר עם צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר ביצוע שלבים 4.2 ו- 4.3, עבור מיד לסעיף 6 וחזור לשלב 4.4 לאחר שלב 6.12.
4. לאחר הקיבוע, לשטוף את הרקמות על ידי טבילה PBS טרי במשך 1 שעה 3-4 פעמים. לאחר שטיפות אלה, דגימות יכולות להישאר PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים במידת הצורך. המשך לשלב הבא רגע לפני ההטמעה.
5. שנה בהדרגה מ- PBS ל- 70% אתנול. לשטוף 30-60 דקות כל שלב עם 1:4 70% אתנול: PBS; 1:1 70% אתנול:PBS, 4:1 70% אתנול:PBS; 70% אתנול.
6. הטמע את הרקמה כך שהמקטעים יחשפו את שלוש השכבות של העלון (איור 1A) על פי פרוטוקולים קבועים³¹. לחלופין, ואם זמין, להביא את הרקמה לליבה פתולוגית להטמעה וחיתוך.
7. לאחר הטיפול ברקמות, יש להשליך או לאחסן PPE לפי הצורך ולשטוף ידיים באופן מיידי. נטרל את כל הציוד, המשטחים והפסולת המוצקה והנוזלית באמצעות דילול של 1:10 של חומר חיטוי אקונומיקה או חומר ניקוי. יש להמתין 20 דקות לפירוק, ולאחר מכן לשטוף ב-70% אתנול. טפלו במכסה המנוע של תרבית התאים באמצעות תרסיס מיקופלסמה בהתאם להוראות היצרן.

5. מכתים את פון קוסה לתכולת הסידן

הערה: ניתן לעשות זאת זמן רב לאחר בידוד התא והקמת הקו, אך הקפידו לקשר את רמת ההסתיידות של הרקמה למסמכים הנוגעים לקו התא הראשוני שנקבע.

1. חותכים פרוסות פרפין בעובי 5 או 10 מיקרומטר על מגלשות זכוכית ואופים מגלשות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז מצננים ל-RT.
2. באמצעות פתרונות טריים, deparaffinize שקופיות על ידי טבילה כדלקמן: 100% xylene במשך 30 דקות, 2x; 100% אתנול במשך 3 דקות, 2x; 90% אתנול במשך 3 דקות; 80% אתנול במשך 3 דקות; 70% אתנול למשך 3 דקות; 50% אתנול במשך 3 דקות; מים טהורים במיוחד במשך 3 דקות; יש לשמור במים טהורים במיוחד עד לשלבים הבאים.
   הערה: הזמנים לעיל הם מינימליים, כל שלב עשוי להימשך זמן רב יותר.
3. המשך עם צביעת פון קוסה על פי פרוטוקולי היצרן.
4. הערך את אזור המסתם המלא באופן מיקרוסקופי והקצה רקמת בקרה (ללא סימן להסתיידות) או CAVD (כל עדות להסתיידות, איור 2B).

6. בידוד, הרחבה ואישור של תאי אנדותל מסתם (VEC)

1. במכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, פתחו את הצינור החרוטי המכיל את עלון המסתם שנותר והניחו את העלון בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל מלא ב-PBS קר כקרח. מכסים את הצינור והופכים בעדינות או מניחים על נדנדה למשך 2 דקות ב-RT.
2. הסר רקמות לצלחת בקוטר 60 מ"מ מלאה ב-5-7 מ"ל של תמיסת קולגן קרה. באמצעות מלקחיים, לטבול את שני הצדדים של העלון בתמיסה 3-4 פעמים. לדגור את הרקמה במשך 5-10 דקות באינקובטור תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס, נדנדה את הרקמה בעדינות כל 2 דקות 3-4 פעמים.
3. הסר 2 מ"ל של הפתרון מן המנה ומניחים צינור סטרילי 15 מ"ל חרוטי. הניחו מלקחיים על הגולם והשתמשו במקלון צמר גפן סטרילי יבש כדי להחליק מהמלקחיים אל הציר, תוך כדי סיבוב מקלון תוך כדי העברתו לאורך העלון. בין כל החלקה, סובבו את המטוש בתמיסה בצינור החרוטי של 15 מ"ל כדי להסיר את התאים. חזרו על הפעולה כדי לטבול את פני השטח של הרקמה במלואם, ואז התהפכו וחזרו על הפעולה בצד השני.
4. מחזיק את עלון השסתום עם מלקחיים ביד אחת, ו 1 מ"ל פיפטה ביד השנייה, לשטוף את פני השטח של העלון עם הפתרון בצלחת. לאחר השטיפה, מעבירים את כל התמיסה המכילה את ה- VECs בצלחת לאותה צינור חרוטי של 15 מ"ל עם התאים מהמטוש וממשיכים לשלב 6.5. מניחים את רקמת המסתם הנותרת בצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל עם 7 מ"ל של תמיסת קולגן סטרילית וממשיכים לשלב 7.1.
5. צנטריפוגה הצינור המכיל את VECs ב 180 x גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את VECs מבודדים. שאפו את הסופר-נאטנט והשעו ב-3 מ"ל של מדיית הצמיחה של VEC. צנטריפוגה פעם נוספת ולהסיר את supernatant. יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של מדיית גדילה ולקבוע את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול.
6. יש להשעות את גלולת ה-VEC ב-2 מ"ל של מדיית גדילה של VEC ולצלחת את התאים בבאר מצופה קולגן מראש של צלחת 6 בארות בערך 5 x 10^{תאים לס} "מ². תן לתאים לגדול לפחות 3-4 ימים, ולאחר מכן להסיר מדיה לחדש עם מדיה טרייה. יש לחזור על שינוי המדיה כל 4 ימים. VECs יגדלו בכתמים בצורת אבן מרוצפת (איור 3B, לוחות שמאליים).
7. כאשר מדבקות VEC מכסות >80% מהצלחת, יש לפצל תאים בערך ב-1.3 x^{10 4 תאים} לס"מ 2, תלוי כמה מהר הם גדלים (אם הם מגיעים ל-80% תוך פחות משבוע אחד מפוצלים במספר מעט נמוך יותר של תאים/ס"מ ²).
8. כדי לפצל, שטפו תאים פעמיים עם 2 מ"ל DPBS ואז הוסיפו מספיק מגיב דיסוציאציה כדי לכסות רק את פני השטח של התאים. דגירה במשך 2-3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בדיקה כדי לוודא שהתאים אינם דוגרים יתר על המידה. עצור את העיכול על ידי הוספת נפח שווה של מדיית גידול VEC והעברת נוזל לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות, להסיר supernatant, ו ressuped בנפח המתאים של מדיה עבור מספר בארות / לוחות הדרושים.
   הערה: לאחר שהורחבו לצלחת 10 ס"מ VECs עשויים לפעמים לאבד את המורפולוגיה שלהם ולשנות את הפנוטיפ שלהם ככל שהם מתרבים. זה נוטה להתרחש כאשר VECs נזרעים במפגש נמוך במהלך הקמה והרחבה של קו התא.
9. כדי להבטיח תרבות טהורה, שקול להשתמש בחרוזים סופר-פאראמגנטיים של CD31+ עם כל פיצול.
10. עבור 1 x 10 8 תאים או פחות (צלחת אחת של 10 ס"^{מ או פחות} ), הכינו 25 μL של חרוזים סופר-פאראמגנטיים על ידי שטיפה על פי פרוטוקולי היצרן.
    הערה: שלב 6.10 מומלץ לביצוע לפני טריפסיניזציה של VECs.
11. נתקו תאים כמו בשלב 6.8 אך הושתקו ב-500 μL של PBS עם 0.1% BSA, pH 7.4, והניחו בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל. הוסף 500 μL של חרוזים שטופים ומחיים לצינור 2 מ"ל של תאים ודגירה על סיבוב במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
12. מניחים צינורות על המגנט למשך 2 דקות. בזמן שהצינור עדיין במגנט, הסר בזהירות את הסופרנטנט. הסירו את השפופרת מהמגנט, הוסיפו 1 מ"ל PBS טרי עם 0.1% BSA, פיפטה בעדינות 2-3 פעמים, ואז הניחו בחזרה על המגנט למשך 2 דקות. חזור על 2 פעמים נוספות. לאחר הסרה סופית של חיץ, יש לתלות מחדש תאים במדיית גדילה בנפח הדרוש לציפוי מחדש.
    הערה: לתאים עדיין יהיו חרוזים, אך אלה לא ישפיעו על הצמיחה ויוסרו במעברים הבאים.
13. לאחר הרחבת התאים, בנוסף למורפולוגיה, אשרו את הפנוטיפ של VEC על-ידי צביעה חיובית עבור סמנים אימונופלואורסצנטיים כגון גורם פון וילברנד (vWF), קדהרין 5 (CDH5) או PECAM-1/CD31, והכתמה שלילית עבור סמני VIC כגון קלפונין 1 (CNN) או אקטין שריר חלק אלפא-2 (αSMA, איור 4, לוחות שמאליים).

