使用 D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光直接检测组织中的异左旋蛋白

摘要

本文提供了使用碱性磷酸酶偶联的 ScFv D11 抗体通过免疫荧光测量组织中异左旋前列腺素的详细方法。小鼠和人类的高血压模型用于解释与组织样本中异左旋蛋白测量相关的分步程序和基本原理。

摘要

异左旋前列腺素（IsoLGs）是由H2-异前列烷通过脂质过氧化和交联蛋白形成的高反应性γ酮醛，导致炎症和包括高血压在内的各种疾病。检测组织中的IsoLG积累对于揭示它们参与疾病过程至关重要。然而，组织中IsoLGs的测量非常困难，目前可用的工具，包括质谱分析，既费力又极其昂贵。在这里，我们描述了一种使用碱性磷酸酶偶联的D11 ScFv和通过免疫荧光显微镜在大肠杆菌中产生的重组噬菌体展示抗体原位检测组织中IsoLGs的新方法。四种对照用于验证染色:（1）使用和不使用D11染色，（2）用碱性磷酸酶接头用细菌周质提取物染色，（3）无关的scFV抗体染色，以及（4）染色前与IsoLG竞争性对照。我们证明了碱性磷酸酶偶联D11在有或没有高血压的人和小鼠组织中的有效性。这种方法可能会成为研究IsoLGs在各种疾病过程中的作用的重要工具。

引言

异左旋前列腺素（IsoLGs），也称为异酮醇，是4-酮醛家族的异构体，是脂质过氧化的产物，与蛋白质^1，2上的伯胺反应并加合。IsoLGs与多种疾病有关，包括心血管，阿尔茨海默氏症，肺部和肝脏疾病以及许多类型的癌症³。IsoLGs在对心血管疾病（CVD）的贡献方面得到了最广泛的研究，心血管疾病是包括美国在内的全球重大健康和经济负担。据估计，9210 万美国成年人至少患有一种类型的心血管疾病，预计 2030 年将达到美国成年人口的 43.9%⁴。降低血压、胆固醇和戒烟可降低心血管疾病事件的总体风险和发生率⁵.

高血压是心血管疾病的主要危险因素，影响大约一半的美国人口⁶。以前的研究发现，炎症是高血压的根本原因，IsoLGs发挥作用⁷。高血压刺激，包括血管紧张素 II、儿茶酚胺、醛固酮和过量膳食盐，诱导 IsoLG 在包括树突状细胞 （DC） 在内的抗原呈递细胞中积累，进而激活 T 细胞增殖并产生导致高血压的炎性细胞因子^8，9。

以前，IsoLGs 已通过免疫组织化学、质谱、酶联免疫吸附测定和流式细胞术^10，11 进行测量。为了便于测量IsoLGs，开发了一种针对IsoLGs12的单链片段变量（scfv）重组抗体（^D11）。最初，该 D11 抗体含有 11 个氨基酸 E-tag，需要二抗进行免疫组织化学检测¹¹。然而，在制造商停止生产E-tag后，很难找到可靠的针对E-tag的二抗。因此，我们开发了一种可靠的方案，用于使用与碱性磷酸酶（D11-AP）偶联的D11对IsoLGs进行免疫荧光染色，我们已经在有和没有高血压的小鼠和人体组织中证明了这一点。

研究方案

范德比尔特大学的机构动物护理和使用委员会批准了本手稿中描述的所有程序。根据《实验动物护理和使用指南》饲养和照顾小鼠。所有受试者在参加研究之前都给予了书面知情同意，并得到了范德堡大学机构审查委员会的批准。所有程序均按照《赫尔辛基宣言》执行。

