Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll mit Durchlichtmikroskopie-Techniken, um Bilder zu erfassen, die Wachstumskinetik des filamentösen Pilzes A. nidulans sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann in Verbindung mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

Zusammenfassung

Es ist gut bekannt, dass das Koloniewachstum von filamentösen Pilzen, das hauptsächlich von Veränderungen der hyphen/ myzelen apikalen Wachstumsrate abhängt, makroskopisch auf erstarrten Medien durch Vergleich der Koloniegröße geschätzt wird. Die Wachstumsrate genetisch unterschiedlicher Pilzstämme oder -stämme unter verschiedenen Umwelt-/Wachstumsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Antibiotika usw.) quantitativ zu messen, ist jedoch eine Herausforderung. Daher wird die Verfolgung komplementärer Ansätze zur Quantifizierung der Wachstumskinetik obligatorisch, um das Wachstum von Pilzzellen besser zu verstehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass filamentöse Pilze, einschließlich Aspergillus spp., unter Bedingungen unter der Luft auf festen Medien oder untergetauchten Kulturen unterschiedliche Wachstums- und Differenzierungsmodi aufweisen. Hier beschreiben wir eine quantitative mikroskopische Methode zur Analyse der Wachstumskinetik des Modellpilzes Aspergillus nidulansunter Verwendung von Live-Bildgebung sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien. Wir erfassen Bilder, analysieren und quantifizieren Wachstumsraten verschiedener Pilzstämme reproduzierbar und zuverlässig mit einer Open-Source-Software für Biobilder (z. B. Fidschi), und zwar auf eine Weise, die keine vorherige Bildanalyse-Expertise des Benutzers erfordert.

Einleitung

Fadenförmige Pilze sind von großer sozioökonomischer und ökologischer Bedeutung, da sie sowohl als industrielle/landwirtschaftliche Werkzeuge für die Enzym- und Antibiotikaproduktion^1,2 als auch als Krankheitserreger von Kulturpflanzen^3,Schädlingsinsekten⁴ und Menschen³von entscheidender Bedeutung sind. Darüber hinaus werden filamentöse Pilze wie Aspergillus nidulans häufig als Modellorganismen für die Grundlagenforschung verwendet, wie z.B. Studien in Genetik, Zell- und Evolutionsbiologie sowie für die Untersuchung der Hyphenverlängerung⁵. Filamentöse Pilze sind hochpolarisierte Organismen, die sich durch die kontinuierliche Versorgung mit Membranlipiden/Proteinen und die De-novo-Synthese der Zellwand an der ausdehnenden Spitze^{6 verlängern.} Eine zentrale Rolle beim Wachstum der Hyphenspitze und der Aufrechterhaltung der Polarität ist eine spezialisierte Struktur namens "Spitzenkorper" (SPK), eine hochgeordnete Struktur, die hauptsächlich aus zytoskelettalen Komponenten und der polarisierten Verteilung des Golgi^6,7,8besteht .

Umweltreize/-signale, wie Wasser-Luft-Grenzfläche, Licht, CO_{2-Konzentration} und der Ernährungszustand sind für die Entwicklungsentscheidungen dieser Schimmelpilze verantwortlich⁹. In untergetauchten (flüssigen) Kulturen wird die Differenzierung von A. nidulans unterdrückt und das Wachstum erfolgt durch Hyphenspitzendehnung⁶. Während des vegetativen Wachstums keimen asexuelle Sporen (Konidien) durch apikale Ausdehnung und bilden ein undifferenziertes Netzwerk von miteinander verbundenen Hyphenzellen, dem Myzel, das unbegrenzt weiter wachsen kann, solange Nährstoffe und Platz verfügbar sind. Zum anderen verlängern sich auf festen Medienhypenspitzen und nach einer definierten Periode vegetativen Wachstums (Entwicklungskompetenz) wird die asexuelle Fortpflanzung eingeleitet und luftbildende Konidiophorstiele erstrecken sich aus spezialisierten Fußzellen des Myzels⁶. Diese führen zu spezialisierten entwicklungsübergreifenden mehrzelligen Strukturen, den sogenannten Konidiophoren, die lange Ketten haploider Konidien¹⁰ produzieren, die das Wachstum unter günstigen Umweltbedingungen wieder aufnehmen können.