7. בידוד, הרחבה ואחסון של תאים אינטרסטיציאליים של שסתום (VIC)

1. כאמור בשלב 6.4, לאחר הסרת VECs מרקמת השסתום, העלון ממוקם בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם תמיסת קולגן של 7 מ"ל. דגירה במשך 12 שעות באינקובטור תרבית התאים עם המכסה פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גזים. בידוד מוצלח של VICs עדיין יכול להתרחש עם עד 18 שעות בתמיסת קולגן.
2. לאחר הדגירה, במכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, מערבבים את הרקמה בעדינות על ידי פיפטינג עם פיפטה סרולוגית כדי להבטיח שחרור של VICs מרקמת העלון.
3. הסר את תרחיף התאים ועבור דרך מסנן 0.70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
4. הוסף 7 מ"ל של מדיום גידול VIC לצינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות. לשאוף supernatant ו resuping גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיה צמיחה VIC ולקבוע את מספר התא. צלחת את ה- VICs בצלחת 60 מ"מ תרבית רקמה מטופלת ב 1.3 x 10^{4 תאים} / ס"מ².
5. תנו לתאים לגדול לפחות 1-2 ימים לפני החלפת המדיה. יש להסיר את חומרי ההדפסה ולשטוף פעמיים DPBS כדי להסיר שאריות לכלוך ולהחליף במדיום צמיחה טרי. יש לחדש את המלאי הבינוני כל 2-3 ימים. תרכובות אורגניות וירטואליות יגדלו בצורת פיברובלסט (איור 3B, לוחות ימניים).
6. כאשר VICs מגיעים למפגש של >90%, יש לשטוף פעמיים עם DPBS כדי להסיר את המדיה העודפת ולנתק את התאים על ידי הוספת נפח מתאים של מגיב דיסוציאציה מחומם מראש כדי לכסות את הצלחת (כלומר, 2-3 מ"ל לכל צלחת של 10 ס"מ). דגירה של המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס. VICs יתנתקו מהמנה לאחר 2-3 דקות של דגירה. הוסף 4-6 מ"ל של מדיה מחוממת מראש.
   הערה: אם לתאים לוקח יותר מ-3 דקות להתרומם מהצלחת, ייתכן שמגיב הדיסוציאציה איבד מעוצמתו. במידת הצורך, ניתן להשתמש במגרד תאים כדי להרים את התאים בעדינות.
7. העבר את מתלה התא לצינור וצנטריפוגה עדינה בגודל 180 x g למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לתלות בעדינות את גלולת התא במדיית גידול VIC שחוממה מראש ולקבוע את מספר התאים בני הקיימא באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. זרעו את התאים בני הקיימא בצפיפות של 1:2 של המנה המקורית (כלומר, ~ 1 × 10⁶ תאים לכל צלחת של 10 ס"מ או 1.3 x 10^{4 תאים} / ס"מ²).
8. הערך את פנוטיפ VIC על-ידי צביעה חיובית עבור סמנים אימונופלואורסצנטיים כגון αSMA, CNN או SM22α וצביעה שלילית עבור סמני VEC כגון CD31, CDH5 או vWF (איור 4, לוחות ימניים).
   הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול המוצג כאן בוחר ללא משוא פנים עלון אחד לבידוד VECs ו- VICs, בעוד העלונים הנותרים משמשים לצביעת פון קוסה (סעיף 5) והקפאת הצמדה.