1. 编码D11碱性磷酸酶融合蛋白和阴性对照载体的质粒的制备

1. 构建pCANTAB5E质粒¹³，¹⁴的修改版本^，其中单链片段变量（scFv）片段在其3'端连接到编码细菌碱性磷酸酶（AP）的序列。
   注意:在scFv序列的NotI限制性位点的下游，修饰的质粒不再包含E标签的编码序列，而是编码接头序列GGSGGHMGSGG，然后编码AP序列（GenBank入藏号AXY87039.1，T16-K464）^15，16。在AP的下游，质粒将编码8xHis和DYKDDDDK标签。在标签的 3' 端，编码序列以琥珀色终止密码子结束。修饰的质粒称为pCANTAB5-AP。
2. 将D11 scFv（GenBank入藏号AAW28931.1）克隆到具有SfiI/NotI限制位点的pCANTAB5-AP中。
3. 将D20 scFv克隆到具有SfiI/NotI限制位点的pCANTAB5-AP中。
   注意:D20 scFv是一种阴性对照，旨在评估不相关的scFv的组织相互作用模式。该scFv最初是由噬菌体展示选择的，因为它能够与称为A2的聚糖基团相互作用。
4. 通过从质粒中完全去除scFv部分并将其替换为由氨基酸GGGGSGRAGSGGGGS组成的"AP接头"编码序列来生成"空"载体。
5. 将所有质粒转化为感受态TG1 大肠杆菌 ，并在含有2xYT的0.5%琼脂平板上在30°C下培养细菌过夜，补充有100μg/ mL氨苄西林和2%葡萄糖（2xYTAG）培养基。
   注意:具有supE基因（例如TG1大 肠杆菌）的菌株不会100%抑制琥珀色终止密码子。估计在0.8-20%的时间内，因此仍然有很多产品终止于BAP的下游，因为它旨在用于这些实验¹⁷。TG1 大肠杆菌 主要用于实际原因，例如减少时间和成本，与pCANTAB蛋白表达系统的兼容性以及它们在噬菌体展示中的使用，这通常在实验室中进行。BAP之后的琥珀色终止密码子的下游是基因III的序列。GeneIII融合蛋白很少需要表达才能使噬菌体展示按预期发挥作用，因为scFv-geneIII融合蛋白会干扰该特定的geneIII蛋白以重新感染幼稚细菌。因此，在病毒粒子组装过程中需要存在无融合的geneIII蛋白以产生功能性噬菌体，即scFv-geneIII蛋白产物通常在细菌内相对罕见。D11-AP、D20-AP、空载体和本文中使用的所有构建体都受到偶尔的geneIII融合蛋白表达的类似影响。在这些蛋白质的行为方式上仍然存在观察到的差异。
6. 挑选单个菌落并接种新鲜的 5 mL 2xYTAG 培养物。让细菌在30°C下生长过夜，并以150rpm振荡。
7. 通过在室温下以3，000× g 离心10分钟来沉淀细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于2mL的85%2xYTAG和15%甘油中。
8. 将甘油储备液保存在-80°C冰箱中。

2. 蛋白表达与周质提取物的产生

注意:周质提取物的生成是噬菌体展示中蛋白质表达的常用方法，主要是因为二硫键的形成在scFv和抗体生成中很重要。该方法避免了生成裂解物（通常含有包涵体）的需要，并确保蛋白质正确折叠。pCANTAB在D11-BAP融合蛋白的scFv部分上游具有gIII信号序列。信号序列确保蛋白质穿梭到细菌的周质空间，然后切割信号序列。周质空间提供氧化环境，这对于二硫键的正确形成至关重要。渗透休克用于获得周质提取物，因为它破坏外膜足以将周质蛋白释放到周围培养基中，同时保持细菌完整。

