使用实时显微镜和开源软件对 阿斯珀吉卢斯尼杜兰 生长速度的定量分析

摘要

我们使用传输的光显微镜技术呈现一个无标签的实时成像协议，以捕获图像，分析和量化在水下培养物和固体介质中长丝真菌 A.尼杜兰的 生长动力学。此协议可与荧光显微镜配合使用。

摘要

众所周知，通过比较菌落大小，在凝固介质上对长丝真菌的菌落生长进行宏观估计，主要取决于海眠/肌皮生长速度的变化。然而，在不同的环境/生长条件下（pH值、温度、碳和氮源、抗生素等）定量测量基因不同真菌株或菌株的生长速度是具有挑战性的。因此，为了更好地了解真菌细胞的生长，必须采用补充方法来量化生长动力学。此外，众所周知，丝状真菌，包括阿斯珀吉卢斯花，在固体介质或水下文化的亚空中条件下具有独特的生长和分化模式。在这里，我们详细介绍了一个定量的微观方法，用于分析模型真菌 阿斯珀吉卢斯尼杜兰的生长动力学，使用实时成像在水下文化和固体介质。我们使用开放源、免费的生物图像软件（例如斐济）以可重复和可靠的方式捕获不同真菌菌株的增长率，分析和量化其增长率，无需用户提供任何事先的图像分析专业知识。

引言

丝状真菌具有重要的社会经济和生态重要性，作为工业/农业工具，酶和抗生素生产^1，2和作物植物的病原体^3，害虫昆虫⁴和人类^3。此外，像阿斯珀吉卢斯尼杜兰这样的丝状真菌被广泛用作基础研究的模型生物体，如遗传学、细胞和进化生物学的研究，以及连字符延伸⁵的研究。纤维真菌是高度两极分化的生物体，通过膜脂质/蛋白质的连续供应和细胞壁在延伸尖端⁶的脱光合成而拉长。在直写尖端生长和极性维护中的核心作用是名为"斯皮琴科珀"（SPK）的专门结构，这是一种高度有序的结构，主要由细胞骨骼成分和Golgi^6、7、8的极化分布组成。

环境刺激/信号，如水-空气接口，光_，CO2 浓度和营养状况负责这些模具⁹的发展决定。在水下（液体）培养物中 ，A.尼杜兰的 分化被抑制，生长通过连字符尖拉长⁶发生。在植物生长过程中，无性孢子（conidia）通过顶点延伸发芽，形成一个由相互关联的连字符细胞（mycelium）组成的无差别网络，只要有营养和空间，这种细胞就可能无限期地生长。另一方面，在固体介质连字符提示拉长和经过一个明确的植物生长期（发育能力），无性繁殖开始和空中锥形鼻从细胞的专门足细胞^延伸。这些产生专门的发展多细胞结构称为针叶，产生长链的黄体针叶^10， 可以在有利的环境条件下重新启动生长。

测量丝状真菌生长的一种广泛使用的方法是在培养皿中含有的营养阿加上接种孢子，并在^几天后11日宏观测量菌落的直径。殖民地的直径/面积，最依赖于天体生长速度的变化，而较少依赖于圆锥体密度^12，然后用作生长值。虽然测量在固体表面生长的真菌种群（科洛尼）大小是相当充分的，但这绝不是最准确的生长量。与种群水平平均值（真菌群大小的平均值）相比，单细胞测量可以捕获细胞群的异质性，并允许识别细胞的新型亚种群，状态^13，动力学，通路以及细胞对内源和环境变化作出反应的生物机制14，15。通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型可以说是最广泛采用的定量单细胞观察方法。

在此，我们详细介绍了一个无标签的实时成像协议，使用传输的光显微镜技术（如相对比度、差分干扰对比度 （DIC） 和极化显微镜）来捕捉图像，这些图像独立于荧光显微镜的组合使用，可用于分析和量化水下文化和固体介质中 A. nidulans 菌株的极性生长。