8. אחסון תאים לטווח ארוך

1. לאחר ההרחבה, הקפיאו את התאים לאחסון לטווח ארוך. שטפו תאים פעמיים עם DPBS של 2-5 מ"ל ולאחר מכן הוסיפו מספיק מגיב דיסוציאציה כדי לנתק תאים כמו בשלבים 6.8 ו-7.6. עצור את העיכול על-ידי הוספת נפח שווה של מדיית גידול VEC או VIC והעברת תרחיף התאים לצינור של 15 מ"ל.
2. לקבוע את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer ו טריפן כחול.
3. צנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
4. יש לתלות תאים במדיית גדילה מותנית מקוררת לצפיפות תאים של ~ 3 × 10⁶ תאים למ"ל.
5. בעדינות עם מערבולת, הוסיפו נפח שווה של מדיום קירור 2x לשימור בהקפאה. זה יביא את ריכוז התאים ל ~ 1.5 × 10⁶ תאים / מ"ל.
6. Aliquot 1 מ"ל לתוך בקבוקונים שימור בהקפאה. הניחו את הבקבוקונים במיכל להקפאת תאים, סגרו והפכו 5-6 פעמים כדי להבטיח שהתאים יישארו תלויים. יש להניח את המיכל בטמפרטורה של -80°C למשך 6-72 שעות או בהתאם לפרוטוקול מיכל הקפאה. הסר בקבוקונים מ -80 מעלות צלזיוס והעבר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

תוצאות

הפרוטוקול הנ"ל מתאר את השלבים הדרושים לטיפול ברקמות שסתום אנושיות ולבידוד והקמת קווי תאים בני קיימא מרקמות אלה. עלונים של מסתם אבי העורקים מעובדים להטמעת פרפין, מוקפאים לאחסון לטווח ארוך לצורך ניתוח ביוכימי או גנטי ומתעכלים לבידוד של VECs ו-VICs (איור 1). בעוד שלדגימות כירורגיו...

Discussion

השגת שליטה ורקמות מחלה מבני אדם היא קריטית עבור מודלים של מחלות in vitro ו- ex vivo; עם זאת, בעוד שלעתים קרובות מדברים על האתגרים של גישור על הפער בין ספסל למיטה, הסדר ההפוך - מעבר מסוויטת הניתוחים לספסל - הוא לעתים קרובות לא פחות מרתיע. חיוני עבור מדען בסיסי כדי להשיג דגימות רקמות אנושיות ראשוניות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Thermo Scientific	7211345	Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate	Greiner Bio-One	664160	Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet	Fisher	14955234	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips	VWR	76322-154	Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips	VWR	76322-132	Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339650	Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710S	Tissue and cell fixative
190 proof ethanol	Decon	2801	Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium	Gibco	14190250	Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS	Fisher	BP2944100	Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips	VWR	76322-134	Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol	Decon	2701	Deparaffinizing tissue samples
2-propanol	Fisher	A416P 4	Making collagen coated plates
5 mL serological pipet	Fisher	14955233	VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish	GenClone	25-260	VEC isolation
6-well cell culture plate	Corning	3516	Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial	Fisher	BP2401 500	Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g	Bioworld	220700233	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody	Abcam	ab46794	Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Cell Signaling	3528	Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5	Cell Signaling	2500	Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores	Corning	431751	VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein	Gibco	A1048301	Making collagen coated plates
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray	Decon	4101	Disinfection
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	A27977	Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips	Invitrogen	2026h	Automated cell counter required slide cover
Coverslips	Fisher	125485E	Mounting valve samples
Cryogenic vials	Olympus Plastics	24-202	Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula	Clorox	N/A	Disinfection
DMEM	Gibco	10569044	Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500	Lonza Walkersville	CC3129	Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Model Number: AME3300	Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D Systems	S11550	VIC expansion
Fine scissors	Fine Science Tools	14088-10	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	VIC expansion
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides	Globe Scientific Inc	1358L	mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488	Invitrogen	A11001	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594	Invitrogen	A11005	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594	Invitrogen	A11012	Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide	Invitrogen	A25750	Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Frozen cell storage
Mounting Medium	Fisher Chemical Permount	SP15-100	Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container	Nalgene	51000001	Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Disinfection
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody	Abcam	ab14106	Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors	Fine Science Tools	14001-14	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab	Puritan	25806 10WC	VEC isolation
Swingsette human tissue cassette	Simport Scientific	M515-2	Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061	cell counting solution
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit	Polysciences	246331	Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody	Abcam	ab68545	Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes	Fisher Chemical	X3S-4	Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody	Abcam	ab7817	Primary antibody (VIC positive stain)