1. 将含有相关质粒的TG1 大肠杆菌 甘油储备液接种到60mL的2xYTAG培养物中，并在30°C下以150rpm振荡培养过夜。
2. 为了诱导蛋白质表达，以3，000× g 沉淀细菌培养物10分钟，重悬于60mL的2xYTA培养基中，并在30°C下以150rpm振荡培养过夜。
   注意:从2xTYAG切换到2xYTA培养基有助于充分诱导蛋白表达¹⁸。当葡萄糖存在于细菌培养基中时，lac启动子受到抑制，因为细菌优先消耗葡萄糖而忽略乳糖，因为葡萄糖需要更少的能量来处理。当在培养基转换后去除葡萄糖时，细菌依赖于2xYT培养基提供的碳水化合物。酵母提取物（2xYT中的Y组分）含有碳水化合物，其中包括乳糖，因此能够通过紫胶启动子驱动蛋白质表达。pCANTAB构建体不需要IPTG，并且可能导致蛋白质表达过多，以及导致非功能性蛋白质的包涵体。
3. 通过渗透休克生成周质提取物。
   1. 以3，000× g 沉淀细菌培养物10分钟。
   2. 重悬于20mL的1xTES（0.2M Tris-HCl pH 8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖）中，并在冰上孵育1小时。
   3. 再次以 3，000 x g 沉淀 10 分钟，并重悬于 15 mL 的 0.05 M Tris，pH 7.6 中。
4. 将该悬浮液在冰上孵育1小时，然后以5，000× g 离心澄清10分钟。
5. 将上清液转移到新管中并储存在-20°C，直到需要纯化或直接用于实验。
6. 通过ELISA中活性D11-BAP的存在来评估细胞裂解。将 3-5 μL 周质提取物加入 1 mL pNPP 中，然后观察在接下来的 10 分钟内是否发生颜色变化（颜色从透明黄色变为浓黄色）。
   注意:颜色可以与未接受任何裂解物的pNPP管或接受幼稚TG1细菌裂解物的pNPP管并排比较。在405nm处用吸光度定量。

4. 酶联免疫吸附中D11-AP滴度的表征

1. 将 384 孔聚苯乙烯板在 4 °C 下涂覆过夜，用含有 5 μg/mL 小鼠血清白蛋白 （MSA）（阴性对照）或 5 μg/mL IsoLG/MSA（阳性对照）的 25 μL/孔磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（1.8 mM KH 2 PO 4、10 mM Na 2 HPO₄、_2.7mM KCl、137 mM NaCl）。
2. 清空盘子并点击干燥。用PBS + 0.1%吐温（PBS-T）清洗一次。清空盘子并点击干燥。
3. 用PBS-T作为封闭缓冲液（120μL/孔）填充板。在室温下孵育1小时。
4. 清空盘子并点击干燥。以 25 μL/孔的速度连续 1:2 稀释 D11-AP 周质提取物，并在 PBS-T 中稀释。包括一个仅含有PBS-T的孔作为阴性对照。
   注意:周质提取物的典型稀释范围为1:8 - 1:4096。对于 25 μL 的测定体积，从 50 μL 起始"1:8"浓度开始:6.25 μL 周质提取物和 43.75 μL PBS-T。然后，通过去除 25 μL 该溶液并将其添加到含有 25 μL PBS-T 的下一个孔中并上下移液来进行 2 倍稀释。该井现在包含"1:16"稀释度。继续重复2倍稀释以产生所述的1:2稀释系列。
5. 在室温下孵育1.5小时。
6. 清空盘子并点击干燥。用PBS-T清洗5次。清空并点击干燥。
7. 通过将 1 g pNPP 溶解在 1 L 930 mM 二乙醇胺（98% 储备溶液在 H 2 O 中以 1:10 稀释）中，用 0.5 mM MgCl₂并用 HCl 调节至 pH 9.5 来制备 pNPP 溶液。
8. 应用 25 μL/孔 pNPP 溶液以开发 AP。 在室温下孵育 1 小时，并使用兼容的酶标仪测定每个孔内 405 nm 处的吸光度。
9. 将 IsoLG/MSA 孔产生的信号与 MSA 孔产生的噪声进行比较，并找到信号至少比噪声高 5 倍的稀释范围。
10. 在图表上绘制此D11-AP信号稀释系列，确定曲线的线性范围，并建立可以观察到50%信号的稀释度。
    注意:如果此稀释度相当于大约 1:1，000，则可以在 IHC/IF 中以 1:10 的浓度使用 D11-AP 溶液。