Eine weit verbreitete Methode zur Messung des filamentösen Pilzwachstums besteht darin, Sporen auf Nährstoffagar in einer Petrischale zu impfen und einige Tage später den Durchmesser der Kolonie makroskopisch zu messen¹¹. Der Durchmesser / die Fläche der Kolonie, die am meisten von Veränderungen der Myzelwachstumsrate und weniger von der Konidiophordichte¹²abhängt, wird dann als Wachstumswert verwendet. Obwohl die Messung der Pilzpopulation (Kolonie) auf festen Oberflächen durchaus ausreichend ist, ist sie keineswegs das genaueste Maß für das Wachstum. Im Vergleich zu Durchschnittswerten auf Populationsebene (Durchschnittswerte der Pilzkoloniegröße) können Einzelzellmessungen die Heterogenität einer Zellpopulation erfassen und die Identifizierung neuartiger Subpopulationen von Zellen,^{Zuständen 13,}Dynamik, Signalwegen sowie den biologischen Mechanismen ermöglichen, mit denen Zellen auf endogene und Umweltveränderungen reagieren^14,15. Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps durch Zeitraffermikroskopie ist wohl der am weitesten verbreitete quantitative Einzelzellbeobachtungsansatz.

Hierin beschreiben wir ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll unter Verwendung von Durchlichtmikroskopietechniken (wie Phasenkontrast, differentialer Interferenzkontrast (DIC) und polarisierter Mikroskopie) zur Aufnahme von Bildern, die unabhängig von der kombinierten Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse und Quantifizierung des polaren Wachstums von A. nidulans-Stämmen sowohl in untergetauchten Kulturen als auch in festen Medien verwendet werden können.

Protokoll

1. Inoculum-Zubereitung

HINWEIS: Alle Schritte sollten unter einem Laminar-Flow-Schrank ausgeführt werden.

1. Streifen Sie einen interessierenden Pilzstamm aus einem Glycerinvorrat (-80 °C) unter Verwendung einer sterilen Impfschleife auf Platten mit minimalen Medien (MM), die mit den entsprechenden Ernährungsanforderungen des untersuchten Stammes ergänzt werden [MM: 10,0 g/L Glukose, 20 ml/L Salzlösung (Salzlösung: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H2 O, 76 g/L KH_2PO4,2,0 mL/L Chloroform) und 1 ml/L Spurenelemente (Spurenelemente: 40 mg/L_Na2B4O₇· _H2O, 400 mg/L CuSO_4,8 g/L ZnSO_4,800 mg/L MnSO_4,800 mg/L FePO₄), pH mit 1 M NaOH auf 6,8 einstellen, 1 % (w/v) Agar und die erforderlichen Ergänzungen wie in¹⁶ und Autoklaven beschrieben hinzufügen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Salzlösung, Spurenelementlösung und Nahrungsergänzungsmittel werden autoklaviert.
2. 2-3 Tage bei 37 °C inkubieren.
3. Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher (oder eine Impfschleife), übertragen Sie eine kleine Anzahl von Konidien, indem Sie sanft eine einzelne Kolonie berühren, auf Platten mit vollständigen Medien (CM) [CM: 10,0 g / L Glukose, 2,0 g / L Pepton, 1,0 g / L Hefeextrakt, 1,0 g / L Casaminosäuren, 20 ml / L Salzlösung, 1 ml / L Spurenelemente, 5 ml / L Vitaminlösung (Vitaminlösung: 0,1 g/L Riboflavin, 0,1 g/L Nicotinamid, 0,01 g/L p-Aminobenzoesäure, 0,05 g/L Pyridoxin HCl, 1,0 mg/L Biotin), pH-Wert mit 1 M NaOH auf 6,8 einstellen, 1 % (w/v) Agar und die erforderlichen Ergänzungen wie in¹⁶ und Autoklaven beschrieben hinzufügen. Autoklaven und lagern Sie die Vitaminlösung in einer dunklen Flasche bei 4 °C.
   HINWEIS: Falls das Pilzwachstum zu dicht ist, um einzelne Kolonien zu identifizieren und zu isolieren, streifen Sie erneut auf eine neue Agarplatte, um einzelne Kolonien zu erhalten.
4. 3-4 Tage bei 37 °C inkubieren.
5. Erhalten Sie eine konidiale Suspension von ca. 2 x 10⁶ Zellen/ml, indem Sie 1 cm von der Oberfläche einer konidiierten Pilzkolonie, die auf CM-Agarplatten gezüchtet wurde, mit einem sterilen Zahnstocher kratzen (Abbildung S1).
   HINWEIS: Wenn nötig, zählen Sie Konidien mit einem Hämozytometer.
6. Erntekonidien von A. nidulans in einem sterilen 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 1,0 ml autoklaviertem destilliertem Wasser mit 0,05% (v/v) Tween 80 zur Verringerung der Anzahl der Konidienklumpen.
   HINWEIS: Conidia kann bis zu 2-3 Wochen bei 4 °C ohne relevanten Verlust der Lebensfähigkeit gelagert werden (A. Athanasopoulos und V. Sophianopoulou, unveröffentlichte Daten). Es wird jedoch empfohlen, konidiale Suspension zu filtern und / oder zu waschen, um Myzelteile und Nährstoffe zu entfernen, um Konidialschwellungen zu verhindern.

