Dendritik Dalların Otomatik Tanımlanması ve Oryantasyonları

Özet

Sunulan, 2D floresan görüntülerden nöronal dendritik dalların yönelimlerinin basit ve doğrudan otomatik olarak ölçülmasını sağlayan bir hesaplama aracıdır.

Özet

Nöronal dendritik ağaçların yapısı, sinaptik girdilerin nöronlara entegrasyonunda kilit rol oynar. Bu nedenle, nöronal fonksiyonun daha iyi anlaşılması için dendritlerin morfolojisinin karakterizasyonu esastır. Bununla birlikte, hem izole edildiğinde hem de özellikle nöronal ağlar içinde bulunduğunda, dendritik ağaçların karmaşıklığı tam olarak anlaşılamamıştır. 2B nöronal kültürlerin floresan görüntülerinden dendritik dalların yönünün otomatik olarak ölçülmesine izin veren yeni bir hesaplama aracı olan SOA 'yı (Segmentasyon ve Oryantasyon Analizi) geliştirdik. Python ile yazılan SOA, dendritik dalları görüntü arka planından ayırmak için segmentasyon kullanır ve her dalın uzamsal yönü üzerinde bir veritabanı biriktirir. Veritabanı daha sonra bir ağdaki dendritik dalların yönlü dağılımı ve paralel dendritik dal büyümesinin yaygınlığı gibi morfolojik parametreleri hesaplamak için kullanılır. Elde edilen veriler, nöronal aktiviteye yanıt olarak dendritlerdeki yapısal değişiklikleri tespit etmek ve biyolojik ve farmakolojik uyaranlara karşı kullanılabilir.

Giriş

Dendritik morfogenez, nöronlarda sinaptik entegrasyonun hesaplama özelliklerini etkilediği için, dendritik ağacın yapısı nörobilimde merkezi bir konudur1,2,3. Ayrıca dendritik branşlarda morfolojik anormallikler ve modifikasyonlar dejeneratif ve nöro-gelişimsel bozukluklara bulaşmıştır4,5,6. Dendritik sonuçların daha kolay görselleştirilebildiği nöronal kültürlerde, kardeş olmayan dendritik dallar arasındaki etkileşimler, kollar boyunca sinaptik kümelenmenin alanlarını ve kapsamını düzenler, sinaptik koaktiviteyi ve plastisiteyi etkileyebilecek bir ^{davranış7,8,9}. Bu nedenle, dendritik ağacın morfolojik parametrelerinin iki boyutlu (2D) nöronal kültürler kullanılarak karakterizasyonu, dendritik morfogenez ve tek ve nöron ağlarının işlevselliğini anlamak için avantajlıdır. Yine de, bu zorlu bir iştir, çünkü dendritik dallar "basitleştirilmiş" 2D nöronal kültürlerde bile karmaşık bir ağ oluşturur.

Dendritik yapıları otomatik olarak izlemek ve analiz etmek için çeşitli araçlar geliştirilmiştir10,11,12,13. Bununla birlikte, bu araçların çoğu 3D nöronal ağlar için tasarlanmıştır ve doğal olarak 2D ağlarla kullanılamayacak kadar karmaşıktır. Buna karşılık, daha az gelişmiş morfolojik analiz araçları tipik olarak bilgisayar destekli el emeğinin önemli bir bileşenini içerir, bu da çok zaman alıcı ve operatör önyargısına karşı ^hassastır14. '^ImageJ'15 (topluluk tarafından geliştirilen biyolojik görüntü analiz araçlarının geniş bir koleksiyonuna sahip bir NIH açık kaynaklı görüntü işleme paketi) gibi mevcut yarı otomatik araçlar, kullanıcı el emeğini büyük ölçüde azaltır. Bununla birlikte, görüntü işleme sırasında bazı manuel müdahalelere hala ihtiyaç vardır ve segmentasyonun kalitesi arzu edilenden daha az olabilir.