5. 免疫荧光

1. 使用切片机切割小鼠和人石蜡包埋组织（5μm厚）的连续切片，并置于温水浴（37°C）中。将组织切片安装在载玻片上，干燥过夜。
   注意:对于这项研究，主动脉是从小鼠获得的。正常血压和高血压人类的结肠切片是从范德比尔特合作人体组织网络获得的。
2. 将载玻片浸入二甲苯中三次5分钟以使组织脱蜡。
3. 在H 2 O中分别洗涤95%，70%和50%乙醇的₂次洗涤组织。
4. 用 0.1% 吐温 （TBST） 的 Tris 缓冲盐水 （TBS） 洗涤载玻片 3 次，快速洗涤，方法是在载玻片支架上填充 TBST，然后丢弃 TBST。
   注意:水合载玻片可以在抗原修复前在4°C的TBST中储存不超过一周。
5. 为了对载玻片进行热诱导抗原修复，将载玻片置于预热（80-95°C）柠檬酸钠缓冲液（10mM柠檬酸钠，0.05%吐温20，pH 6.0）中，并在高压下孵育至4分钟的压力锅中，总抗原修复时间为20分钟。
6. 从压力锅中取出载玻片，让它们冷却 20 分钟至室温。
7. 在TBST中快速洗涤载玻片三次。
   注意:载玻片可以在抗原修复后储存在TBST中，在染色前不超过一周。
8. 加入溶解在TBST中的2%BSA以阻止载玻片。用石蜡膜条盖住载玻片，并在室温下孵育15分钟。
9. 从载玻片中丢弃阻塞缓冲区。
10. 将 200 μL 的 1:10 D11-AP TBST 溶液添加到载玻片中，并用一条石蜡膜覆盖。
11. 在加湿室中孵育，以尽量减少抗体溶液在室温下蒸发3小时。
12. 在TBST中洗涤载玻片三次。
13. 分别使用比色或荧光碱性磷酸酶显影剂进行免疫组化或免疫荧光。用TBST清洗载玻片一次，以去除多余的显影剂并防止进一步显色。
14. 用 Hoechst 核染色剂在 PBS 中以 1 μg/mL 进行复染玻片，用于免疫荧光。在TBST中清洗载玻片一次，以去除任何多余的复染。
15. 使用封片剂涂抹盖玻片。
16. 在用于免疫组织化学的倒置光学显微镜或用于免疫荧光的共聚焦荧光显微镜下查看载玻片。

6. 阴性对照

注意:可以进行四个阴性对照实验来确认 D11-AP 染色对 IsoLG 的特异性。阴性对照实验应在相同条件下的相同染色组中进行。

1. 在第一个阴性对照实验中，用单独在TBST或TBST中稀释的D11-AP孵育组织。
2. 用TBST中稀释的D11-AP和在TBST中稀释的没有D11-AP（AP链接器）的细菌周质提取物孵育组织。
3. 如前所述，使用IsoLG / MSA或非加合MSA进行竞争性测定¹²。
   1. 如前所述制备IsoLG和IsoLG加合到小鼠血清白蛋白（MSA）中的¹⁹，摩尔比为8 IsoLG:1 MSA（8:1 IsoLG / MSA）。
   2. 在TBST中以1:10的比例稀释D11-AP。
   3. 将稀释的 D11-AP 与 50 μg/mL IsoLG/MSA 或非加合物 MSA 在室温下孵育 1 小时。
   4. 将含有 IsoLG/MSA 的 D11-AP 或含有非内收 MSA 的 D11-AP 添加到组织中进行染色。
4. 使用不相关的scFv抗体D20对组织进行染色，以获得最终的阴性对照组。

结果

在代表性实验中，具有碱性磷酸酶偶联（D11-AP）的D11 scfv用于免疫荧光，以检测血管紧张素II处理小鼠中存在的IsoLGs与正常假小鼠和高血压患者相比与正常血压的人相比。用血管紧张素II以490ng / kg / min的剂量治疗小鼠两周，与假小鼠¹⁰相比，收缩压升高证实了高血压。为了确保D11-AP的特异性，组织在存在或不存在D11-AP的情况下进行染色。如D11-AP染色所示，与对照小鼠相比，血管紧张素II诱导的高血压小鼠的主动脉显示出IsoLGs浓度升高（图1）。背景染色或自发荧光受到限制，如未用D11-AP染色的阴性对照所示。

