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  • 材料
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摘要

展示的是一种计算工具，允许从2D荧光图像中简单直接地自动测量神经元树突分支的方向。

摘要

神经元树突树的结构在神经元中突触输入的整合中起着关键作用。因此，树突形态的表征对于更好地了解神经元功能至关重要。然而，树突树的复杂性，无论是孤立的还是位于神经元网络内时，都尚未完全理解。我们开发了一种新的计算工具 SOA （分割和定向分析），它允许从2D神经元培养物的荧光图像中自动测量树突分支的方向。用Python编写的SOA使用分割来区分树突分支和图像背景，并在每个分支的空间方向上积累一个数据库。然后，该数据库用于计算形态参数，例如网络中树突分支的方向分布和平行树突分支生长的流行率。获得的数据可用于检测树突的结构变化，以响应神经元活动以及生物和药理学刺激。

引言

树突形态发生是神经科学的核心主题，因为树突树的结构会影响神经元突触整合的计算特性1，2，3。此外，树突状支的形态异常和修饰与退行性和神经发育障碍有关4，5，6。在树突状分支更容易可视化的神经元培养物中，非姐妹树突状分支之间的相互作用调节沿分支突触聚集的部位和程度，这种行为可能会影响突触共性和可塑性7，8，9。因此，使用二维（2D）神经元培养物表征树突状树的形态参数有利于了解树突形态发生和单个神经元和神经网络的功能。然而，这是一项具有挑战性的任务，因为即使在"简化"的2D神经元培养物中，树突状分支也会形成复杂的网格。

已经开发了几种工具来自动跟踪和分析树突结构10，11，12，13。但是，这些工具中的大多数都是为3D神经元网络设计的，并且自然太复杂而无法与2D网络一起使用。相比之下，不太先进的形态分析工具通常涉及计算机辅助体力劳动的重要组成部分，这非常耗时且容易受到操作员偏差的影响14。现有的半自动工具，如'ImageJ'15 （NIH开源图像处理软件包，其中包含大量社区开发的生物图像分析工具），大大减少了用户的体力劳动。然而，在图像处理过程中仍然需要一些人工干预，并且分割的质量可能低于预期。

本文介绍了SOA，这是一个简单的自动化工具，允许对2D神经元网络中的树突分支进行直接分割和定向分析。SOA可以检测2D图像中的各种线状物体，并表征它们的形态特性。在这里，我们使用SOA对培养物中树突网络的2D荧光图像中的树突分支进行分段。该软件识别树突分支，并成功执行形态参数的测量，如平行度和空间分布。SOA可以很容易地用于分析其他细胞类型的细胞过程和研究非生物网络。

研究方案

注意:以色列卫生部批准根据协议IL-218-01-21使用小鼠用于实验动物的道德使用。SOA仅与Windows 10和Python 3.9兼容。它以开源代码的形式提供:https://github.com/inbar2748/DendriteProject。在此链接中，还有一个自述文件。DM 文件，其中包含软件下载说明、软件网站的链接以及包含所有软件包所需版本信息的要求文件。那里还提供了使用该软件执行的分析的其他示例。

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图 1:用于细分和增长方向分析的 SOA 工作流。 图中显示了树突状网络荧光图像的处理步骤和数据分析。上传二维图像，进行分割（分两步进行:将树突状支线检测为线，然后将相关线合并），并获得每个树突支的空间信息。收集图像中所有树突分支的数据。最后，分析数据以提供所需的形态参数。缩写:SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 打开 SOA 应用程序。

  1. 打开URL地址:https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA，找到 SOA.zip 压缩文件夹，然后双击下载ZIP文件。
  2. 通过右键单击 SOA 解压缩文件夹.zip然后选择" 解压缩文件"。 观察打开的 "提取路径和选项" 窗口以及显示提取文件路径的" 目标地址 "文本框。要解压缩到其他位置，请单击窗口右侧面板中的某个文件夹，使其成为目标文件夹。单击 "确定"将文件解压缩到该文件夹。
  3. 打开提取的 SOA 文件，然后双击 SOA.exe。 等待黑色窗口打开，之后将出现应用程序。

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图 2:使用 SOA 的 GUI 的工作流示例。 左列:工作流的 GUI 部分。中间列:在工作流程中处理的树枝状网络的图像（比例尺:20μm）。右列:放大中间列图像中由红色矩形标记的区域（比例尺:4μm）。步骤1:选择并上传图像。步骤2:分割的第一阶段是检测代表已识别树突分支的线。第3步:分割的第二阶段是基于接近的单个树突分支中段衬里的合并。可以修改所有步骤的设置。缩写:SOA = 分割和方向分析;GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 打开要分析的图像。

  1. 在 SOA 查看器上载 菜单栏中|选择 "选择文件|从计算机文件中选择图像|单击它（仅.png .jpg .tif .bmp文件）| 打开 |观察文件|的路径 下一个。

3. 细分优化

注意:在 SOA 查看器属性 菜单栏中，更改所选参数的值以调整分段过程设置。参数（如 阈值）的详细说明在 补充材料中给出。

  1. 在 "边缘"中，通过选择" 阈值"并输入一个数字来调整显示的阈值。
    注意:阈值的数字越低，检测到的行数就越多。阈值是介于 0 到 255 之间的数字。默认值已设置为 0。
  2. 在 合并行中:
    1. 通过选择要合并的最小距离并输入一个数字 来调整要合并 的显示的最小距离。
      注意:合并 的最小距离 范围为 0 到 30 像素。默认值设置为 20。
    2. 通过选择要合并的最小角度并输入一个数字 ，调整要合并 的显示的最小角度。
      注: 要合并的最小角度 范围为 0 到 30°。默认值设置为 10。
  3. 单击 "创建预览分割图像"。
    注意:将根据更新的值显示分割结果的预览图像。此外，将显示合并前的行数和合并后的行数。
  4. 更改参数以实现段的最大识别。如果需要更改属性，请单击" 关闭"窗口 按钮，然后按照步骤 3.1-3.4 进行操作。