Bu makale, 2B nöronal ağlardaki dendritik dalların doğrudan segmentasyon ve oryantasyon analizine izin veren basit bir otomatik araç olan SOA'yı sunun. SOA, 2D görüntülerdeki çeşitli çizgi benzeri nesneleri algılayabilir ve morfolojik özelliklerini karakterize edebilir. Burada, kültürdeki dendritik ağların 2D floresan görüntülerinde dendritik dalları segmentlere ayırırken SOA'yı kullandık. Yazılım dendritik dalları tanımlar ve paralellik ve mekansal dağılım gibi morfolojik parametrelerin ölçümlerini başarıyla gerçekleştirir. SOA, diğer hücre tiplerinin hücresel süreçlerinin analizi ve biyolojik olmayan ağların incelenmesi için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

NOT: İsrail Sağlık Bakanlığı, deney hayvanlarının etik kullanımı için IL-218-01-21 protokolü kapsamında fare kullanımını onayladı. SOA yalnızca Windows 10 ve Python 3.9 ile uyumludur. Açık kaynak kod olarak mevcuttur: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. Bu bağlantıda, bir README de vardır. Yazılımı indirmek için yol tarifi, yazılımın web sitesine bir bağlantı ve tüm paketlerin gerekli sürümleri hakkında bilgi içeren bir gereksinim dosyası içeren DM dosyası. Yazılım kullanılarak gerçekleştirilen ek analiz örnekleri de burada sağlanmıştır.

Şekil 1: Segmentasyon ve büyüme yönü analizi için SOA iş akışı. Dendritik ağların floresan görüntülerinin ve veri analizinin işleme adımları gösterilmiştir. 2B görüntü yüklenir, bölümlere ayırılır (iki adımda: dendritik dallar çizgi olarak algılanır ve daha sonra ilgili satırlar birleştirilir) ve her dendritik dalın uzamsal bilgileri elde edilir. Veriler görüntüdeki tüm dendritik dallar için toplanır. Son olarak, veriler istenen morfolojik parametreleri vermek için analiz edilir. Kısaltma: SOA = segmentasyon ve oryantasyon analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. SOA uygulamasını açın.

1. URL adresini açın: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, SOA.zip sıkıştırılmış klasörünü bulun ve zip dosyasını çift tıklatarak indirin.
2. SOA'ya sağ tıklayarak klasörün ferş .zip ve Dosyaları Ayıkla'yı seçin. Açılan Ayıklama Yolu ve Seçenekleri penceresini ve ayıklanan dosyaların yolunu görüntüleyen Hedef Adres metin kutusunu gözlemleyin. Farklı bir konuma ayıklamak için, pencerenin sağ panelinde bulunan klasörlerden birini tıklatarak hedef klasör haline getirin. Dosyaları bu klasöre ayıklamak için Tamam'ı tıklatın.
3. Ayıklanan SOA dosyasını açın ve SOA.exe'e çift tıklayın. Siyah bir pencerenin açılmasını bekleyin, ardından uygulama görünecektir.

Şekil 2: SOA'nın GUI'sini kullanan iş akışı örneği. Sol sütun: İş akışının GUI bölümleri. Orta sütun: iş akışı sırasında işlenen bir dendritik ağın görüntüsü (Ölçek çubuğu: 20 μm). Sağ sütun: orta sütunun görüntülerinde kırmızı bir dikdörtgenle işaretlenmiş alanın büyütülmesi (Ölçek çubuğu: 4 μm). Adım 1: Bir görüntünün seçimi ve yüklenmesi. Adım 2: Segmentasyonun ilk aşaması, tanımlanan dendritik dalları temsil eden çizgilerin algılanmasıdır. Adım 3: Segmentasyonun ikinci aşaması, segment astarının bireysel dendritik dallarda yakınlık tabanlı birleşmesidir. Tüm adımların ayarları değiştirilebilir. Kısaltmalar: SOA = segmentasyon ve oryantasyon analizi; GUI = grafik kullanıcı arayüzü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Analiz etmek için bir resim açın.