D11-AP用于检测高血压（HTN）或正常血压人类（NTN）患者肠道组织中存在的IsoLG。高血压状态是根据医院记录确定的，收缩压高于140，舒张压高于80 mmHg。开发D11-AP免疫荧光方案的研究人员对人体组织的高血压状态不知情。在存在和不存在D11-AP的情况下对切片进行染色，以确保抗体特异性并显示背景染色或自发荧光。如图 2所示，我们发现与NTN患者相比，HTN患者的组织IsoLGs浓度升高。无D11-AP染色也显示出最小的背景染色和自发荧光。内源性碱性磷酸酶由肠上皮表达，因此在没有D11-AP染色的组织上的有限荧光表明该协议中使用的抗原修复足以灭活组织中存在的内源性碱性磷酸酶。结合小鼠的结果，这些结果还表明，与血压正常状态相比，免疫荧光方案有效地显示高血压中的IsoLGs升高。

分离D11-AP并储存在细菌周质提取物中。用D11-AP和含有不含D11的AP接头的周质提取物对小鼠和人体组织进行染色，以确保周质提取物中可能存在的其他因子，例如过量或非偶联碱性磷酸酶，不会有助于在用D11-AP处理的组织中观察到的染色（图3）。与用周质提取物染色的组织相比，用D11-AP染色的组织导致更明亮的染色。这些结果证实D11-AP正在对组织进行染色，并且染色不是由于非偶联细菌碱性磷酸酶引起的，这种酶可能存在于周质提取物中并导致IsoLG的假染色或导致背景染色。

通过在组织染色之前将D11-AP与IsoLG加合到MSA或非加合MSA预孵育来进行竞争性对照，以显示D11-AP对IsoLG的特异性。如果 D11-AP 对 IsoLG 具有特异性，则抗体将与 IsoLG-MSA 结合，导致 D11-AP 用于染色组织的可用性耗尽，并且与非加合的 MSA 一起孵育的 D11-AP 的染色与正常 D11-AP 相似。在与IsoLG竞争物预孵育的D11-AP染色组织中，我们发现与未经任何预孵育的D11-AP染色的组织相比，染色减少（图4）。在用D11-AP染色的组织与非加合MSA预孵育的组织中，我们发现染色与在D11-AP组织中观察到的染色相似。这些结果表明，当D11-AP与IsoLG/MSA预孵育时，D11-AP对IsoLGs的特异性降低，但非加合MSA没有。在最终阴性对照中，用D11-AP或不相关的scFv抗体D20染色小鼠组织。与D20相比，用D11-AP对小鼠主动脉进行染色会产生强烈的染色，表明D11-AP对高血压主动脉中IsoLGs的特异性（图5）。