2. Vorbereitung für die Bildgebung von filamentösen Pilzen, die auf Agar (festen) Medien wachsen

HINWEIS: Es wird eine modifizierte Version der 'invertierten Agarmethode^17,18 verwendet.

1. Zunächst werden 10 μL Aliquoten von kräftig vortexierten Konidialen (ca. 2 x 10⁴ Zellen/ml) an mehreren Stellen auf Petrischalen (Ø9 cm) 15 ml MM mit 1% (w/v) Agar(Abbildung 2)gefleckt.
   HINWEIS: Mit der modifizierten Version der "invertierten Agarmethode" ist es möglich, Pilzproben für viele Stunden ohne offensichtliche schädliche Auswirkungen auf wachsende Hyphen abzubilden.
2. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll.
3. Schneiden Sie einen ≈0,8 mm^2-Agarblock, der die Kolonie enthält, mit einem sterilen Skalpell heraus.
   HINWEIS: Die Abmessungen des auszuschneidenden Agarblocks hängen von den Abmessungen der anschließend zu platzenden Ausrüstung ab. In der vorliegenden Arbeit werden 8 μ-Folien verwendet (siehe unten).
4. Invertieren und legen Sie den Agarblock in einen Brunnen eines μ-Slide oder eines ähnlichen 8-Kammer-Deckglases mit Deckglas, das für Live-Imaging geeignet ist.
   HINWEIS: Falls die Durchlichtmikroskopie in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie (Markierung) verwendet wird, kann der Agarblock kurz vor der Bildgebung auf einen Tropfen flüssigen Mediums invertiert werden, der den lebenden Zellfärbungsfarbstoff enthält.

3. Vorbereitung für die Bildgebung von filamentösen Pilzen, die auf flüssigem Medium wachsen

1. 10 μL Aliquoten einer kräftig vortexierten konidialen Suspension (ca. 2 x 10⁴ Zellen/ml) in die Vertiefungen eines 8-Well-μ-Slides mit 200 μL (flüssigem) MM mit den entsprechenden Ergänzungen (siehe oben) übertragen.
2. Inkubieren Sie für die gewünschte Zeit bei der gewünschten Temperatur (Abbildung 3).
   HINWEIS: Wird die Durchlichtmikroskopie in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie (Markierungsmikroskopie) eingesetzt, haben flüssige Kulturen den großen Vorteil, dass fluoreszierende Farbstoffe zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Experiments zugegeben werden können¹⁹.

4. Bilder aufnehmen

HINWEIS: Die Wahl des Mikroskops hängt von der verfügbaren Ausrüstung ab. In jedem Fall sollte der Mikroskopaufbau eine umgekehrte Stufe, eine Umweltkammer oder zumindest einen Raum mit präziser Lufttemperaturregelung umfassen.

1. Die thermostatisierte Mikroskopkammer bei 37 °C vorheizen (sofern nicht anders angegeben oder für die verwendeten Pilzarten geeignet), um die Temperatur vor dem Start zu stabilisieren. Diese Kammer ermöglicht die Temperaturmodulation der Mikroskopoptik und des Probentisches während Zeitrafferexperimenten. Beachten Sie, dass optische Aberrationen²⁰ eingeführt werden, wenn normale Tauchöle (ausgelegt für den Einsatz bei 23 °C) Öle bei 37 °C oder höher verwendet werden.
   HINWEIS: Bei knappem Budget können Inkubationskammern aus Karton und isolierendem Verpackungsmaterial²¹ oder mit einem 3D-Drucker²²hergestellt werden.
2. Schalten Sie das Mikroskop, die Scannerleistung, die Laserleistung und den Computer ein und laden Sie die Bildgebungssoftware. Legen Sie den μ-Objektträger (zuvor vorbereitet) in den Mikroskopstand und fokussieren Sie.
3. Finden Sie Sichtfelder, die isolierte/nicht überlappende Zellen (oder zumindest nicht überfüllt) enthalten, um Wachstumsmessungen während der Bildanalyse zu erleichtern. Erfassen Sie mindestens 50 wachsende Zellen pro Probe, um eine robuste statistische Analyse zu ermöglichen.
4. Wählen Sie den gewünschten Durchlichtmikroskopie-Ansatz. Reduzieren Sie die Belichtungszeit oder Laserleistung und Pixelverweilzeit und/oder erhöhen Sie lochartige Durchmesser, um das Photobleachen von Pilzzellen zu minimieren, wie an anderer Stelle beschrieben ^23,24.
5. Stellen Sie das Mikroskop ein, um Bilder in den gewünschten Zeitintervallen zu erfassen, und starten Sie die Zeitreihenerfassung.
   HINWEIS: Um die Fokaldrift im Laufe der Zeit (insbesondere bei langen Experimenten) aufgrund von thermischer Drift, unterschiedlichen Zellgrößen und Zellbewegungen zu korrigieren, verwenden Sie eine Autofokusstrategie, sofern in Ihrer Mikroskopsoftware verfügbar.