4. 创建输出文件。

  1. 按 OK 可可视化分割图像和分析图形。观察出现的窗口，以选择要保存.xlsx文件的位置。
  2. 插入文件名|选择 保存 |等待创建并保存包含数据的.xlsx文件。
    注意:除了.xlsx文件外，还会自动显示以下文件:显示原始图像的文件、线识别图像、分割的最终图像和三个分析图。

5. 导航工具栏

注意:导航工具栏包含在所有图形窗口中，可用于在数据集中导航。工具栏底部的每个按钮如下所述。

  1. 若要在以前定义的视图之间来回导航，请使用 "前进 "和" 后退 "按钮。
    注意:" 开始"、" 前进"和" 后退 "按钮类似于 Web 浏览器上的" 开始"、" 前进"和 "后退" 控件。 主页 返回到默认屏幕，即原始图像。
  2. 使用" 缩放"按钮进行平移和缩放。若要激活平移和缩放，请按下" 缩放 "按钮，然后将鼠标移动到图像中的所需位置。
    1. 要平移图形，请按住鼠标左键，同时将其拖动到新位置。松开鼠标按钮，图像中的选定点将显示在新位置。平移时，按住 x 或 y 键以分别将运动限制为 x 轴或 y 轴。
    2. 要缩放，请按住鼠标右键并将其拖动到新位置。向右移动以放大 x 轴，向左移动以在 x 轴上缩小。对 y 轴和上/下运动执行相同的操作。缩放时，请注意鼠标下方的点保持静止，允许在该点周围放大或缩小。使用修饰键 x、 y 或 CONTROL 分别将缩放限制为 x、 y 或宽高比保留。
  3. 要激活缩放到矩形模式，请单击缩放 到矩形 按钮。将光标放在图像上，然后按鼠标左键。按住按钮将鼠标拖动到新位置以定义矩形区域。
    注: 按下鼠标左键时，轴视图限制将缩放到定义的区域。按下鼠标右键时，轴视图限制将被缩小，并将原始轴放置在定义的区域中。
  4. 使用 子情节配置 工具配置子情节的外观。
    注: 子图的左侧、右侧、顶部和底部以及行和列之间的空间可以拉伸或压缩。
  5. 若要打开文件保存对话框，请单击" 保存 "按钮，然后按以下格式保存文件:.png、.ps、.eps、.svg或.pdf。

结果

对培养物中树突状网络的图像进行了代表性分析。细胞被提取如Baranes 等人所描述的那样。16，17.简而言之，从产后大鼠的大脑中提取海马细胞，并在2D玻璃盖玻片上培养1-2周。然后将培养物固定并通过间接免疫荧光染色，使用针对树突状蛋白标志物微管相关蛋白2（MAP2）的抗体进行染色。使用荧光显微镜收集树突状网络的图像，并使用SOA处理10张?...

讨论

迫切需要从2D图像中提取形态信息的有效策略，以跟上生物成像数据。虽然成像数据可以在几小时内生成，但对图像的深入分析需要很长时间。因此，图像处理显然已成为许多领域的主要障碍。这部分是由于数据的高度复杂性，特别是在处理生物样本时。此外，由于许多用户缺乏专门的编程和图像处理技能，因此需要自动化工具，以便以简单和用户友好的方式完成图像处理。这就是为什么SOA有望?...

披露声明

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

作者要感谢Orly Weiss博士准备的文化图像。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Matplotlib 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team.3.4.2a Python 2D plotting library
matplotlib-scalebarPhilippe Pinard0.7.2artist for matplotlib to display a scale bar
NumPyThe NumPy community.1.20.3fundamental package for scientific computing library
OpenCVOpenCV team4.5.2.54Open Source Computer Vision Library
PyCharmJetBrains2020.3.1 (Community Edition) versionBuild #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4
PyQt5Riverbank Computing5.15.4manage the GUI
pythonPython Software Foundation License3.9 version
Qt DesignerThe QT Company Ltd.5.11.1 version
scipyCommunity library project1.6.3Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering
SeabornMichael Waskom.0.11.1Python's Statistical Data Visualization Library.
Windows 10Microsoft
XlsxwriterJohn McNamara1.4.3Python module for creating Excel XLSX files

参考文献

  1. Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. Functional impact of dendritic branch-point morphology. Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).
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  3. Chklovskii, D. Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin. Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).
  4. Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).
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  6. Kaufmann, W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
  7. Pinchas, M., Baranes, D. Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering. PLoS ONE. 8 (12), 82083 (2013).
  8. Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs. Brain Research. 1251, 30-41 (2009).
  9. Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity. PLoS ONE. 3 (11), 3782 (2008).
  10. Glaser, J., Glaser, E. Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy. Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).
  11. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).
  12. Torben-Nielsen, B. An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies. Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).
  13. Parekh, R., Ascoli, G. Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience. Neuron. 78 (1), 206 (2013).
  14. heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis. 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).
  15. Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2021)
  16. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).
  17. Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).

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