图1:高血压和正常血压小鼠主动脉的免疫荧光。 用和不带D11-AP（D11）染色来自血管紧张素II和假输注小鼠的动脉以显示IsoLGs的存在。（A）用D11-AP（绿色）和核复染（洋红色）探测的血管紧张素II处理小鼠的动脉，（B）用D11-AP探测的对照假处理小鼠的动脉，（C）没有D11-AP的血管紧张素II处理小鼠的动脉，（D）没有D11-AP的对照假处理小鼠的动脉（比例尺= 100μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图2:高血压和正常血压患者对人肠道组织的免疫荧光。 对高血压患者（HTN）和正常血压人类（NTN）的组织进行染色和不加D11-AP（D11）染色，以显示高血压患者存在IsoLGs。（A）用D11-AP（绿色）和核复染（洋红色）染色的HTN组织，（B）用D11-AP染色的NTN组织，（C）没有D11-AP染色的HTN组织，（D）没有D11-AP染色的NTN组织（比例尺= 100μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:用有和没有 D11-AP 的周质提取物染色的小鼠和人体组织。 小鼠和人体组织用有和没有D11-AP的周质提取物染色。图像显示没有D11-AP的周质提取物对组织进行有限的染色，这表明染色主要是由于D11-AP结合，而不是周质提取物中可能存在的另一种成分。（A）用D11-AP（绿色）和核复染（品红色）染色的Ang小鼠主动脉，（B）用周质提取物染色的Ang小鼠主动脉，（C）用D11-AP染色的假鼠主动脉，（D）用周质提取物染色的假鼠主动脉，（E）用D11-AP染色的高血压人肠道组织，（F）用周质提取物染色的高血压人肠组织，（G）用D11-AP染色的正常血压人肠道组织， （H）用周质提取物染色的正常血压的人肠道组织（比例尺=100μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图4:Ang和Sham小鼠血管中的竞争性控制。 在这种竞争性对照中，D11-AP与IsoLG加合的MSA或非加合的MSA一起预孵育。使用没有任何预孵育的D11-AP作为对照。这些结果显示了D11-AP对IsoLG的特异性，因为与D11-AP相比，IsoLG-MSA竞争对手的组织染色减少。这种减少是由于IsoLG而不是MSA，因为未加入的MSA预孵育导致与D11-AP对照相似的染色。用D11-AP（绿色）和核复染（洋红色）染色的血管紧张素II（A）和假（B）小鼠主动脉，血管紧张素II（C）和假（D）小鼠主动脉在与IsoLG-MSA孵育后用D11-AP染色，血管紧张素II（E）和假（F）小鼠主动脉与非内收的MSA孵育后用D11-AP染色（比例尺= 100μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:用 D11 和不相关的 scFv 染色的小鼠主动脉，D20。用D11-AP染色小鼠组织，并与对糖蛋白A2具有特异性的不相关的对照抗体D20进行比较。与D20（绿色）和核复染（品红色）（B）相比，用D11-AP（绿色）和核复染（品红色）（B）对组织进行染色会产生强烈的免疫荧光，这表明D11-AP对IsoLGs的特异性（比例尺= 100μm）。请点击此处查看此图的大图。

讨论

D11已被广泛用于检测细胞或组织中的IsoLG加合蛋白，作为疾病⁸，^9，20中炎症或氧化应激的标志物。以前，D11包含一个E标签，IHC开发需要使用与HRP^10，20，21偶联的二级抗E标签抗体。在这里，我们开发并优化了使用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体代替E标签检测IsoLG加合蛋白的方案，这消除了二抗孵育的需要。

为了确定D11-AP的特异性，进行了四个阴性对照实验。我们在没有D11的情况下执行了协议，并且几乎没有开发。这些结果具有双重指示:内源性碱性磷酸酶对发育没有贡献，观察到的染色是由于D11而不是另一个促成因素。接下来，我们用不含D11的AP接头对载玻片进行染色。该实验导致很少的染色，这表明周质提取物中的游离AP或其他因素不会导致我们在存在D11的情况下观察到的染色。为了确保D11对IsoLG的特异性，我们在载玻片染色前将D11-AP与纯化的IsoLG预孵育。我们看到发育的减少，这表明D11-AP与IsoLG蛋白结合，从而耗尽了游离D11-AP与组织中存在的IsoLG结合的量。最后，为了确保D11-AP与IsoLG结合，而不是IsoLG结合的MSA蛋白，我们仅用MSA预孵育D11-AP。发育没有变化，表明D11-AP不与MSA结合，而是与IsoLG蛋白结合。最后，开发染色方案的研究人员对人类肠道组织的高血压状态视而不见。高血压患者和血压正常患者之间观察到的染色差异不是由于偏倚，之前已经描述过^22，23。