5. Bildanalyse

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Schritte der Verarbeitung von Zeitraffermikroskopiebildern zur Messung der Wachstumsrate von A. nidulansbeschrieben. Das Öffnen, Visualisieren und Verarbeiten von Bildern erfolgt mit der Open Source ImageJ/Fiji Software^25.

1. Importieren Sie die Bilder mit Plugins | nach Fidschi Bio-Formate | Bio-Formats Importer aus dem Fidschi-Menü mit Standardeinstellungen (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Überprüfen Sie, ob der Bio-Formats Importer die Bildkalibrierung richtig erkennt. Die im bildfenster des oberen Informationsfelds angezeigte Bildgröße muss den ursprünglichen Bildabmessungen entsprechen (Abbildung 4B). Drücken Sie Umschalt + P, um die Bildeigenschaften in der ImageJ/Fiji-Software anzuzeigen und zu ändern.
2. Verwenden Sie bei Bedarf ein Histogramm mit²⁶ für die Beleuchtungskorrektur zwischen verschiedenen Frames (Image | | anpassen Bleichmittelkorrektur | Histogramm-Matching) (Abbildung 4C).
3. Verwenden Sie bei Bedarf den SIFT-Algorithmus (Plugins | | Linear Stack Alignment mit SIFT) zum Ausrichten oder Abgleichen von Bildstapeln (Abbildung 4D). Die Auswahl von "Übersetzung" aus dem erwarteten Transformationsmenü sollte ausreichen, um eine x-y-Drift zu korrigieren.
   HINWEIS: Andere Plugins können auch verwendet werden, um einen Stapel von Bildscheiben auszurichten, z. B. Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) oder StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. Wählen Sie Hyphen aus, die parallel zu Coverslip wachsen, und vermeiden Sie diejenigen, die geneigt sind. Achten Sie darauf, Hyphen auszuwählen, die sich durch polare Ausdehnung ausbreiten, und vermeiden Sie Hyphen, die seitliche und / oder apikale Verzweigung darstellen.
5. Verwenden Sie MTrackJ (Plugins | MTrackJ) Plugin zur Verfolgung wachsender Hyphenspitzen (Abbildung 4E)²⁷. Um einen Track hinzuzufügen, wählen Sie die Schaltfläche Hinzufügen in der Symbolleiste und platzieren Sie den ersten Punkt mit dem linken Mausklick auf einer Hyphenspitze. Die Zeitreihe wird automatisch zum nächsten Frame verschoben. Um den Tracking-Vorgang abzuschließen, doppelklicken Sie mit der Maus auf den letzten Punkt (oder drücken Sie die Esc-Taste) (Abbildung 4F). Bewegen Sie sich im anfänglichen Zeitrahmen zu einem anderen Punkt von Interesse (z. B. wachsende Hyphenspitze) und starten Sie den Vorgang neu, indem Sie die Wachstumsrate einer anderen Hyphen messen.
   HINWEIS: Um MTrackJ zu installieren, folgen Sie den Anweisungen unter https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. Klicken Sie im Dialogfeld MTrackJ auf die Schaltfläche Messen (Abbildung 4G), um die Ausgabetabelle zu öffnen. Gleismessungen speichern( Datei | Speichern unter) im gewünschten Dateiformat (z.B. csv), analysieren und plotten (Abbildung 4H).
   HINWEIS: Durch Auswahl der Schaltfläche Film wird ein Film produziert, der das Bild und den Verlauf zeigt.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll haben wir verschiedene Bilder aufgenommen und analysiert, die verschiedenen Wachstums- / Entwicklungsstadien des fadenförmigen Pilzes A. nidulansentsprechen. Die in dieser Studie vorgestellten Daten wurden mit der Fidschi-Software verarbeitet und analysiert. Die Messungen wurden als CSV-Dateien gespeichert, statistisch analysiert und als Diagramme mit kommerzieller Statistiksoftware und / oder Python-Programmiersprache unter Verwendung von Softwarebibliotheken wie Pandas, Numpy, Statsmodel...

Diskussion

Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps mittels Zeitraffermikroskopie ist ein leistungsfähiger Ansatz, um das zelluläre Verhalten in Echtzeit zu beurteilen und quantitativ und genau zu bestimmen, ob eine bestimmte medikamentöse Behandlung und / oder genetische Intervention zu nachweisbarem Zellwachstum oder phänotypischen Unterschieden im Laufe der Zeit führt.

In dieser Studie wurde eine zuverlässige Methode der Lebendzellbildgebung beschrieben, um die Pilzentwicklung z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4