1. SOA Görüntüleyici Karşıya Yükleme menü çubuğunda | Dosya Seç |'nı seçin bilgisayar dosyalarından bir görüntü seçin| üzerine tıklayın (yalnızca .png .jpg .tif .bmp dosyalar) | | Aç dosyanın yolunu gözlemleyin | Önümüzdeki.

3. Segmentasyon optimizasyonu

NOT: SOA Görüntüleyici Özellikleri menü çubuğunda, segmentasyon işlemi ayarlarını ayarlamak için seçili parametrelerin değerlerini değiştirin. Ek Malzeme'de Eşik gibi parametrelerin ayrıntılı bir açıklaması verilmiştir.

1. Kenarlar'da, Eşiği seçip bir sayı girerek ekranın eşiğini ayarlayın.
   NOT: Eşik için sayı ne kadar düşük olursa, o kadar çok satır algılanır. Eşik, 0 ile 255 arasında değişen bir sayıdır. Varsayılan değer 0 olarak ayarlandı.
2. Satırları Birleştir'de:
   1. Birleştirilecek Min mesafesini seçip bir sayı girerek ekran için birleştirilecek minimum mesafeyi ayarlayın.
      NOT: Birleştirme için Min mesafesi 0 ile 30 piksel arasında değişir. Varsayılan değer 20 olarak ayarlanır.
   2. Birleştirilecek Min açısını seçip bir sayı girerek ekran için birleştirilecek minimum açıyı ayarlayın.
      NOT: Birleştirilecek Min açısı 0 ile 30° arasında değişir. Varsayılan değer 10 olarak ayarlanır.
3. Önizleme Segmentasyon Görüntüsü Oluştur'a tıklayın.
   NOT: Segmentasyon sonuçlarının önizleme görüntüsü güncelleştirilmiş değerlere göre görüntülenir. Ayrıca, birleştirmeden önceki satır sayısı ve birleştirmeden sonraki satır sayısı görüntülenir.
4. Segmentlerin maksimum tanımlamasını elde etmek için parametreleri değiştirin. Özellikleri değiştirme ihtiyacı varsa, Pencereyi kapat düğmesine tıklayın ve 3.1-3.4 adımlarını izleyin.

4. Çıktı dosyalarını oluşturun.

1. Segmentasyon görüntülerini ve çözümleme grafiklerini görselleştirmek için Tamam'a basın. .xlsx dosyasının kaydedileceği konumu seçmek için görüntülenen pencereyi gözlemleyin.
2. dosya adı ekleme | Kaydet |' i seçin verilerin oluşturulup kaydedilmesini içeren .xlsx dosyasını bekleyin.
   NOT: .xlsx dosyasına ek olarak, aşağıdaki dosyalar otomatik olarak görüntülenir: orijinal görüntüyü, çizgi tanıma görüntüsünü, segmentasyonun son görüntüsünü ve üç analiz grafiğini sunan bir dosya.

5. Gezinti araç çubuğu

NOT: Gezinti araç çubuğu tüm şekil pencerelerinde bulunur ve veri kümesinde gezinmek için kullanılabilir. Araç çubuğunun altındaki düğmelerin her biri aşağıda açıklanmıştır.