尽管我们使用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体代替E-tag检测IsoLG加合蛋白的方案严格而稳健，并且无需二抗孵育，但它存在一些局限性。一个限制是，我们在周质提取物中使用了与碱性磷酸酶偶联的D11，并且在周质提取物或某些组织（例如肠²⁴）中可能存在内源性碱性磷酸酶的假染色。然而，开发该协议的第一步包括禁用可能存在于组织中的内源性碱性磷酸酶²⁵。最初，对冷乙酸，BME和左旋咪唑²⁶ 进行效率测试。这些都没有完全减少活性内源性碱性磷酸酶的存在。热量已被用于使碱性磷酸酶²⁷失活，因此我们测试了碱性磷酸酶在不同缓冲液中的热失活。我们发现柠檬酸盐缓冲液中的加热安装和水合载玻片消除了大多数内源性碱性磷酸酶。载玻片最初使用化学发光/荧光底物开发，但是当没有这种底物成像时，存在大量的自发荧光。VectorRed是一种底物，在碱性磷酸酶存在下形成，产生可以在德克萨斯红/ TRITC通道范围内可视化的显色原。使用这种底物，我们能够更容易地观察背景自发荧光以上的信号。在染色过程中应小心，以尽量减少人为染色。水合后在载玻片上干燥组织，直到成像导致发育加速。D11-AP应等分并储存在-20°C。 使用 D11-AP 时，应避免多次冻融循环。磷酸盐缓冲盐水（PBS）也可影响碱性磷酸酶的酶活性，不应用作洗涤缓冲液²⁸。与任何基于抗体的方法一样，必须进行彻底的测试和优化，以确保染色具有特异性，并且信号不会过度放大或放大不足。

总之，我们开发了一种强大、严格且稳健的优化方案，使用与碱性磷酸酶偶联的 D11 抗体代替 E-tag 来检测 IsoLG 加合蛋白。该方案具有几个优点:首先，使用D11作为碱性磷酸酶融合蛋白更便宜。D11最初来源于噬菌体抗体库，该库无法商业化且纯化成本高昂。尽管 大肠杆菌 周质提取物中的D11可以提供廉价的替代品，但在大多数测定中无效。其次，碱性磷酸酶融合方法允许D11 scfv具有有用的报告基因¹⁵ （碱性磷酸酶）融合，并且不需要纯化用于免疫测定，因为底物是市售的。第三， 大肠杆菌 碱性磷酸酶形成二聚体²⁹。所以D11与碱性磷酸酶融合时也会形成二聚体，这增加了抗体的亲和力和结合活性³⁰。最后，D11与周质提取物中的碱性磷酸酶偶联，可以使用Cibacron Blue Sepharose轻松清洁。D11具有高等电点（~9.2 pH）。因此，它带正电，可以通过pi阳离子相互作用与Cibacron Blue结合。 大肠杆菌 周质提取物中的大部分杂质都可以从树脂中洗脱出来。然后可以使用高盐（~1.5M NaCl）在水中洗脱与碱性磷酸酶偶联的D11。与碱性磷酸酶偶联的洗脱D11在高盐溶液中在4-8°C下相当稳定。因此，我们开发了一种方案，不仅可以以低成本提供D11抗体，还可以消除二抗孵育的额外步骤和需求。该协议有助于IsoLGs的可重复测量，IsoLGs在氧化应激增加的多种疾病中积累在组织中。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA)	Cytiva	28953766
200 Proof Ethanol	Pharmco	111000200
2xYT powder	MP Biomedicals	3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates	ThermoFisher (NUNC)	242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP)	Carbosynth	EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP)	Carbosynth	EB09335
Ampicillin, sodium salt	Research Products International (RPI)	A40040
Bovine Serum Albumin	RPI	A30075
Chemically competent TG1 E. coli	Amid Biosciences	TG1-201
Diethanolamine, >98%	Sigma-Aldrich	D8885
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Mouting medium
Glucose	Research Products International (RPI)	G32045
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Histoclear	National Diagnostics	HS-200	Xylene alternative
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals	ThermoFisher	MK-2624-212
Imidazole	Research Products International (RPI)	I52000
MgCl2 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M8266
Mouse Serum Albumin (MSA)	Sigma-Aldrich/Calbiochem	126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)	Carbosynth	EN13587
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Pressure Cooker	Cuisinart	CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml	ThermoFisher	66380
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International (RPI)	S23020
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4)	Research Products International (RPI)	S23100
Sucrose	Research Products International (RPI)	S24065
Tris base	Research Products International (RPI)	T60040
Tris-buffered Saline	Boston Bio-Products		25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl	Research Products International (RPI)	T60050
Tween20	Sigma-Aldrich	P9416
Vector Red	Vector Labs	SK-5105