研究方案

1. 接种准备

注:所有步骤应在层压流柜下执行。

1. 摆脱感兴趣的真菌菌株， 从使用无菌接种环的甘油库存 （-80 °C） 到最小介质 （MM） 板，辅以与所检查的菌株相关的适当营养要求 [MM: 10.0 g/L 葡萄糖，20 mL/L 盐溶液（盐溶液:26 克/升 KCl，26 克/升 MgSO₄+7H₂O， 76 克/升 KH₂PO₄， 2.0 mL/L 氯仿） 和 1 mL/L 微量元素 （微量元素: 40 毫克/L Na₂B₄O₇•H₂O， 400 毫克/升 CuSO₄， 8 g/L ZnSO₄， 800 毫克/升 MnSO₄， 800 毫克/升 FEPO₄）， 调整 pH 到 6.8 与 1 M NaOH， 添加 1 % （w/v） agar 和所需的补充， 如^{在 16}和高压灭菌器中描述 ） （图 1）.
   注:盐溶液、微量元素溶液和补充剂是自动封条的。
2. 在 37 °C 下孵育 2-3 天。
3. 使用无菌牙签（或接种环），转移少量针叶， 通过轻轻触摸单个菌落，到完整介质 （CM） [CM: 10.0 g/L 葡萄糖，2.0 克/升肽，1.0 克/升酵母提取物，1.0 克/升卡萨米诺酸，20 mL/L 盐溶液，1 mL/L 微量元素，5 mL/L 维生素溶液（维生素溶液: 0.1 克/升核黄素， 0.1 克/升尼古丁胺， 0.01 g/L p-氨基苯甲酸， 0.05 g/L 苯丙胺 HCl， 1.0 毫克/升生物素）， 调整 pH 到 6.8 与 1 M NaOH， 添加 1% （w/v） agar 和所需的补充剂，如¹⁶ 和高压灭菌器中描述的。在 4 °C 下将维生素溶液自动保存并储存在深色瓶子中。
   注意:万一真菌生长过于密集，无法识别和隔离单个菌落，请重新划入新的阿加板，以获得单个菌落。
4. 在 37 °C 下孵育 3-4 天。
5. 使用无菌牙签（图S1），从生长在CM Agar板上的圆锥形真菌群表面划出1厘米，获得约2×10⁶细胞/mL的圆锥形悬浮。
   注意:必要时，用细胞计计算针叶。
6. 在无菌的 1.5 mL 离心机管中收获 A. nidulans 的针叶，用 1.0 mL 的自动封装蒸馏水，其中含有 0.05% （v/v） Tween 80，用于减少针叶团的数量。
   注:Conidia 可在 4 °C 下存储长达 2-3 周，而不会丧失相关生存能力（A. 阿萨纳索普洛斯和 V. 索菲亚诺普卢，未发布数据）。然而，建议过滤和/或洗锥体悬浮，以去除我的天体部分和营养物质，以防止锥体肿胀。

2. 准备成像在阿加（固体）介质上生长的丝状真菌

注:使用"倒置阿加法^17，18"的修改版本。

1. 最初，在培养皿（+9 厘米）15 mL 的 MM 上发现 10 微升的大力涡旋锥形（约 2 x^{10 4}细胞/mL），1% （w/v） agar （图 2）。
   注:使用"倒置阿加法"的修改版本，可以对真菌样本进行数小时的成像，而不会对生长的海梅产生明显的有害影响。
2. 根据拟研究的发展阶段孵化实验文化。
3. 用无菌手术刀切出含有菌落的≈0.8毫米² 块的醋。
   注:要切出的 Agar 块的尺寸取决于随后放置的设备的尺寸。在当前工作中，使用了 8 个井μ幻灯片（见下文）。
4. 倒置，将 agar 块放入μ滑梯或类似 8 室盖玻璃井中，盖片适合实时成像。
   注:如果传输的光显微镜将与荧光（标记）显微镜相结合使用，在成像前，Agar 块可以倒置到含有活细胞染料的液体介质液滴上。

3. 准备在液体介质上生长的成像丝状真菌

1. 在含有 200 μL （液体） MM 的 8 井μ滑梯的井中转移 10 μL 的大力涡旋锥形悬浮（约 2 x 10⁴ 细胞/mL），并配以适当的补充剂（见上文）。
2. 在所需温度下孵育所需的时间（图3）。
   注:如果传输光显微镜将与荧光（标记）显微镜相结合使用，液体培养物具有巨大的优势，在实验¹⁹期间的任何时间点都可以添加荧光染料。