1. Önceden tanımlanmış görünümler arasında ileri geri gezinmek için İleri ve Geri düğmelerini kullanın.
   NOT: Giriş, İleri ve Geri düğmeleri, web tarayıcısındaki Giriş, İleri ve Geri denetimlerine benzer. Giriş varsayılan ekrana, orijinal görüntüye döner.
2. Kaydırmak ve yakınlaştırmak için Yakınlaştır düğmesini kullanın. Kaydırma ve yakınlaştırmayı etkinleştirmek için Yakınlaştır düğmesine basın, ardından fareyi görüntüde istediğiniz konuma getirin.
   1. Şekli kaydırmak için, sol fare düğmesini yeni bir konuma sürüklerken basılı tutun. Fare düğmesini bırakın ve görüntüdeki seçili nokta yeni konumda görünecektir. Kaydırma sırasında, hareketi sırasıyla x veya y eksenleriyle sınırlamak için x veya y tuşlarını basılı tutun.
   2. Yakınlaştırmak için sağ fare düğmesini basılı tutun ve yeni bir konuma sürükleyin. X eksenini yakınlaştırmak için sağa, x ekseninde uzaklaştırmak için sola hareket edin. Aynı şeyi y ekseni ve yukarı/aşağı hareketler için de yapın. Yakınlaştırırken, farenin altındaki noktanın sabit kaldığını ve bu noktanın yakınlaştırmasına veya uzaklaştırmasına izin verdiğini unutmayın. Yakınlaştırmayı sırasıyla x, y veya en boy oranı korumasıyla sınırlamak için x, y veya CONTROL değiştirici tuşlarını kullanın.
3. Dikdörtgene yakınlaştırma modunu etkinleştirmek için Dikdörtgene yakınlaştır düğmesini tıklatın. İmleci görüntünün üzerine yerleştirin ve sol fare düğmesine basın. Dikdörtgen bir bölge tanımlamak için düğmeyi basılı tutarken fareyi yeni bir konuma sürükleyin.
   NOT: Sol fare düğmesine basıldığında eksen görünümü sınırları tanımlanan bölgeye yakınlaştırılacaktır. Sağ fare düğmesine basıldığında eksen görünümü sınırları uzaklaştırılacak ve orijinal eksenler tanımlanan bölgeye yerleştirilecektir.
4. Alt pilotun görünümünü yapılandırmak için Alt Pilot yapılandırma aracını kullanın.
   NOT: Alt pilotun sol, sağ, üst ve alt kenarlarının yanı sıra satırlar ve sütunlar arasındaki boşluk uzatılabilir veya sıkıştırılabilir.
5. Dosya kaydetme iletişim kutusunu açmak için Kaydet düğmesini tıklatın ve dosyayı aşağıdaki biçimlerde kaydedin: .png, .ps, .eps, .svg veya .pdf.

Sonuçlar

Kültürdeki dendritik ağların görüntüleri üzerinde temsili bir analiz yapıldı. Hücreler Baranes ve ark. ^16,17. Kısaca, hipokampal hücreler doğum sonrası sıçanların beyinlerinden çıkarıldı ve 1-2 hafta boyunca 2D cam kapaklar üzerinde yetiştirildi. Kültürler daha sonra dendritik protein belirteci, mikrotübül ilişkili protein 2'ye (MAP2) karşı bir antikor kullanılarak dolaylı immünofluoresans yoluyla sabitlendi ve lekelendi...

Tartışmalar

Biyolojik görüntüleme verilerine ayak uydurmak için 2D görüntülerden morfolojik bilgi çıkarmak için etkili stratejiler gereklidir. Görüntüleme verileri saatler içinde oluşturulabilse de, görüntülerin derinlemesine analizi uzun zaman alır. Sonuç olarak, görüntü işleme açıkça birçok alanda büyük bir engel haline gelmiştir. Bu kısmen, özellikle biyolojik örneklerle uğraşırken verilerin yüksek karmaşıklığından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, birçok kullanıcı özel programlama ve gö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matplotlib	2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team.	3.4.2	a Python 2D plotting library
matplotlib-scalebar	Philippe Pinard	0.7.2	artist for matplotlib to display a scale bar
NumPy	The NumPy community.	1.20.3	fundamental package for scientific computing library
OpenCV	OpenCV team	4.5.2.54	Open Source Computer Vision Library
PyCharm	JetBrains	2020.3.1 (Community Edition) version	Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4
PyQt5	Riverbank Computing	5.15.4	manage the GUI
python	Python Software Foundation License	3.9 version
Qt Designer	The QT Company Ltd.	5.11.1 version
scipy	Community library project	1.6.3	Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering
Seaborn	Michael Waskom.	0.11.1	Python's Statistical Data Visualization Library.
Windows 10	Microsoft
Xlsxwriter	John McNamara	1.4.3	Python module for creating Excel XLSX files