4. 捕获图像

注:显微镜的选择取决于可用的设备。在任何情况下，显微镜设置应包括倒置阶段、环境室或至少具有精确空气温度控制的房间。

1. 将恒温显微镜室预热至 37 °C（除非另有说明或适合使用过的真菌物种），以便在开始前稳定温度。该室允许在延时实验期间对显微镜光学元件和样品阶段进行温度调节。请注意，当在³⁷ °C 或以上使用普通浸入油（设计用于 23 °C）油时，会引入光学畸变 20。
   注:在预算紧张的情况下，孵化室可以用纸板和绝缘包装材料²¹或使用3D打印机^22。
2. 打开显微镜、扫描仪电源、激光电源和计算机，并加载成像软件。将μ滑梯（以前准备）置于显微镜阶段并集中注意力。
3. 查找包含隔离/不重叠单元格（或至少没有过度拥挤）的视图字段，以便在图像分析期间促进生长测量。捕获每个样本至少 50 个生长细胞，以便进行可靠的统计分析。
4. 选择所需的传输光显微镜方法。减少暴露时间或激光功率和像素停留时间和/或增加针孔直径，以尽量减少真菌细胞的光出血，如其他地方描述^23，24。
5. 设置显微镜，以在所需的时间间隔获取图像，并开始时间系列采集。
   注:要纠正焦点漂移随着时间的推移（特别是长期实验），由于热漂移，不同的细胞大小和细胞运动使用自动对焦策略，如果你的显微镜软件可用。

5. 图像分析

注:本节描述了处理延时显微镜图像的关键步骤，用于测量 A.尼杜兰的生长速度。图像的打开、可视化和处理是通过开源 ImageJ/Fiji 软件²⁵完成的。

1. 使用插件将图像导入斐济 |生物格式|来自斐济菜单的生物格式进口商 与默认设置 （图 4A）。
   注:检查生物格式导入器是否正确识别图像校准。上部信息场图像窗口中显示的图片尺寸必须等于原始图像尺寸（图 4B）。按 移位 + P 以显示和更改 ImageJ/Fiji 软件中的图像属性。
2. 在需要时，使用直方图匹配²⁶ 用于不同帧之间的照明校正（图像|调整|漂白剂校正|直方图匹配） （图4C） 。
3. 必要时，请使用 SIFT 算法（插件|注册|线性堆栈与 SIFT对齐或匹配图像堆栈 （图4D）。从预期的转换菜单中选择"翻译"应该足以纠正任何 x-y 漂移。
   注:其他插件也可用于对齐一叠图像切片，如图像稳定器（https://imagej.net/Image_Stabilizer）或 StackReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）。
4. 选择与覆盖唇平行生长的催眠，避免倾斜。请务必选择通过极地延伸传播的催眠，避免催眠呈现横向和/或 apal 分支。
5. 使用 MTrackJ （插件|MTrackJ） 插件，以跟踪增长的连字符提示 （图4E）²⁷。要添加曲目，请选择工具栏中的 "添加" 按钮，然后使用鼠标的左单击将第一点放在连字符提示处。时间系列将自动移动到下一帧。要完成跟踪过程，请双击鼠标上的最终点（或按 Esc 键）（图 4F）。在初始时间范围内移动到另一个兴趣点（即增加连字符尖端），并通过测量另一个催眠的增长率重新启动程序。
   注:要安装 MTrackJ，请按照 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 上提供的说明进行安装
6. 单击 MTrackJ 对话 （图4G）中的测量按钮以打开输出表。保存轨道测量 （文件|保存为） 到所需的文件格式 （如 csv）， 分析和绘图他们 （图 4H）.
   注:通过选择 电影 按钮，制作一部电影，显示图像和跟踪进度。

结果

按照这个协议，我们捕获并分析了各种图像对应于不同生长/发育阶段的长丝真菌 A.尼杜兰。本研究中提供的数据是使用斐济软件进行处理和分析的。测量保存为 csv 文件，使用商业统计软件进行统计分析并准备为图形和/或 Python 编程语言使用软件库，如熊猫、笨重、统计模型、马图利布和海出生。更多详情可在引用的原始出版物中找到。

为了解释人口的反应，重要的?...

讨论

通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型是实时、定量和准确地评估细胞行为的有力方法，它能够确定特定的药物治疗和/或基因干预是否导致可检测到的细胞生长或表型差异。

在这项研究中，描述了一个可靠的活细胞成像方法来测量和定量分析真菌的发展，包括细菌管的动态和直肠尖生长在 A.尼杜兰。使用传输的光显微镜技术监测随着时间推移的形态变化，对于识别?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4